基于層次分析法優(yōu)化祛風消痛噴霧劑的提取工藝

萬春云，肖草茂，李玉云

1.江西省醫(yī)療器械檢測中心，江西 南昌 330000；2.南昌醫(yī)學院藥學院，江西 南昌 330000

祛風消痛噴霧劑是由獨活、羌活、細辛、三七、紅花等13 味藥材組成的一種外用制劑，具有祛風除濕，通血活絡之功效。方中獨活性溫，入腎經(jīng)，可散里之伏風，祛濕止痛，善行祛腰膝筋骨間風寒濕邪所致的下焦之病癥，為君藥，其主要成分為蛇床子素［1］。羌活辛溫之品，具有祛風消腫止痛等功效，為臣藥，研究表明，其發(fā)揮藥效的有效成分是紫花前胡苷［2］。羌活、獨活相須為用，祛風除濕，通絡止痛力強，故有“羌活善治在上在表之游風，獨活善治在下在里之伏風”之說。細辛味辛性溫，具有解表散寒，祛風止痛等作用，為臣藥，其主要成分是細辛脂素［1］。三七味甘性溫，具有散瘀止血，消腫定痛等功效，人參皂苷Rg1 為其主要成分之一［1］。紅花為活血行氣之品，使氣血運行通暢，達到活血通經(jīng)散瘀之效，紅花與三七同為佐藥。羥基紅花黃色素A 是其主要成分之一［1］。為更好地開發(fā)與推廣該方劑，本研究以獨活、羌活、細辛、三七、紅花的有效成分轉移率以及得膏率為評價指標，應用層次分析法確立權重系數(shù)，采用L9（34）正交試驗優(yōu)選祛風消痛噴霧劑的乙醇提取工藝，為祛風消痛噴霧劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LD-20AD 高效液相色譜儀（Shimadzu），ME5超微量電子天平（Sartorius），BT25S 電子天平（Sartorius）。

1.2 試藥

蛇床子素對照品（批號110822-201710），紫花前胡苷對照品（批號111821-201604），細辛脂素對照品（批號111889-201705），人參皂苷Rg1對照品（批號110703-201933），羥基紅花黃色素A 對照品（批號111637-201810），以上對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。獨活藥材飲片、羌活藥材飲片、細辛藥材飲片、紅花藥材飲片、三七藥材飲片均購自江西致和堂中藥飲片有限公司，由江西省醫(yī)療器械檢測中心李玉云研究員鑒定，均為正品。

2 方法與結果

2.1 祛風消痛噴霧劑各有效成分含量測定色譜條件及得膏率的測定方法

2.1.1 供試品的制備獨活、三七粉碎成最粗粉，備用；羌活、細辛、紅花直接采用飲片，備用。

2.1.2 蛇床子素含量測定色譜條件色譜柱為Welch Ultimate C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（49∶51）；檢測波長為330 nm；柱溫25 ℃。

2.1.3 紫花前胡苷含量測定色譜條件［3］色譜柱為Welch Ultimate C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（40∶60），檢測波長為334 nm，柱溫為25 ℃。

2.1.4 細辛脂素含量測定色譜條件色譜柱為Welch Ultimate C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-水（B）梯度洗脫（0～20 min，50% A；20～26 min，50%→100% A）；檢測波長為287 nm；柱溫40 ℃。

2.1.5 人參皂苷Rg1 含量測定色譜條件色譜柱為Welch Ultimate C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-水（B）梯度洗脫（0～12 min，19% A；12～60 min，19%→36% A）；檢測波長為203 nm；柱溫25 ℃。

2.1.6 羥基紅花黃色素A 含量測定色譜條件色譜柱為Welch Ultimate C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26∶2∶72）；檢測波長為403 nm；柱溫25 ℃。

2.1.7 得膏率的測定精密量取各試驗項下醇提液20 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，置105 ℃干燥箱中干燥至恒重，取出置干燥器內冷卻30 min，迅速精密稱定質量。計算浸膏得率。

