黃芩提取物對(duì)肺結(jié)核大鼠免疫功能的調(diào)控作用

孔金玲 黃銀秋 王笑 張慧群

(1長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院感染科，湖南 長(zhǎng)沙 410005；2重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心)

肺結(jié)核是肺部受到結(jié)核分枝桿菌感染造成的具有傳染性的呼吸系統(tǒng)疾病，病灶主要常見(jiàn)于支氣管、氣管、肺組織、胸膜部位〔1〕。結(jié)核分枝桿菌屬于胞內(nèi)寄生菌中的一類(lèi)，主要存在于巨噬細(xì)胞內(nèi)，表現(xiàn)于肺泡中，會(huì)導(dǎo)致肺部出現(xiàn)病變，若未及時(shí)治愈，可能會(huì)導(dǎo)致肺部癌變，造成不可挽回的后果〔2〕。一旦人體免疫力大幅度降低時(shí)，病菌則會(huì)向機(jī)體各器官侵襲，入侵肺部時(shí)，就會(huì)引起肺部結(jié)核感染，會(huì)表現(xiàn)出咳嗽、發(fā)熱等癥狀〔3〕。據(jù)不完全資料統(tǒng)計(jì)，如今肺結(jié)核的死亡率僅次于免疫缺陷病毒性疾病，具有起病急、治療困難、延遲時(shí)間長(zhǎng)、復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)〔4，5〕。本文探究黃芩提取物對(duì)肺結(jié)核模型大鼠免疫功能的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與試劑 45只SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，購(gòu)自河南環(huán)宇康禾生物科技有限公司，動(dòng)物許可證：SCXK(豫)2020-0004。6～9月齡，平均(7.13±1.42)月齡，體重245～310 g，平均(263.63±30.87)g，光照12 h/d，在濕度27%～36%、溫度(29.93±4.27)℃的環(huán)境中喂養(yǎng)1 w。主要試劑：黃芩提取物(南京道斯夫生物科技有限公司，貨號(hào)：dasf1545)，CD4+/CD8+、CD4+、CD8+(上海然哲儀器設(shè)備有限公司，貨號(hào)：NovoCyt)，糖類(lèi)抗原(CA)125、白細(xì)胞介素(IL)-10、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒均購(gòu)自上海梵態(tài)生物科技有限公司，干擾素(IFN)-γ ELISA試劑盒購(gòu)自上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β ELISA試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司，IL-6及TNF-α ELISA試劑盒均購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，轉(zhuǎn)錄因子(TCF)抗體(武漢菲恩生物科技有限公司，貨號(hào):FNAB08552)，糖原合成酶激酶(GSK)-3β抗體(武漢益普生物科技有限公司，貨號(hào)：ATA30403)，β-catenin抗體(深圳欣博盛生物科技有限公司，貨號(hào)：ATA40133)。

1.2方法

1.2.1分組及建模 將45只SPF級(jí)SD大鼠分為正常組、模型組、低劑量組、中低劑量組、高劑量組各9只，其中正常組不進(jìn)行處理，剩余4組參照王青樂(lè)等〔6〕研究構(gòu)建肺結(jié)核模型：使用標(biāo)準(zhǔn)人型結(jié)核菌株H37Rv在ABSL-3級(jí)實(shí)驗(yàn)室使用滴鼻法進(jìn)行感染處理，菌液濃度為1×107CFU/ml，各組大鼠均滴鼻20 μl,建立肺結(jié)核大鼠模型。

1.2.2給藥 建模成功后正常組、模型組均給予3 ml生理鹽水，低劑量組給予1.5 g/kg黃芩提取物，中劑量組給予3.0 g/kg黃芩提取物，高劑量組給予6.0 g/kg黃芩提取物，1次/d，均連續(xù)灌胃2 w后觀察大鼠變化。

