2型糖尿病患者血清Ectodysplasin A與非酒精性脂肪性肝病相關(guān)性研究

錢(qián)方方，蔡珍生，顧恬，李昊翔，趙麗，楊玲，鄧霞，袁國(guó)躍

隨著生活水平的不斷提高，非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的患病率逐年攀升，有研究表明，全球約25%的成年人受到NAFLD的困擾，總?cè)藬?shù)高達(dá)10億［1］。NAFLD常出現(xiàn)單純脂肪變性，進(jìn)行性出現(xiàn)脂肪性肝炎，進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化和/或肝細(xì)胞癌，因此成為肝臟相關(guān)疾病發(fā)病率和死亡率增高的主要原因［2］。NAFLD常與血脂異常、胰島素抵抗、肥胖、高血壓、糖尿病等代謝紊亂疾病并發(fā)，被認(rèn)為是代謝綜合征的主要特征［3］。有研究表明，2型糖尿?。═2DM）是NAFLD發(fā)生和發(fā)展的危險(xiǎn)因素，其可能加重患者的血脂代謝紊亂，增加心血管疾病的發(fā)生率［4］。

近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，多種肝臟因子均參與了糖尿病、肥胖、代謝綜合征和NAFLD的發(fā)生、發(fā)展，并可能作為新的診斷性生物標(biāo)志物來(lái)闡明代謝紊亂的發(fā)生機(jī)制［5］。Ectodysplasin A（EDA）基因位于染色體Xq12-13，最初被認(rèn)為是腫瘤壞死因子相關(guān)細(xì)胞因子家族的成員，屬于Ⅱ型跨膜蛋白，可在內(nèi)蛋白酶呋喃切割后分泌到胞外結(jié)構(gòu)域［6］。既往研究表明，EDA在牙齒、頭發(fā)和汗腺等皮膚衍生結(jié)構(gòu)的發(fā)育和維持中起著重要作用，EDA基因突變可導(dǎo)致X連鎖少汗性外胚層發(fā)育不良［7］和選擇性非綜合征性牙齒發(fā)育不全［8］。隨著研究的深入，2017年，AWAZAWA等［9］發(fā)現(xiàn)了該基因表達(dá)的新功能——調(diào)節(jié)全身葡萄糖代謝，并導(dǎo)致骨骼肌胰島素敏感性受損，被認(rèn)為是一種肝臟因子；該研究結(jié)果表明，高脂飲食小鼠和db/db小鼠的肝臟和血清EDA水平顯著升高；此外，還發(fā)現(xiàn)EDA的過(guò)度表達(dá)加劇了小鼠的糖耐量受損，敲除EDA能顯著改善小鼠骨骼肌胰島素敏感性。目前鮮有研究探討EDA與T2DM的關(guān)系，亦未見(jiàn)T2DM合并NAFLD人群中血清EDA水平的有關(guān)研究。本研究擬探討T2DM患者中血清EDA水平與各指標(biāo)的相關(guān)性及T2DM患者血清EDA水平與NAFLD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，為NAFLD早期篩查及治療提供新的理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2017年11月至2020年11月于江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科就診的T2DM患者130例為研究對(duì)象，其中男74例（56.92%）、女56例（43.08%），平均年齡（55.6±12.4）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合T2DM的診斷標(biāo)準(zhǔn)，參照美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)（ADA）頒布的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)［10］；（2）年齡＞18周歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）特殊類(lèi)型糖尿病、1型糖尿病、糖尿病急性并發(fā)癥者；（2）各種病毒性肝炎、自身免疫性疾病及遺傳性肝炎、藥物性肝病者；（3）過(guò)量飲酒者；（4）妊娠和哺乳者；（5）口服調(diào)血脂藥物進(jìn)行治療者；（6）有冠心病、腦梗死、急性感染及惡性腫瘤史者。本研究經(jīng)江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（SWYXLL20181217-1），研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 一般資料 收集患者的一般資料，包括性別、年齡、T2DM病程、高血壓病史、吸煙史（既往或者目前吸煙且未戒煙者或者戒煙不足半年）、飲酒史（既往或者目前飲酒且未戒酒者或者戒酒不足半年）、身高、體質(zhì)量、腰圍（WC）、臀圍（HC）、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP），計(jì)算體質(zhì)指數(shù)〔BMI=體質(zhì)量（kg）/身高（m）2〕和腰臀比（WHR=WC/HC）。

