膠質母細胞瘤患者MGMT基因啟動子甲基化檢測與分析

施克青，楊 斌，王 楠，楊福偉，秦治剛，張金男*

(1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 神經(jīng)外科,吉林 長春130033；2.吉林省膠質瘤精準診療重點實驗室)

膠質母細胞瘤(GMB)屬于膠質瘤中惡性程度最高的類型，臨床上通常以手術切除為主，輔以放、化療等綜合治療，但患者的預后較差，死亡率較高。因此，探索治療GMB的有效方法是當前醫(yī)療工作者的研究重點[1]。有研究發(fā)現(xiàn)[2-3]，MGMT(O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶)基因啟動子甲基化的患者對烷化劑藥物反應較好,預后優(yōu)于非甲基化的患者，且DNA異常甲基化還可作為預防腫瘤轉移、復發(fā)等分子標記物對腫瘤患者的預后效果進行評估。MGMT作為一種DNA修復酶，可逆轉由烷化劑引起的DNA損傷，從而導致腫瘤對替莫唑胺和基于亞硝基脲的化療不敏感。MGMT啟動子的甲基化使MGMT沉默，使得腫瘤對用烷化劑治療更敏感[4]。本文通過對1例多形性膠質母細胞瘤患者MGMT基因啟動子甲基化進行檢測與分析，以期為GMB的預后評估提供一定的理論依據(jù)。

1 臨床資料

患者，男性，58歲，經(jīng)臨床診斷和影像學特征確診為多形性膠質母細胞瘤多出血伴囊性變WHO:IV級，收集其家人相關信息。采用MGMT啟動子甲基化檢測MGMT啟動子區(qū)12個CpG位點的甲基化程度，預測替莫唑胺(TMZ)的敏感性?；颊逜片免疫組化：Vinentin(+)；CK(-)；EMA(局部弱+)；GFAP(+)；CD34(血管+)；PR(-)；Ki67(局部30%+)；S-100(+)；011g-2(+)；TDH1(-)；MGMT(3%+)；ATRX(散在+)；P53(局灶10%+)；NeuN(-)。

2 結果

2.1 相關基因變異

變異分級為Ⅰ類的基因變異的分別為ATRXNM_000489.4intron13 c.4214+3A>G、BRAFNM_004333.4 exon15p.V600E c.1799T>A、CDKN2A缺失、CDKN2B缺失，突變豐度/拷貝數(shù)分別為62.84%、30.39%、0.69、0.63，見表1。

表1 相關基因變異

2.2 常見分型及預后基因列表

檢查結果為野生型中檢測的項目分別為IDH1、IDH2、TERT、H3F3A/HIST1H3B/HIST1H3C，檢測內容分別為R132、R172、c.-124C>T(C228T)/c.-146C>T(C250T)、p.K28M(K27M)，相關癌種分別為膠質瘤、膠質瘤、膠質瘤/腦膜瘤、彌漫中線膠質瘤；檢查結果為未檢出融合的項目分別為BRAF、RELA、YAP1、MYB，檢測內容均為融合，相關癌種分別為膠質瘤、室管膜瘤、室管膜瘤、血管中心性膠質瘤；檢查結果為未檢出突變>G項目別為ATRX，檢測內容為點突變，相關癌種為膠質瘤；檢查結果為未檢出擴增的項目為EGFR、7號染色體，檢測內容均為擴增，相關癌種為膠質母細胞瘤；檢查結果為檢出缺失的項目分別CDKN2A、CDKN2B、1p染色體、19q染色體、10號染色體，檢測內容均為缺失，相關癌種分別為膠質瘤、膠質瘤、少突膠質瘤、少突膠質瘤、膠質母細胞瘤，見表2。

