補(bǔ)腎降糖方對(duì)糖尿病腎病小鼠腎臟功能及腎小管上皮細(xì)胞自噬的影響

尹建平 龐欣欣 (河南省中醫(yī)院腎病科,河南 鄭州 450002)

糖尿病腎病(DN)為糖尿病常見(jiàn)微血管并發(fā)癥，DN的發(fā)病機(jī)制尚無(wú)統(tǒng)一結(jié)論，通常認(rèn)為與遺傳、糖代謝紊亂、缺氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激等多種因素關(guān)系密切〔1,2〕。研究顯示，20%～40% 糖尿病患者出現(xiàn)DN，DN可導(dǎo)致終末期腎衰竭的發(fā)生，是糖尿病患者致死、致殘的重要因素，嚴(yán)重威脅患者的生命安全。目前DN的治療主要通過(guò)控制患者血糖及血壓水平、抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)，從而降低阻滯蛋白尿及DN的發(fā)展進(jìn)程，但對(duì)改善腎功能損傷作用有限〔3〕。因此，尋求有效DN治療手段及治療藥物成為相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。自噬是通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)受損蛋白質(zhì)及細(xì)胞器，避免發(fā)生細(xì)胞凋亡和壞死的高度保守的自身保護(hù)機(jī)制，自噬對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有重要意義。研究顯示，在機(jī)體正常狀態(tài)下腎臟腎小球足細(xì)胞及近端腎小管上皮細(xì)胞均處于較好的自噬水平，有效清除細(xì)胞內(nèi)受損蛋白質(zhì)及細(xì)胞器，機(jī)體的高糖狀態(tài)可引起自噬功能抑制，導(dǎo)致腎臟內(nèi)環(huán)境紊亂，最終誘發(fā)腎功能異?！?,5〕。

中醫(yī)藥在多種疾病的治療中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，臨床研究顯示中藥可有效改善DN患者臨床癥狀，降低DN損傷，提高患者預(yù)后。傳統(tǒng)中醫(yī)理論并無(wú)關(guān)于DN的表述，依據(jù)其臨床特點(diǎn)DN屬“消渴”“水腫”“癃閉”范疇，肝腎之陰暗耗，瘀血壅阻經(jīng)隧，絡(luò)脈不利，瘀阻水停，治療應(yīng)以“補(bǔ)陰”“活血”立論〔6〕。補(bǔ)腎降糖方(BSJT)是由生黃芪、澤瀉、白術(shù)、麥冬、黃柏、葛根、陳皮等組方，具有清熱燥濕、補(bǔ)脾滋腎、利尿滲濕等功效。本研究以高糖高脂飼養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)制備DN模型大鼠，觀察補(bǔ)腎降糖方對(duì)DN模型大鼠腎臟功能及腎小管上皮細(xì)胞自噬的影響，探討B(tài)SJT治療DN的療效及可能存在的作用機(jī)制。

1 材料與設(shè)備

1.1試驗(yàn)動(dòng)物 PF級(jí)雄性SD大鼠60只，體重(150±15)g，由鄭州市華興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供，合格證號(hào)：SCXK(豫)2021-0013，所有動(dòng)物飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物室，(23±2)℃，濕度(55±15)%，12 h晝夜光照循環(huán)。

1.2試驗(yàn)藥物 補(bǔ)腎降糖方基本方：生黃芪12 g、澤瀉10 g、白術(shù)10 g、黃芪12 g、當(dāng)歸8 g、麥冬6 g、黃柏4 g、葛根4 g、陳皮4 g，加水1 L熱回流提取1 h，提取2次，合并濾液，濃縮至50 ml(1.4 g生藥材/ml)。

1.3試劑及設(shè)備 STZ(Sigma)；蘇木素(Sigma)；兔抗人微管相關(guān)蛋白1輕鏈(LC)3-Ⅱ單克隆抗體，兔抗人促凋亡蛋白Nix單克隆抗體，兔抗人 β-肌動(dòng)蛋白(actin)單克隆抗體，兔抗大鼠磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)多克隆抗體(CST)；兔抗大鼠mTOR多克隆抗體(Proteintech)；兔抗大鼠蛋白激酶B(AKT)多克隆抗體和兔抗大鼠 p-AKT(Thr308)多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔 IgG(武漢普美克生物技術(shù)有限公司)；高糖高脂飼料(南京市青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)加工)；Anke TDL-40B 型低速大容量多管離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；ABI7500型基因擴(kuò)增儀(美國(guó) ABI)；Mini Protean 3 Cell 型垂直電泳儀及顯影設(shè)備(美國(guó)Bio-Rad公司)；奧林巴斯BX53型生物顯微鏡；7150自動(dòng)生化分析儀(日立)；熒光定量PCR(美國(guó)ABI)；H-60透射電鏡(日立)。