1.2.3病理組織學(xué)觀察 將大鼠全麻后行斷頭法處死，在低溫、無(wú)菌條件下取大鼠肺組織，將肺組織用4%多聚甲醛中浸泡、固定，室溫下用15%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣、脫水后用石蠟進(jìn)行包埋，作3 μm切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色處理，使用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠脊髓病理變化。

1.2.4CD4+/CD8+、CD4+、CD8+水平檢測(cè) 取大鼠尾靜脈血2 ml，使用肝素鈉行抗凝處理，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，將EDTA抗凝外周靜脈血100 μl加入4個(gè)試管中,1個(gè)試管加入CD和CDg雙標(biāo)記單克隆抗體20 μl,另3個(gè)試管分別加入CD4+/CD8+、CD4+、CD8+單克隆抗體20 μl,充分混勻,孵育26℃ 15 min后,加入600 ml紅細(xì)胞溶解液溶解10 min,以1 200 r/min，離心5 min除去上清,將細(xì)胞懸浮在500 μl的磷酸鹽緩沖液(PBS)中進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。

1.2.5胸腺指數(shù) 采用胸腺指數(shù)測(cè)定，將大鼠胸腺完全剝離，采用電子天平檢測(cè)重量，計(jì)算胸腺指數(shù)，胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量/體重。

1.2.6CA125、IFN-γ、TGF-β、IL-6、TNF-α、IL-10水平檢測(cè) 取右肺組織，用PBS沖洗3次，加入細(xì)胞裂解液在混勻機(jī)下冰浴破碎，于12 000 r/min離心機(jī)中4℃離心15 min，收集上清液于-80℃儲(chǔ)存，沸水煮5 min，室內(nèi)4℃保存。采用ELISA檢測(cè)，取50 mmol/L碳酸鹽包緩沖液稀釋抗原加入聚苯乙烯反應(yīng)孔，加蓋處理。4℃環(huán)境內(nèi)靜置24 h，次日取出洗滌3次拋干，添加對(duì)照標(biāo)本、0.1 ml待檢標(biāo)本，42℃條件下放置1 h，洗滌拋干，在每孔中加入低物液均勻，加入0.1 ml鄰苯二胺遮光處理20 min，加入1 ml H2SO4，終止反應(yīng)，經(jīng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算CA125、IFN-γ、TGF-β、IL-6、TNF-α、IL-10水平。

1.2.7Western印跡檢測(cè)TCF、GSK-3β、β-catenin蛋白 取所有大鼠肺組織蛋白，提取50μg蛋白，加入蛋白緩沖液內(nèi)，提取常規(guī)蛋白并使用二喹啉甲酸(BCA)法對(duì)其進(jìn)行定量分析。凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，取膜，4 ℃下固定、封閉處理1 h，TCF、GSK-3β、β-catenin和內(nèi)參β-actin蛋白在室內(nèi)封閉90 min,按1∶1 000加入TCF抗體、GSK-3β抗體、β-catenin抗體、β-actin抗體，以1∶2 000加入c-fos抗體,4℃孵育過(guò)夜保存，之后使用0.05%～0.10% TBST洗膜，3次，5 min/次，二抗被0.05%～0.1% TBST稀釋(1∶10 000)，搖動(dòng)孵育時(shí)間為 1 h，TBST連續(xù)洗膜3次，5 min/次。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，定量分析蛋白表達(dá)情況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行F檢驗(yàn)、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1病理組織學(xué)觀察 正常組HE染色未發(fā)現(xiàn)病變。模型組實(shí)變內(nèi)肉芽腫樣病變形成，鏡下見(jiàn)多核巨細(xì)胞多發(fā)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，低劑量組伴大量泡沫細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)；多核巨細(xì)胞、類(lèi)上皮細(xì)胞上升，有結(jié)核小結(jié)形成，中劑量組在實(shí)變組織內(nèi)見(jiàn)散在類(lèi)上皮細(xì)胞形成，多核巨細(xì)胞較少，并有結(jié)核小結(jié)形成趨勢(shì)，高劑量組可見(jiàn)肺泡間隔增寬，少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞散在分布。見(jiàn)圖1。