2.3 靶向用藥提示

變異分級為Ⅰ類，基因變異為BRAFNM_004333.4exon15p.V600E c.1799T>A，突變豐度/拷貝數(shù)約為30.39%，本癌種可能敏感藥物為達拉非尼+曲美替尼(A級)、維莫非尼+Cobimetinib(A級)、Encorafenib+Binimetinib(C級)、Selumetinib(C級)、達拉非尼(C級)、維莫非尼(C級)、Ulixertinib(D級)、依維莫司+PLX4720(E級)、依維莫司+Selumetinib(E級)；其他癌種可能敏感藥物為Encorafenib+Binimetinib(C級)、Panitumumab+Encorafenib(C級)、達拉非尼(C級)、達拉非尼+曲美替尼(C級)、曲美替尼(C級)、維莫非尼(C級)、維莫非尼+Cobimetinib(C級)、西妥昔單抗+Encorafenib(C級)，無可能耐藥藥物；變異分級為Ⅱ類，基因變異為CDKN2A缺失，突變豐度/拷貝數(shù)約為0.69，本癌種可能敏感藥物為哌柏西利(E級)，其他癌種無敏感藥物和耐藥藥物，見表3。

表2 常見分型及預后基因列表

表3 靶向用藥提示

3 討論

據(jù)統(tǒng)計，顱內原發(fā)性惡性腫瘤中膠質瘤約為70%左右，其中，GBM患者占比約50%，是一種最為常見的惡性腫瘤類型，且對患者身體危害大，預后效果較差，致死率較高，嚴重威脅其生活質量和生命安全[5]。隨著醫(yī)療水平的提高，GBM治療手段已得到明顯的提升，但患者的中位生存期仍較短，因此，對GBM病因以及預后因素的影響具有重要意義[6]。MGMT(O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶)作為一種DNA修復酶，可提高逆轉由烷化劑引起的DNA損傷，降低腫瘤對替莫唑胺和亞硝基脲的敏感性，而GMT啟動子的甲基化可以使MGMT沉默，增強腫瘤對烷化劑的敏感性[7]，有研究發(fā)現(xiàn)[8]，在GBM患者治療中，約30%-60%的患者MGMT啟動子是甲基化狀態(tài)，這也說明MGMT啟動子甲基化狀態(tài)治療前的預測對患者預后效果的影響較大。

本例研究發(fā)現(xiàn)，在變異分級為I類中，基因變異為ATRXNM_000489.4intron13c.4214+3A>G，突變豐度/拷貝數(shù)為62.84%，說明ATRX突變有助于膠質瘤的診斷(NCCN.org)。ATRX突變常伴有IDH突變檢出，而幾乎不會與1p19q染色體缺失同時檢出。因此，ATRX突變結合IDH突變是一種典型的星型細胞瘤?；蜃儺悶锽RAFNM_004333.4exon15p.V600Ec.1799T>A，突變豐度/拷貝數(shù)為30.39%，說明在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，BRAFV600E突變主要發(fā)生在幕上毛細胞星形細胞瘤，神經(jīng)節(jié)細胞瘤，多形性黃色星形細胞瘤，胚胎發(fā)育不良性神經(jīng)上皮腫瘤,約50%的IDH野生型上皮樣膠質母細胞瘤也存在該變異?；蜃儺悶镃DKN2A缺失，突變豐度/拷貝數(shù)為0.69，提示CDKN2A缺失常與EGFR擴增/TERT啟動子突變/7，10號染色體變異同時出現(xiàn)，是膠質母細胞瘤的一類標志物，研究表明CDKN2A/CDKN2B缺失與IDH突變型低級別星形膠質瘤/膠質母細胞瘤或IDH野生型的膠質母細胞瘤預后不良相關(PMID:33235995、32385699)?；蜃儺悶镃DKN2B缺失，突變豐度/拷貝數(shù)為0.63，提示CDKN2B缺失常與EGFR擴增/TERT啟動子突變/7，10號染色體變異同時出現(xiàn)，是膠質母細胞瘤的一類標志物，研究表明CDKN2A/CDKN2B缺失與IDH突變型低級別星形膠質瘤/膠質母細胞瘤或IDH野生型的膠質母細胞瘤預后不良相關(PMID:33235995、32385699)[9]。