1.4造模、分組及給藥 各組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，高糖高脂飼料喂養(yǎng)2 w，尾靜脈一次性注射STZ(溶于pH4.5，0.01 mol/L無(wú)菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液) 55 mg/kg，注射4 w后測(cè)定血糖及尿蛋白含量，以血糖≥16.7 mmol/L、尿蛋白含量≥20 mg/24 h為造模成功；對(duì)照組注射同等劑量無(wú)菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組，BSJT低、中、高劑量組〔2.8、5.2、7.0 g/(kg·d)〕及陽(yáng)性對(duì)照組〔厄貝沙坦60 mg/(kg·d)〕，每組10只，按照給藥劑量分別灌胃BSJT及厄貝沙坦，對(duì)照組及模型組灌胃同等劑量生理鹽水，連續(xù)灌胃8 w。

1.5組織取材 末次給藥后代謝籠收集 24 h 尿液并記錄尿量(期間禁食不禁水)，1 400 r/min離心5 min，收集上清；10%水合氯醛麻醉，頸椎離斷處死大鼠，腹主動(dòng)脈取血，4℃ 3 000 r/min離心15 min收集上清；開(kāi)腹分離腎臟，冰臺(tái)除被膜，左腎4%多聚甲醛固定，保存于10%中性甲醛中；右腎切塊，保存于-80℃冰箱中，采用Western印跡和qRT-PCR分析。

1.6血、尿生化指標(biāo)檢測(cè) 全自動(dòng)生化儀測(cè)定血清空腹血糖(FBG)、血漿白蛋白(ALB)、三酰甘油(TG)、膽固醇(CHO)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平；雙縮脲法檢測(cè)24 h尿總蛋白定量(U-Pro)。

1.7腎組織形態(tài)學(xué)觀察 4%中性甲醛固定腎組織，經(jīng)包埋，固定，切片，脫蠟，梯度乙醇洗脫，蘇木精液染色，2%伊紅染色液浸泡，梯度酒精脫水，中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化。

1.8透射電鏡觀察自噬小體 4%中性甲醛固定腎組織，常規(guī)丙酮脫水、包埋，超薄切片，3%醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙染色，將制備好的樣品用 JEM-1010 透射電鏡觀察自噬體。

1.9Western印跡法 取-80℃保存腎臟組織，解凍，加入蛋白裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)勻漿，提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉過(guò)夜，TBST洗膜加入LC3-Ⅱ，p62，Nix、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR抗體4℃孵育，加Ⅱ抗室溫孵育1 h，洗滌、顯影，以β-actin作為內(nèi)參，Image Lab 圖像分析軟件進(jìn)行定量分析，檢測(cè)大鼠腎組織LC3-Ⅱ、p62、Nix 蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，采用GraphPad Prism6.01軟件作圖。

2 結(jié) 果

2.1各組血、尿生化指標(biāo)比較 模型組FBG、TG、CHO、Scr、BUN、24 h U-Pro水平顯著高于對(duì)照組，ALB水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；與模型組比較，BSJT中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組FBG、TG、CHO、Scr、BUN、24 h U-Pro水平顯著降低，ALB水平顯著升高(P<0.05)；BSJT高劑量組血、尿生化指標(biāo)顯著優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)，BSJT中劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組血、尿生化指標(biāo)比較

2.2各組腎臟組織病理變化 HE 染色結(jié)果顯示，對(duì)照組腎小管結(jié)構(gòu)清晰，上皮細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常，管腔規(guī)則，大小均一，無(wú)明顯萎縮、擴(kuò)張或蛋白管型，間質(zhì)內(nèi)血管豐富，未見(jiàn)纖維組織增生及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組可見(jiàn)部分腎小管上皮細(xì)胞排列紊亂，腎小管腔內(nèi)可見(jiàn)脫落細(xì)胞碎片，部分腎小管空泡樣變性，胞質(zhì)染色不均，部分腎小管輕度萎縮或管腔擴(kuò)張，間質(zhì)內(nèi)伴有纖維組織增生及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。BSJT低、中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組腎小管病變可見(jiàn)不同程度的減輕，見(jiàn)圖1。

圖1 各組腎臟組織病理學(xué)觀察(HE染色，×400)

2.3各組LC3-Ⅱ、p62、Nix水平比較 與對(duì)照組比較，模型組LC3-Ⅱ、Nix水平顯著降低，p62水平顯著升高(P<0.05)；BSJT中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組LC3-Ⅱ、Nix水平高于模型組，p62水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組LC3-Ⅱ、p62、Nix及AKT、mTOR相關(guān)蛋白表達(dá)比較

2.4AKT/mTOR信號(hào)通路激活情況 與對(duì)照組比較，模型組p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，BSJT中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組顯著低于模型組(P<0.05)，各組AKT及mTOR蛋白表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2、圖2。

1～6:對(duì)照組、模型組、BSJT低劑量組、BSJT中劑量組、BSJT高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組圖2 各組AKT/mTOR相關(guān)蛋白表達(dá)