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇濃度考察按處方量稱取獨活、三七最粗粉，羌活、細辛、紅花飲片4 份，分別加入不同濃度乙醇，8 倍溶劑量加熱提取2 次，每次2 h，溶劑回收定容至100 mL。測定各乙醇濃度項下各藥材有效成分的含量，并計算出各有效成分轉移率及得膏率，結果見表1。根據(jù)試驗結果，選擇70%乙醇濃度進行后續(xù)考察。

表1 不同乙醇濃度各有效成分轉移率及得膏率 %

2.2.2 料液比考察按處方量稱取獨活、三七最粗粉，羌活、細辛、紅花飲片4 份，分別加入不同料液比的70%乙醇溶液為，加熱提取2 次，每次2 h，溶劑回收定容至100 mL。測定各提取體積項下各藥材有效成分的含量，并計算出各有效成分轉移率及得膏率，結果見表2。根據(jù)試驗結果，選擇10 倍體積提取溶劑進行后續(xù)考察。

表2 不同料液比各有效成分轉移率及得膏率 %

2.2.3 提取時間考察按處方量稱取獨活、三七最粗粉，羌活、細辛、紅花飲片4 份，加入10 倍體積的70%乙醇溶液，加熱提取2 次，分別提取1 h、2 h、3 h、4 h，溶劑回收定容至100 mL。測定各提取時間項下各藥材有效成分的含量，并計算出各有效成分轉移率及得膏率，結果見表3。根據(jù)試驗結果，選擇每次提取2 h 進行后續(xù)考察。

表3 不同提取時間各有效成分轉移率及得膏率

2.2.4 提取次數(shù)考察按處方量稱取獨活、三七最粗粉，羌活、細辛、紅花飲片3 份，加入10 倍體積的70%乙醇溶液，加熱提取2 h，分別提取1 次、2 次、3 次。溶劑回收定容至100 mL。測定各提取次數(shù)項下各藥材有效成分的含量，并計算出各有效成分轉移率及得膏率，結果見表4。根據(jù)試驗結果，選擇提取2 次進行后續(xù)考察。

表4 不同提取次數(shù)各有效成分轉移率及得膏率 %

2.3 層次分析法確定綜合評分權重系數(shù)

層次分析法（analytic hierarchy process，AHP）是一種通過兩兩比較來判斷各目標優(yōu)先次序的矩陣，將人為賦分結果和客觀驗證結果有效地結合起來的方法［4］?；谥兴帍头降木甲羰古湮殛P系及各起效成分配伍強弱，確定各成分的優(yōu)先順序：獨活>羌活=細辛>三七=紅花>得膏率，以獨活、羌活、三七、細辛、紅花的主要有效成分含量及得膏率為測定指標進行評價，計算各綜合評分，構建成對比較的判斷優(yōu)先矩陣，賦予各項指標間的相對評分，見表5。

表5 6項目標成對比較判斷優(yōu)先矩陣 分

在各項指標兩兩比較判斷矩陣中，各藥材的有效成分相對得膏率重要得多，因為它是發(fā)揮臨床藥效的物質基礎。在處方中獨活為君藥，羌活與細辛為臣藥，紅花和三七為佐藥，獨活有效成分蛇床子素相對羌活有效成分紫花前胡苷及細辛有效成分細辛脂素重要，記2 分，相對紅花有效成分羥基紅花黃色素A 及三七有效成分人參皂苷Rg1更重要，記3 分，相對得膏率記4 分，其余以此類推。

式中，RI為判斷矩陣的平均隨機一致性指標，查找相應的平均隨機一致性指標，當矩陣階數(shù)為6時，RI＝1.24［6］。

由計算結果可知，蛇床子素的權重系數(shù)為0.342 9、細辛脂素、紫花前胡苷的權重系數(shù)為0.171 4、羥基紅花黃色素A、人參皂苷Rg1的權重系數(shù)為0.114 3，得膏率的權重系數(shù)為0.085 7。其中，CR作為衡量所得權重系數(shù)是否合理的指標，由表6 可知，CR<0.1，即認為判斷矩陣具有滿意的一致性，說明所求得的權重系數(shù)合理有效，它可用在下一步祛風消痛噴霧劑提取工藝優(yōu)選的綜合評分中。