研究發(fā)現(xiàn)，突變形式為exon15c.1799T>A p.V600E突變豐度為30.39%，原因在于BRAF作為一種癌基因，位于7號染色體，它編碼一種絲/蘇氨酸特異性激酶，是Ras/Raf/Mek/Erk/Mapk通路重要的轉導因子，參與調控細胞內多種生物學事件，如細胞生長、分化和凋亡等。研究表明，在多種生類惡性腫瘤中，如惡性黑色素瘤、結直腸癌、肺癌、甲狀腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的BRAF基因突變[10]。BRAF突變在黑色素瘤中的發(fā)生率約為37%-50%，最為常見的是V600錯義突變，大約80%-90%的V600 BRAF突變?yōu)閂600E。通常情況下，BRAF突變不會與黑色素瘤中的其他致癌基因突變(NRAS突變/KIT突變)同時發(fā)生。另外，BRAF突變在NSCLC中發(fā)生率為1%-4%，其中V600E占50%，突變患者多為腺癌和有吸煙史患者。大多數(shù)情況下，BRAF突變不會與NSCLC中其他致癌基因突變(如EGFR/ALK)同時發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，突變形式為拷貝數(shù)0.69時，CDKN2A位于9號染色體上，可編碼腫瘤抑制蛋白p16、p14arf等幾種蛋白產(chǎn)物。p16基因是1994年美國冷泉港實驗室Kamb等發(fā)現(xiàn)的新抗癌基因，p16能與cyclinD競爭性結合CDK4/6，抑制CDK4/6的激酶活性，阻止細胞進入S期和DNA合成啟動，通過抑制CDK4/6激酶的活性而使pRb不能磷酸化，未磷酸化的pRb增多抑制細胞增殖。同時高磷酸化的pRb可誘導p16的表達與CDK4/6結合抑制CDK4/6的活性，最終使pRb的磷酸化程度減弱[11]。因而p16在cyclinD-CDK4/6-pRb-E2F細胞周期調節(jié)途徑中起著負反饋的作用。p16基因的變異或其蛋白的失活都會導致cyclinD-CDK4/6-pRb-E2F調節(jié)途徑的失控使細胞過度增殖而導致腫瘤發(fā)生。p14arf能夠激活抑癌基因p53。認為p16是比p53更重要的一種新型抗癌基因。P16基因已經(jīng)在肺癌、乳腺癌、腦腫瘤、骨腫瘤、皮膚癌、膀胱癌、腎癌、卵巢癌和淋巴瘤、黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)純合子缺失以及無義，錯義及移碼突變。這表明p16基因以缺失，突變方式廣泛參予腫瘤形成，檢測p16基因有無改變對判斷患者腫瘤的易感性以及預測腫瘤的預后，具有十分重要的臨床意義。研究發(fā)現(xiàn)，MLH1(Exon1-3)-FLNB(Exon12-47)突變豐度34.8%時，MLH1基因位于3號染色體，編碼的蛋白參與DNA錯配修復，該基因是遺傳性非息肉性結腸癌(HNPCC)相關基因。其突變機制為DNA錯配修復蛋白的功能缺陷，導致了染色體和微衛(wèi)星不穩(wěn)定，其中微衛(wèi)星不穩(wěn)定是引起HNPCC的主要原因，約90%的HNPCC有MLH1和MSH2基因的胚系突變[12]。

綜上所述，MGMT啟動子甲基化與膠質母細胞瘤生存獲益相關，并用于臨床試驗的風險分層。MGMT啟動子發(fā)生甲基化的患者明顯比未發(fā)生甲基化的患者使用烷化劑的療效好，其總體生存率和無進展生存率更高。MGMT啟動子區(qū)甲基化對膠質瘤一線化療藥物TMZ治療膠質瘤的化療療效具有預測價值，且是獨立的預后較好的指示指標。MGMT啟動子未甲基化者從TMZ常規(guī)治療方案中獲益較小，應對這類患者采用更有效的有助于克服耐藥的其他化療方案。

本次受檢者未檢出顯著臨床意義的變異，目前研究未發(fā)現(xiàn)這些類型變異與腫瘤發(fā)生有明確關系，罹患腫瘤的風險為普通風險。普通風險不能完全排除罹患腫瘤的可能，可能是環(huán)境因素、檢測基因范圍以外存在其他未知致病突變的風險。