氯霉素氧化鋅乳膏微生物限度檢查方法驗證

孫乃霞，趙新霞

醫(yī)院制劑主要針對臨床有需求、不適合工廠批量生產(chǎn)的品種，它彌補市場供應(yīng)不足、保證臨床用藥，有不可取代的優(yōu)勢［1］。氯霉素氧化鋅乳膏的主要成分是氯霉素、氧化鋅等。制備方法為：將融化的羊毛脂（200 g）加入花生油（500 g）中，攪拌均勻并不斷加入氫氧化鈣飽和溶液（485 mL），完全乳化后加入氧化鋅細(xì)粉（300 g）、氯霉素（15 g），混勻。本制劑為油包水型外用制劑，臨床用于治療濕疹、皮炎、局部潰瘍、黃水瘡等皮膚病，療效顯著［2］。但本制劑有效期短，生產(chǎn)和儲存過程更容易受到微生物的污染。所以微生物限度檢查是控制其質(zhì)量的一個重要項目［3-4］。本研究通過測定各試驗菌回收率、控制菌適用性試驗確立了氯霉素氧化鋅乳膏的微生物限度檢驗方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 氯霉素氧化鋅乳膏（濮陽市人民醫(yī)院，規(guī)格20 g，批次20210508、20210531、20210623、20210714、20210729、20210815）。

1.1.2 儀器 VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)（法國梅里埃公司）；生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，BSC-1300II A2型）；立式滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，YXQ-LS-50SII型）；無菌均質(zhì)器（寧波新芝生物科技股份有限公司，SCIENTZ-11L型）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（揚州慧科電子有限公司，GHP-9162型）；生化培養(yǎng)箱（揚州慧科電子有限公司，SPX-150型），電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海有限公司），ML204T/02型］。

1.1.3 培養(yǎng)基 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）（批次200518）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）（批次200823）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）（批次210115）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB）（批次200709）、溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基（批次200412）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批次201005），pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批次200912），生產(chǎn)廠家均為北京路橋技術(shù)股份有限公司，且培養(yǎng)基的適用性檢查結(jié)果符合《中國藥典》2020年版的要求。

1.1.4 菌種 金黃色葡萄球［CMCC（B）26003］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］、銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］、黑曲霉菌［CMCC（F）98003］。以上菌珠均為第三代。購自中國食品藥品檢定研究院。

1.1.5 其他 濾膜（天津市津騰實驗設(shè)備有限公司）；聚山梨酯80，由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 菌液的制備 取各試驗菌，按照《中國藥典》2020年版四部1105中相關(guān)規(guī)定，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成白色念珠菌懸液、枯草芽孢桿菌懸液，濃度為103～104CFU/mL；用0.9%無菌氯化鈉溶液制成銅綠假單胞菌懸液，濃度分別為103～104CFU/mL、10～100 CFU/mL；用0.9%無菌氯化鈉溶液制成金黃色葡萄球菌懸液，濃度分別為103～104CFU/mL、10～100 CFU/mL、小于 50 CFU/mL、50～100 CFU/mL；用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成黑曲霉孢子懸液，濃度為 103～104CFU/mL［5-8］。

1.2.2 供試液的制備

1.2.2.1 乳化劑的用量 取本品60 g，分別置6個無菌均質(zhì)袋中，10克/袋，分別加入無菌聚山梨酯80 6、7、8、9、10、11 mL，均質(zhì)2 min，再分別加入無菌含5%聚山梨酯80的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，均質(zhì)2 min，成1∶10溶液。加入無菌聚山梨酯80 6 mL及7 mL均立刻分層，8 mL 2 min后分層，9 mL 7 min后分層，10 mL及11 mL穩(wěn)定。結(jié)果表明，10 g樣品需要聚山梨酯80量為10 mL。

1.2.2.2 制備供試液 取本品30 g置無菌均質(zhì)袋中，加入無菌聚山梨酯80 30 mL，均質(zhì)2 min，再加無菌含5%聚山梨酯80的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至300 mL，均質(zhì)2 min，成1∶10溶液；取1∶10供試液50 mL，加無菌含5%聚山梨酯80的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，制成1∶20供試液；取1∶10供試液20 mL，加無菌含5%聚山梨酯80的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，制成1∶50供試液。

1.2.3 五種實驗方法中各菌試驗回收率的比較

1.2.3.1 常規(guī)法 試驗組：取1∶10的供試液5份，每份10 mL，分別加入0.1 mL “1.2.1”所述試驗菌懸液［7］，混勻，即為試驗組。取含有白色念珠菌的混合液4 mL，分別置4個直徑為90 mm的無菌平皿中（1毫升/平皿），2個平皿注入TSA，混勻，另外兩個平皿注入SDA，混勻；取含有黑曲霉孢子的混合液，同法操作；取含有銅綠假單胞菌懸液、金黃色葡萄球菌懸液、枯草芽孢桿菌懸液的試驗液各2 mL，分別置直徑為90 mm的無菌平皿中（1毫升/平皿），注入TSA，混勻，凝固后按規(guī)定條件培養(yǎng)（直徑90 mm的無菌平皿培養(yǎng)基用量約20毫升/平皿）。