2.5自噬體形態(tài)觀察 透射電鏡觀察結(jié)果顯示，對(duì)照組腎組織內(nèi)可見(jiàn)大量自噬體聚集，線粒體形態(tài)完整，細(xì)胞內(nèi)存在明顯細(xì)胞器降解；模型組腎組織內(nèi)僅觀察到少量自噬體及大量形態(tài)異常線粒體；BSJT低、中、高劑量組腎組織自噬體數(shù)量呈濃度依賴性增加趨勢(shì)，BSJT中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組腎組織內(nèi)雙層膜結(jié)構(gòu)明顯，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)明顯空泡，未見(jiàn)結(jié)構(gòu)完整細(xì)胞器，見(jiàn)圖3。

圖3 各組腎臟組織自噬體觀察(×40 000)

3 討 論

調(diào)查顯示我國(guó)糖尿病患病率達(dá)9.7%，據(jù)估計(jì)2045年我國(guó)罹患糖尿病人數(shù)將超過(guò)1.5億，其中20%～40%患者繼發(fā)DN，5%～10%糖尿病患者最終死于腎病，DN為重要的糖尿病致死因素〔7〕。目前對(duì)DN的發(fā)病機(jī)制仍未完全明確，普遍認(rèn)為遺傳、糖代謝紊亂、缺氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激等因素與DN的發(fā)生關(guān)系密切〔8〕。

自噬是一種在溶酶體參與下降解細(xì)胞內(nèi)老化、受損細(xì)胞器及蛋白質(zhì)的代謝過(guò)程，是細(xì)胞高度保守的自我保護(hù)機(jī)制，在細(xì)胞自我凈化、重構(gòu)、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等方面具有重要意義〔9〕。自噬調(diào)節(jié)在2型糖尿病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也起重要作用，自噬失衡可加重胰島素抵抗及胰島-β 細(xì)胞衰竭〔10〕。自噬作用對(duì)維持足細(xì)胞和近端小管細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和功能均具有重要作用，機(jī)體在高糖狀態(tài)下足細(xì)胞和近端小管細(xì)胞自噬水平降低，自噬體數(shù)量減少，腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)受損，出現(xiàn)腎功能異常及蛋白尿水平升高〔11〕。

標(biāo)記蛋白LC3是形成自噬體的重要成分，LC3蛋白分為L(zhǎng)C3-Ⅰ及LC3-Ⅱ兩種形式，LC3-Ⅰ位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，LC3-Ⅱ定位于自噬體膜可與溶酶體相融合，LC3-Ⅱ可作為機(jī)體自噬水平的生物標(biāo)志物，LC3-Ⅱ水平可直接反映自噬體數(shù)量〔12〕。p62蛋白在機(jī)體自噬過(guò)程中可被溶酶體清除，p62 蛋白水平可有效反映自噬體活性，當(dāng)機(jī)體自噬處于較高水平時(shí)p62蛋白水平顯著降低，因此 p62 蛋白也可以用來(lái)判斷自噬過(guò)程是否通暢。Nix為線粒體自噬所需結(jié)合蛋白，對(duì)線粒體自噬具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。線粒體自噬隨著Nix水平的增加而增強(qiáng)，Nix水平是反映線粒體自噬的重要指標(biāo)〔13,14〕。

AKT/mTOR信號(hào)通路及其下游蛋白對(duì)細(xì)胞增殖、分化、凋亡均具有重要調(diào)控作用，同時(shí)AKT/mTOR信號(hào)通路也是參與細(xì)胞自噬的主要信號(hào)通路之一，磷酸化AKT可激活mTORC1從而抑制細(xì)胞自噬，mTOR水平與自噬標(biāo)志蛋白LC3呈負(fù)相關(guān)〔15〕。

中醫(yī)學(xué)并無(wú) DN 之病名，DN 臨床特點(diǎn)與“消渴”“水腫”“癃閉”相近，表現(xiàn)出正虛邪實(shí)，寒熱錯(cuò)雜，虛實(shí)互見(jiàn)等特點(diǎn)〔16〕。在 DN初期陰虛為本以肝腎氣陰兩虛為主，治宜滋補(bǔ)肝腎，益氣養(yǎng)陰；病變中期脾腎氣陽(yáng)兩虛為主，治宜補(bǔ)益脾腎，利水消腫; 晚期陰陽(yáng)氣血俱虛，臟腑功能受損，水濕濁毒內(nèi)停，變證蜂起，治宜通陽(yáng)利水〔17〕。中藥及復(fù)方在多種慢性疾病的治療中均有顯著療效。補(bǔ)腎降糖方是由黃芪、葛根、澤瀉、白術(shù)、麥冬、黃柏、陳皮等組方，黃芪為君，補(bǔ)氣升陽(yáng)，生津養(yǎng)血，利水消腫，行滯通痹；葛根生津止渴、澤瀉利水滲濕，佐以白術(shù)、麥冬、黃柏、陳皮等養(yǎng)陰清熱、滌痰活血，諸藥合用具有清熱燥濕、補(bǔ)脾滋腎、利尿滲濕等功效〔18～20〕。

綜上，BSJT可有效改善模型大鼠血、尿生化指標(biāo)，降低模型大鼠腎臟組織損傷，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞自噬，其作用機(jī)制可能與調(diào)控AKT/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。