圖1 各組肺組織病理觀察(HE染色，×400)

2.2各組CD4+/CD8+、CD4+、CD8+、胸腺指數(shù)水平比較 模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組CD4+/CD8+、CD4+、胸腺指數(shù)水平明顯低于正常組，CD8+水平明顯高于正常組(P<0.05)；低劑量組、中劑量組、高劑量組CD4+/CD8+、CD4+、胸腺指數(shù)水平明顯高于模型組，CD8+水平明顯低于模型組(P<0.05)；中劑量組、高劑量組CD4+/CD8+、CD4+、胸腺指數(shù)水平明顯高于低劑量組，CD8+水平明顯低于低劑量組(P<0.05)；中劑量組CD4+/CD8+、CD4+、胸腺指數(shù)水平明顯低于高劑量組，CD8+水平明顯高于高劑量組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3各組CA125、IFN-γ、TGF-β水平比較 模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組CA125、IFN-γ、TGF-β水平明顯高于正常組(P<0.05)；低劑量組、中劑量組、高劑量組CA125、IFN-γ、TGF-β水平明顯低于模型組(P<0.05)；中劑量組、高劑量組CA125、IFN-γ、TGF-β水平明顯低于低劑量組(P<0.05)；中劑量組CA125、IFN-γ、TGF-β水平明顯高于高劑量組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組CD4+/CD8+、CD4+、CD8+、胸腺指數(shù)、CA125、IFN-γ、TGF-β水平比較

2.4各組肺組織IL-6、TNF-α、IL-10水平比較 相比于正常組，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組IL-6、TNF-α水平明顯升高，IL-10水平明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組IL-6、TNF-α水平明顯降低，IL-10水平明顯升高(P<0.05)；與低劑量組相比，中劑量組、高劑量組IL-6、TNF-α水平明顯降低，IL-10水平明顯升高(P<0.05)；與高劑量相比，中劑量組IL-6、TNF-α水平明顯升高，IL-10水平明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.5各組Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白基因表達(dá)比較 模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組TCF、GSK-3β、β-catenin蛋白表達(dá)均明顯高于正常組(均P<0.05)；低劑量組、中劑量組、高劑量組TCF、GSK-3β、β-catenin蛋白表達(dá)均明顯降低于模型組(均P<0.05)；中劑量組、高劑量組TCF、GSK-3β、β-catenin蛋白表達(dá)均明顯低于低劑量組(均P<0.05)；中劑量組TCF、GSK-3β、β-catenin蛋白表達(dá)均明顯高于高劑量組(均P<0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

表2 各組肺組織IL-6、TNF-α、IL-10水平及Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白基因表達(dá)量比較

1～5:正常組，模型組，低劑量組，中劑量組，高劑量組圖2 Western印跡檢測(cè)各組細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白

3 討 論

結(jié)核病嚴(yán)重的會(huì)引起全身器官的病變，其中肺結(jié)核是結(jié)核病中發(fā)病率最高的一種，該病感染率、耐藥率、死亡率均極高，一旦發(fā)病，將對(duì)患者的生命健康會(huì)造成及極嚴(yán)重的影響〔7,8〕。本研究提示，肺結(jié)核的發(fā)病與免疫體功能之間存在著一定的關(guān)系，機(jī)體免疫功能的降低會(huì)導(dǎo)致該病的發(fā)生及發(fā)展，同時(shí)，通過(guò)提升患者免疫功能也能較好地改善及抑制病情。