表6 指標性成分權重系數(shù)及一致性檢驗

2.4 提取工藝優(yōu)選

根據(jù)對上述單因素考察結果的分析，以影響醇提工藝主要因素乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取時間（C）、提取次數(shù)（D）為考察因素，以各藥材有效成分轉移率及得膏率的總得分為評價指標，通過4 因素3 水平的正交試驗L9（34）進一步研究提取最佳條件。正交因素水平表見表7。按設計的正交試驗表進行試驗，測定各藥材有效成分的轉移率及得膏率，并根據(jù)“2.3”項下基于AHP 確立的Wi分別計算出各正交試驗的總得分，總得分（M）=0.342 9×蛇床子素轉移率+0.171 4×細辛脂素轉移率+0.171 4×紫花前胡苷轉移率+0.114 3×羥基紅花黃色素A 轉移率+0.114 3×人參皂苷Rg1轉移率+0.085 7×得膏率，正交試驗結果見表8。

表7 L9（34）正交試驗因素水平表

表8 正交試驗各成分轉移率及綜合評分結果

對上述正交實驗結果進行直觀分析和方差分析，最佳提取工藝為A2B2C2D3，料液比（R 值最?。┳鳛榉讲罘治稣`差項，結果顯示，各因素影響差異無統(tǒng)計學意義。見表9。

表9 正交試驗的方差分析

2.5 驗證試驗

為驗證祛風消痛噴霧劑提取工藝的穩(wěn)定性，對優(yōu)選出的提取條件A2B2C2D3 進行驗證試驗，結果顯示，3 組驗證實驗總得分的RSD 為2.33%，表明該提取工藝穩(wěn)定可靠，可用于工業(yè)生產(chǎn)。結果見表10。

表10 工藝驗證試驗轉移率和綜合評分結果

3 討論

三七屬于貴重藥材，其質堅硬，不粉碎難以提取有效成分，因此在單因素考察過程中采用最粗粉，但提取轉移率未達到80%以上，后續(xù)特對三七粉碎粒度進行了考察。參照上述醇提因素，以三七最粗粉、粗粉、中粉粒度考察，檢測其人參皂苷Rg1，結果表明三種粉碎粒度轉移率基本接近，三七粉碎度對提取轉移率無明顯影響，因此，在本處方提取過程中，選用三七最粗粉即可。羌活中異歐前胡素加熱提取后，含量明顯下降，是因為異歐前胡素在加熱回流過程中，在酸性條件下發(fā)生了麥氏重排，轉變了結構接近的其他香豆素類成分［7］，經(jīng)過查閱文獻，紫花前胡苷為香豆素成分，具有鎮(zhèn)痛作用，因此提取工藝中采用紫花前胡苷轉移率作為指標成分之一。

本研究在單因素試驗的基礎上，以提取影響較大的四個因素乙醇濃度、料液比、提取時間和提取次數(shù)進行正交試驗考察，根據(jù)該制劑的特點及臨床療效，以祛風消痛噴霧劑處方中的獨活、羌活、細辛、三七、紅花的主要有效成分含量及得膏率為評價指標，結合該方中君臣佐使配伍關系，根據(jù)各藥材間的重要性差異確定其有效成分的權重系數(shù)，采用正交試驗結合層次分析法，對祛風消痛噴霧劑的提取條件進行了研究，確定最佳提取條件，即加入10 倍體積的70%乙醇提取，提取3 次，每次1.5 h，提高了處方中各藥材有效成分的含量，并就此工藝參數(shù)進行了試驗驗證，結果表明基于AHP 確立的提取工藝穩(wěn)定、可靠，有效成分提取完全，應用層次評分法進行評價，更客觀、科學地評價祛風消痛噴霧劑的提取工藝。需要特別指出的是，乙醇提取之后細辛脂素轉移率超過100%，是由于在加熱回流過程中，甲基丁香酚等有毒成分有可能轉換成細辛脂素，且有研究報道，加熱時間越長，越有助于細辛脂素的溶出［8-9］，因此細辛久煎后細辛脂素含量顯著增大。