供試品對照組：等量稀釋液代替菌液，其余同試驗組。菌液對照組：等量稀釋液代替供試液，其余同試驗組。乳化劑對照組：等量含乳化劑的稀釋液代替供試品，其余同試驗組。

1.2.3.2 增加稀釋液法 取1∶20供試液5份，每份10 mL，分別加入0.1 mL“1.2.1”所述試驗菌液，混勻，即為試驗組；其余對照組同“1.2.3.1”。取上述混合液分別置直徑為90 mm的無菌平皿中，1毫升/平皿，每種混合液平行制備2個平皿，注入規(guī)定的培養(yǎng)基，凝固后按規(guī)定條件培養(yǎng)。取1∶50供試液同法試驗。

1.2.3.3 增加培養(yǎng)基體積法 取1∶10的供試液5份，每份10 mL，分別加入0.1 mL“1.2.1”所述試驗菌液，混勻，即為試驗組；其余對照組同“1.2.3.1”。取上述混合液分別置直徑為150 mm的無菌平皿中，1毫升/平皿，每種混合液平行制備2個平皿，注入規(guī)定的培養(yǎng)基，凝固后按規(guī)定條件培養(yǎng)（直徑150 mm的無菌平皿培養(yǎng)基用量約60毫升/平皿）。

1.2.3.4 增加稀釋液-增加培養(yǎng)基體積聯(lián)合法 取1∶20供試液5份，每份10 mL，分別加入0.1 mL“1.2.1”所述試驗菌液，混勻，即為試驗組；其余對照組同“1.2.3.1”。取上述混合液分別置直徑為150 mm的無菌平皿中，1毫升/平皿，每種混合液平行制備2個平皿，注入規(guī)定的培養(yǎng)基，凝固后按規(guī)定條件培養(yǎng)。取1∶50供試液同法試驗。

1.2.3.5 薄膜過濾法 取1∶10的供試液5份，每份10 mL，分別加入0.1 mL“1.2.1”所述試驗菌液，混勻，即為試驗組；其余對照組同“1.2.3.1”。取各混合液1 mL用于制膜，用500 mL pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗5次，每次100 mL。將制成的膜貼于對應(yīng)培養(yǎng)基上，按規(guī)定培養(yǎng)。

1.2.4 控制菌的方法適用性試驗

1.2.4.1 常規(guī)法 取1∶10供試液30 mL，分別接種于3瓶100 mL的TSB中，每瓶10 mL。一瓶加入不大于100 CFU/mL的金黃色葡萄球菌懸液1 mL，為金黃色葡萄球菌試驗組；一瓶加入不大于100 CFU/mL的銅綠假單胞菌懸液1 mL，為銅綠假單胞菌試驗組。一瓶加入等菌液量的稀釋液，為供試品對照組；按規(guī)定進(jìn)行培養(yǎng)、試驗。

菌液組：等量稀釋液代替供試液，其余同試驗組。

陰性對照：等量稀釋液代替供試液和菌液，其余同試驗組。

1.2.4.2 增加培養(yǎng)基體積法 取TSB兩組，兩組中TSB體積均分別為200、300、400、500 mL。取 1∶10供試液，分別接種于兩組TSB中，10毫升/份， 一組加入濃度小于50 CFU/mL的金黃色葡萄球菌懸液（1毫升/份）；另一組加入濃度為50～100 CFU/mL的金黃色葡萄球菌懸液（1毫升/份），作為試驗組；按規(guī)定培養(yǎng)、試驗。供試品對照組、菌液組、陰性對照組同“1.2.4.1”。

2 結(jié)果

2.1 計數(shù)方法適用性試驗結(jié)果分別按照（試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù)）/菌液對照組平均菌落數(shù)、乳化劑對照組平均菌落數(shù)/菌液對照組平均菌落數(shù)，計算試驗組和乳化劑對照組的回收率。結(jié)果見表1～4。

表4 薄膜過濾法中金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率（n=3）

由表1可知，常規(guī)法試驗中銅綠假單胞菌（批次20210531、20210623、20210729的回收率分別為0.63、0.59、0.60）、白色念珠菌、黑曲霉菌回收率均在0.5～2.0范圍內(nèi)，而金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收率均小于0.5；由表2～4可知，隨著稀釋液和培養(yǎng)基的增加，會在一定程度上消除供試品的抑菌作用，但金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收率沒有全部在0.5～2.0范圍內(nèi)，而薄膜過濾法中兩種試驗菌回收率均符合要求。故需氧菌總數(shù)計數(shù)用薄膜過濾法；霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)用常規(guī)法。