1.3 實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo) 患者隔夜禁食8～10 h后，次日行75 g口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）及胰島素釋放試驗(yàn)，采集靜脈血后使用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)血糖〔空腹血糖（FPG）、餐后2 h血糖（2 hPG）〕水平，通過(guò)化學(xué)發(fā)光法測(cè)定胰島素〔空腹胰島素（FIns）、餐后2 h胰島素（2 hIns）〕以及C肽〔空腹C肽（FCP）、餐后2 hC肽（2 hCP）〕水平。計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=FPG×FIns/22.5和胰島β細(xì)胞功能指數(shù)（HOMA-β）=FIns×20/（FPG-3.5）。使用高效液相層析法檢測(cè)糖化血紅蛋白（HbA1c）。采用酶法檢測(cè)三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）。使用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血尿酸（SUA）、血肌酐（Scr）與尿素氮（BUN）水平。

1.4 EDA水平測(cè)定 使用市售人酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA，武漢伊艾博生物公司，Catalog No.E1976H）測(cè)定血清EDA水平，試劑盒的靈敏度＜20 ng/L，批內(nèi)變異系數(shù)（CV）≤7.8%，批間CV≤8.9%，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。用酶標(biāo)儀（ThermoFisher，Multiskan GO）檢測(cè)450 nm處的吸光度值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。ELISA檢測(cè)范圍為78～5 000 ng/L。

1.5 NAFLD超聲診斷 采用全身彩色多普勒診斷儀LOGIQ-9由專(zhuān)業(yè)超聲醫(yī)生進(jìn)行腹部超聲檢查。NAFLD的診斷基于中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病學(xué)分會(huì)制訂的《非酒精性脂肪性肝病診療指南（2010年1月修訂）》［11］。根據(jù)超聲檢查結(jié)果將患者分為兩組：NAFLD組（80例）和非NAFLD組（50例）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)或Spearman秩相關(guān)分析評(píng)估血清EDA與各指標(biāo)的相關(guān)性；采用多元線性回歸分析探討T2DM患者血清EDA水平的影響因素；采用多因素Logistic回歸分析探討T2DM患者血清EDA水平對(duì)NAFLD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的影響。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者基線資料比較 兩組患者性別、高血壓病史、吸煙史、飲酒史、WHR、SBP、DBP、FPG、2 hPG、HOMA-β、HbA1c、TC、HDL-C、LDL-C、Scr比 較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；NAFLD組患者年齡、T2DM病程低于非NAFLD組，而B(niǎo)MI、FIns、2 hIns、FCP、2 hCP、HOMA-IR、TG、ALT、AST、SUA、BUN、EDA水平明顯高于非NAFLD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組患者基線資料比較Table 1 Comparison of baseline data between T2DM patients with and without ultrasound-detected NAFLD

2.2 T2DM患者血清EDA與各指標(biāo)的相關(guān)性分析相關(guān)性分析結(jié)果顯示，T2DM患者血清EDA與年齡、FIns、2 hIns、HOMA-IR、AST呈正相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 T2DM患者血清EDA與各指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of serum ectodysplasin A with clinical and biochemical indices in T2DM patients

2.3 T2DM患者血清EDA水平影響因素的多元線性回歸分析 以EDA為因變量，以年齡、T2DM病程、BMI、WHR、SBP、DBP、FPG、2 hPG、FIns、FCP、2 hCP、HbA1c、HOMA-IR、HOMA-β、TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT、AST、SUA、Scr、BUN 為 自變量進(jìn)行多元線性回歸分析（因變量、自變量賦值均為實(shí)測(cè)值），結(jié)果顯示，年齡、WHR、2 hIns、AST是T2DM患者EDA水平的影響因素（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 T2DM患者血清EDA水平影響因素的多元線性回歸分析Table 3 Multiple linear regression analysis of factors associated with serum ectodysplasin A in T2DM