黃芩中提取的成分有漢黃芩苷、黃芩苷、黃芩新素、黃芩素、漢黃芩素等，其中黃芩苷的含量較高并作為藥典中黃芩質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)指標(biāo)。黃芩具有清熱燥濕，瀉火清心、涼血活血的功效，對(duì)人體有抗菌、抗病毒、清熱燥濕的功效?？共《尽⒖咕狐S芩對(duì)革蘭陰性菌、致病性皮膚真菌、革蘭陽(yáng)性菌有抑制作用。而且黃芩還能抑制乙型肝炎病毒、流感病毒等；清熱燥濕：可用于濕溫發(fā)熱、濕熱瀉痢、濕熱、胸悶、口渴不欲飲等病癥〔9〕?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，黃芩有解熱作用，在抗菌、抗感染、抗病毒等藥理過(guò)程中均有體現(xiàn)。本文研究說(shuō)明，高劑量岑提取物可有效改善肺結(jié)核模型大鼠免疫功能，抑制通路因子的異常表達(dá)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)，效果顯著。

CD4+屬于T細(xì)胞亞群，表達(dá)于T細(xì)胞受體中，一定程度上能夠反映出機(jī)體的免疫功能，參與肺結(jié)核的發(fā)病〔10〕。同時(shí)CD4+還能夠起到激活CD8+的作用，對(duì)于細(xì)菌的侵襲感染均具有較好的抵抗效果，提升患者的免疫功能，且一定程度上還能消滅肺結(jié)核致病菌〔11〕。CD8+T細(xì)胞在被CD4+激活后，會(huì)參與機(jī)體的免疫系統(tǒng)中，參與抗結(jié)核病的保護(hù)機(jī)制中，能夠有效抑制細(xì)菌的增殖〔12,13〕。本研究說(shuō)明高劑量芩提取物對(duì)肺結(jié)核模型大鼠CD4+/CD8+、CD4+、CD8+水平有一定的調(diào)控作用，效果顯著。

CA125是一種高分子量糖蛋白,其在機(jī)體眾多細(xì)菌性疾病及免疫性疾病中均呈現(xiàn)異常表達(dá)〔14，15〕。IFN-γ在機(jī)體眾免疫系統(tǒng)中均存在一定的調(diào)節(jié)作用，能夠增強(qiáng)細(xì)胞的免疫功能〔16,17〕。TGF-β是重要的致肺纖維化細(xì)胞因子，活化TGF-β因子在肺纖維化細(xì)胞間質(zhì)膠原的合成和分解、增殖和分裂中發(fā)揮重要作用〔18〕。IL-6可誘導(dǎo)B細(xì)胞分化和抗體產(chǎn)生，在機(jī)體免疫應(yīng)答中起到一定作用〔19〕。TNF-α是巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的急性炎癥細(xì)胞因子〔20〕。IL-10由B細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生，屬于抑制炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子，在慢性病程中可以抑制細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答〔21〕。本文結(jié)果說(shuō)明高劑量岑提取物可有效抑制肺結(jié)核模型大鼠CA125、IFN-γ、TGF-β、IL-6、TNF-α、IL-10水平，可有效降低炎癥反應(yīng)，抑炎因子產(chǎn)生，效果顯著。Wnt通過(guò)自分泌發(fā)揮作用，是分泌型糖蛋白。Wnt信號(hào)通路在多種細(xì)胞增殖再生、分化、遷移中起著重要的調(diào)節(jié)作用。研究顯示，Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與了肺癌和纖維化的發(fā)生發(fā)展，在肺泡巨噬細(xì)胞抗感染中發(fā)揮免疫調(diào)控作用，其長(zhǎng)鏈非編碼RNA是轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度>200 nt的RNA分子，不能直接編碼蛋白質(zhì)，但能抑制染色質(zhì)重塑、參與轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達(dá)〔22〕。本研究顯示，高劑量黃芩提取物可有效抑制肺結(jié)核模型大鼠Wnt/β-catenin信信號(hào)通路蛋白基因表達(dá)量，從而控制其大鼠病情發(fā)展。

綜上，黃芩提取物通過(guò)作用于Wnt/β-catenin信號(hào)通路，調(diào)控TCF、GSK-3β、β-catenin蛋白表達(dá)，可有效改善免疫功能的異常表達(dá)及炎癥反應(yīng)。