表1 常規(guī)法各試驗菌回收率（n=3）

表2 增加稀釋液、增加培養(yǎng)基體積、增加稀釋液-增加培養(yǎng)基體積聯(lián)用三種方法中金黃色葡萄球菌的回收率（n=3）

2.2 控制菌適用性試驗結(jié)果培養(yǎng)物經(jīng)相應(yīng)的生化鑒定和VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)確認(rèn)，結(jié)果：銅綠假單胞菌用常規(guī)法即可檢出；金黃色葡萄球菌可通過增大培養(yǎng)基體積的方法檢出。但隨著加菌量的不同，培養(yǎng)基需要增加的體積也不同：加菌量小于50 CFU/mL時，培養(yǎng)基體積增加至500 mL，金黃色葡萄球菌可被檢出；加菌量為50～100 CFU/mL時，培養(yǎng)基體積增加至400 mL可被檢出。

3 討論

有抑菌作用的乳膏劑在微生物限度檢查中，如何有效消除抑菌作用、解決濾膜堵塞，是試驗的關(guān)鍵問題［9］。乳膏劑由水相、油相乳化形成，微生物在油相和水相分布不同［10-12］，而選擇適宜的前處理方式使樣品分散均勻，可有效解決上述問題［13］。對于油脂類供試品，中國藥典提出可用十四烷酸異丙酯、聚山梨酯80或其他無抑菌性的無菌表面活性劑充分混勻［5］，通過查閱資料，十四烷酸異丙酯為羧酸酯類化合物，能與植物油、有機溶劑任意互溶，不溶于水［14-15］；聚山梨酯80在水和乙醇及多種有機溶劑中易溶，增溶作用不受溶液pH影響［16］，故試驗選取聚山梨酯80為乳化劑。因其來源、濃度不同時，也會對試驗菌的生長造成不同的影響［17］，所以在保證樣品充分乳化的同時，乳化劑的使用量還要盡可能最小。通過試驗，確定本樣品10 g需要聚山梨酯80的量為10 mL。關(guān)于制備供試液時的混勻方式，本文作者也曾嘗試用研磨、45 ℃水浴恒溫震蕩等方式，但過程繁瑣，薄膜過濾時容易出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象。而使用均質(zhì)器，混勻快速、簡單，樣品分散更均勻，很大程度上減少了薄膜過濾時堵塞現(xiàn)象。

氯霉素對革蘭陽性、陰性細(xì)菌均有抑制作用［18-19］，僅憑表1中3個樣品試驗結(jié)果，確定采用常規(guī)方法檢驗銅綠假單胞菌，結(jié)果可能存在誤差。故本試驗又增加了3批不同批號的樣品，進(jìn)行銅綠假單胞菌常規(guī)法中回收率的試驗比較，以排除假陰性的可能性。

表2，3中，采用了1∶20、1∶50的樣品溶液，回收率有所不同，但規(guī)律不明顯，尤其是表3中，批號為20210815的樣品，在增加稀釋液-增加培養(yǎng)基體積聯(lián)用的方法中，稀釋度從1∶20增加到1∶50，回收率反而大幅下降（0.64降至0.38）。究其原因，一是可能與方法有關(guān)，說明只加大1倍多的體積并不一定能使方法可行；另外，還可能與樣品中實際加菌量有關(guān)，雖然符合加菌量不大于100 CFU/mL的規(guī)定［5］，但加菌量太小會與方法靈敏度不匹配，所以出現(xiàn)這種情況。這也提示我們在試驗時要注意加菌量的不同可能對實驗造成的影響。

表3 增加稀釋液、增加培養(yǎng)基體積、增加稀釋液-增加培養(yǎng)基體積聯(lián)用三種方法中枯草芽孢桿菌的回收率（n=3）

在控制菌適用性試驗中，金黃色葡萄球菌用常規(guī)法不能檢出，嘗試使用增加培養(yǎng)基體積的方法。而在一定濃度下，氯霉素的抑菌效果和加菌量有關(guān)，雖然都是加入“不大于100 CFU/mL的金黃色葡萄球菌”，但實際加菌量的多少，對應(yīng)需要增加的培養(yǎng)基體積可能有所不同。故在增加培養(yǎng)基體積的方法中，試驗考察了不同加菌量對應(yīng)不同培養(yǎng)基體積出現(xiàn)的結(jié)果，即方法的靈敏度，以增加可靠性。

氯霉素為廣譜抗菌藥物，有較強的抑菌性［20］，微生物限度檢查方法選擇不當(dāng)會造成假陰性、漏檢等現(xiàn)象。本文查閱了有關(guān)含氯霉素外用制劑的微生物限度檢查方法的文獻(xiàn)資料［21-24］，結(jié)合本樣品試驗結(jié)果，建立氯霉素氧化鋅乳膏的微生物限度檢查方法：霉菌和酵母菌總數(shù)的計數(shù)、銅綠假單胞菌的檢查采用常規(guī)法；需氧菌總數(shù)計數(shù)采用薄膜過濾法；金黃色葡萄球菌的檢查采用增加培養(yǎng)基體積法。該法為真實反映樣品染菌情況提供了檢驗依據(jù)，也為其他同類樣品的檢驗提供參考依據(jù)。