2.4 T2DM患者血清EDA水平對(duì)NAFLD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)影響的多因素Logistic回歸分析 以是否發(fā)生NAFLD為因變量，以臨床常見(jiàn)的混雜因素EDA、高血壓病史、吸煙史、飲酒史、性別、年齡、病程、BMI、WHR為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，各變量賦值情況見(jiàn)表4。結(jié)果顯示，在未校正模型、模型1（校正年齡、病程）、模型2（校正年齡、病程、性別、BMI、WHR）、模型3（校正年齡、病程、性別、BMI、WHR、高血壓病史、吸煙史、飲酒史）中，血清EDA均是T2DM患者發(fā)生NAFLD的影響因素（P＜0.05），見(jiàn)表5。

表4 T2DM患者發(fā)生NAFLD影響因素的多因素Logistic回歸分析賦值表Table 4 Assignment for influencing factors of NAFLD in T2DM analyzed using multivariate Logistic regression

表5 T2DM患者血清EDA水平對(duì)NAFLD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)影響的多因素Logistic回歸分析Table 5 Multivariate Logistic regression analysis of factors affecting NAFLD in T2DM patients

3 討論

肝臟可分泌多種蛋白質(zhì)因子形成調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)組織間通信影響肝臟和其他器官的能量代謝［7］，從而影響代謝相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展，如肥胖、胰島素抵抗、糖尿病、脂肪肝等［12-15］。本研究初步探討了T2DM患者肝臟因子EDA與NAFLD的相關(guān)性。研究結(jié)果顯示，T2DM合并NAFLD組血清EDA水平明顯高于非NAFLD組，年齡、WHR、2 hIns、AST是EDA的獨(dú)立相關(guān)因素。更重要的是，NAFLD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)隨血清EDA水平的增加而增加，提示EDA可能是T2DM合并NAFLD發(fā)生、發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素。

高脂血癥、肥胖、胰島素抵抗是導(dǎo)致T2DM、NAFLD的重要危險(xiǎn)因素［16-17］。其中，脂質(zhì)代謝紊亂起到至關(guān)重要的意義，其主要特征是TG升高，肝臟脂質(zhì)堆積加劇肝脂肪變性［18］。此外，胰島素抵抗以及肝臟TG釋放脂肪酸（FA）增加導(dǎo)致肝臟FA水平升高，而脂質(zhì)沉積產(chǎn)生的脂毒性，進(jìn)一步加劇肝細(xì)胞的損傷和炎癥進(jìn)展，最終導(dǎo)致肝纖維化［19］。本研究結(jié)果顯示，與非NAFLD組相比，NAFLD組BMI、FIns、2 hIns、FCP、2 hCP、HOMA-IR、TG、ALT、AST、SUA 和BUN水平均顯著升高，這與既往研究結(jié)果一致［20］。這些結(jié)果共同表明T2DM合并NAFLD患者血脂水平更高，體型更為肥胖，胰島素抵抗更為明顯。

EDA作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的肝臟因子，近年來(lái)被認(rèn)為與肥胖、胰島素抵抗、T2DM和NAFLD密切相關(guān)［21］。本研究首次發(fā)現(xiàn)，與單純T2DM組（非NAFLD組）相比，T2DM合并NAFLD組患者血清EDA水平顯著升高，且與年齡、FIns、2 hIns、HOMA-IR、HOMA-β、AST、Scr呈正相關(guān)。在校正臨床常見(jiàn)的危險(xiǎn)因素后，多因素Logistic回歸分析顯示EDA仍是T2DM患者發(fā)生NAFLD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果與既往研究并不完全一致，YANG等［22］的研究結(jié)果顯示，與正常受試者相比，NAFLD患者EDA水平顯著升高，且與HOMA-IR、BMI、WHR、FPG和HbA1c呈正相關(guān)。此外，BAYLISS等［23］也同樣發(fā)現(xiàn)與正常受試者相比，NAFLD患者EDA水平顯著升高，然而進(jìn)一步的相關(guān)性分析卻發(fā)現(xiàn)血漿EDA與HOMA-IR、FPG和HbA1c無(wú)明顯相關(guān)性。研究結(jié)果不一致的原因可能是多方面的，首先，研究人群不同，本研究的研究對(duì)象是T2DM合并NAFLD人群，YANG等［22］針對(duì)的是單純NAFLD人群，而B(niǎo)AYLISS等［23］研究的則是NAFLD合并T2DM患者；其次，樣本量的差異以及藥物和疾病不同階段的病理特征等均可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生一定影響。而且，本研究和YANG等［22］采用的腹部超聲方法診斷NAFLD，而B(niǎo)AYLISS等［23］則采用的是肝活檢和組織學(xué)評(píng)估，不同的診斷標(biāo)準(zhǔn)也會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。此外，既往研究還發(fā)現(xiàn)，肝臟EDA的表達(dá)與肝臟脂肪含量和內(nèi)臟脂肪面積呈正相關(guān)，并與組織學(xué)確定的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）炎癥和脂肪變性評(píng)分呈正相關(guān)［9］。越來(lái)越多的基礎(chǔ)研究證據(jù)表明，EDA在脂質(zhì)代謝中起著重要作用。在動(dòng)物研究中，缺乏EDA的小鼠顯著減少了高脂飲食（HFD）引起的肝脂滴增加，降低了HFD模型小鼠的肝TG含量，并降低了ALT和AST水平。此外，在HepG2細(xì)胞中，游離脂肪酸（FFA）干預(yù)顯著增加了細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中EDA蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，EDA基因敲除可以增加肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A（CPT1A）的表達(dá)，這是脂肪酸氧化的關(guān)鍵酶，并降低固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（SREBP-1c）、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）和脂肪酸合酶（FAS）的表達(dá)［22］。以上結(jié)果提示，EDA作為一種新型的肝臟因子，可能參與NAFLD的發(fā)生與發(fā)展，并可作為NAFLD風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的良好指標(biāo)。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，年齡越大，2 hIns和AST越高，則血清EDA水平越高，年齡是不可控制的危險(xiǎn)因素，而2 hIns和AST是可控制的因素，因此當(dāng)機(jī)體胰島素抵抗和肝功能改善可能降低血清EDA水平從而進(jìn)一步緩解脂代謝紊亂。本研究結(jié)果還顯示，T2DM合并NAFLD患者的年齡與病程明顯低于非NAFLD組?？紤]到本研究中研究對(duì)象的特點(diǎn)，老年患者的脂肪儲(chǔ)存能力較差，肝纖維化比例增加，T2DM干預(yù)和治療持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，死亡率較高，均可能在一定程度上影響研究結(jié)果［24］。

綜上所述，T2DM合并NAFLD患者血清EDA水平顯著增高，且與胰島素抵抗密切相關(guān)，揭示EDA是T2DM患者發(fā)生NAFLD的重要危險(xiǎn)因素，可能參與NAFLD的發(fā)生與發(fā)展，但其作用機(jī)制仍未闡明，需進(jìn)一步深入研究。本研究也存在一定的局限性：（1）本研究是一項(xiàng)橫斷面研究，樣本量小，因果關(guān)系無(wú)法明確，可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性；（2）由于缺乏正常受試者作為對(duì)照，可能導(dǎo)致研究結(jié)果缺乏可信度；（3）本研究通過(guò)超聲診斷NAFLD，而非采用肝臟穿刺病理活檢，可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生一定影響。

作者貢獻(xiàn)：袁國(guó)躍提出研究構(gòu)思；鄧霞、袁國(guó)躍進(jìn)行可行性分析、研究指導(dǎo)；蔡珍生、顧恬、李昊翔參與數(shù)據(jù)采集、整理；錢(qián)方方負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)的收集、統(tǒng)計(jì)分析及撰寫(xiě)論文，對(duì)論文負(fù)責(zé)；趙麗、楊玲進(jìn)行寫(xiě)作指導(dǎo)及論文修訂。

本文無(wú)利益沖突。