西樂(lè)葆對(duì)重癥肺炎小鼠ANXA1/FPR2通路及炎癥反應(yīng)的影響

陳少英 晏平陳貴斌蔣敏鐘智成張志文（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，廣州 520120）

肺炎是最常見(jiàn)的傳染性呼吸道疾病，具有很高的發(fā)病率和病死率，特別是在兒童和老年人中，伴有發(fā)燒、咳嗽、呼吸急促、胸痛等非典型的臨床癥狀，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致呼吸衰竭和心力衰竭［1-3］。西樂(lè)葆又稱(chēng)塞來(lái)昔布（Celecoxib），是一種非甾體抗炎藥，常用于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。在H7N9病毒引起的重癥肺炎中發(fā)現(xiàn)，扎那米韋和塞來(lái)昔布聯(lián)合應(yīng)用可明顯改善肺部病理?yè)p傷［4］。膜聯(lián)蛋白A1（Annexin A1，ANXA1）是一種糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型蛋白，通過(guò)與G蛋白偶聯(lián)受體家族中的N-甲酰肽受體2（N-formyl peptide receptor 2，F(xiàn)PR2）作用，減輕炎癥性臨床疾病模型中的炎癥和免疫細(xì)胞激活［5］。GAVINS等［6］研究發(fā)現(xiàn)，ANXA1/FPR2系統(tǒng)在抑制LPS誘導(dǎo)的腦炎癥中具有重要作用。但目前關(guān)于該系統(tǒng)與肺炎間的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。因此本研究擬構(gòu)建肺炎克雷伯桿菌感染的小鼠重癥肺炎模型，探究西樂(lè)葆對(duì)其的藥效，以及ANXA1/FPR2系統(tǒng)所發(fā)揮的作用，為肺炎的臨床治療提供新的治療靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c小鼠120只，雌雄各半，體質(zhì)量18~22 g，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)，許可證號(hào)：SYXK（蘇）2017-0044。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于（22±2）℃，12 h光/暗循環(huán)條件下，自由進(jìn)食飲水。所有實(shí)驗(yàn)均按照廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院制定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南的指導(dǎo)方針進(jìn)行，并經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑西樂(lè)葆（塞來(lái)昔布，純度≥99%，貨號(hào)：C9180）購(gòu)自北京索萊寶生物有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：C1091）、HE染色試劑盒（貨號(hào)：C0105）購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；髓過(guò)氧化物酶（MPO）ELISA試劑盒（貨號(hào)：ab275109）、IL-6 ELISA試劑盒（貨號(hào)：ab178013）、IL-1βELISA試劑盒（貨號(hào)：ab197742）、TNF-αELISA試劑盒（貨號(hào)：ab181421）均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；ANXA1一抗（貨號(hào)：32934）、β-actin一抗（貨號(hào)：58169）及二抗（貨號(hào)：7076）購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；FPR2一抗（貨號(hào)：HPA029154）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器分析電子天平購(gòu)自德國(guó)Sartorius公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士TECAN公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司；蛋白電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 重癥肺炎小鼠動(dòng)物模型制備將培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的肺炎克雷伯桿菌稀釋呈1.5×109CFU/ml備用。將小鼠麻醉固定，在氣管內(nèi)滴注0.15 ml肺炎克雷伯桿菌液，輕輕翻轉(zhuǎn)小鼠，使菌液在小鼠肺臟內(nèi)均勻分布。若小鼠呼吸急促，動(dòng)脈血氧分 壓≤60 mmHg，X線(xiàn)檢查可見(jiàn)兩肺彌漫性滲出影，表明小鼠重癥肺炎模型建立成功［7］。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥將造模成功的100只BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組：模型組、西樂(lè)葆低劑量組、西樂(lè)葆中劑量組、西樂(lè)葆高劑量組和地塞米松組，每組20只。另設(shè)20只小鼠給予0.15 ml生理鹽水滴注為對(duì)照組。按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用藥劑量換算［4］，西樂(lè)葆低、中、高劑量組小鼠分別按照1.5 mg/kg、3 mg/kg、6 mg/kg劑量腹腔注射，地塞米松組小鼠以1.04 mg/kg劑量腹腔注射［8］。對(duì)照組和模型組小鼠給予生理鹽水，注射體積0.1 ml/10 g，1次/d，連續(xù)7 d。

1.2.3 小鼠肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù) 末次給藥24 h后，將各組小鼠麻醉處死，打開(kāi)胸腔，使用預(yù)冷的PBS對(duì)小鼠肺臟進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，收集肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）。離心回收細(xì)胞，涂片，經(jīng)Diff-Quick染色后，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行炎癥細(xì)胞分離及計(jì)數(shù)。

1.2.4 肺質(zhì)量及肺指數(shù)測(cè)定處死各組小鼠前，稱(chēng)量小鼠體質(zhì)量并記錄。收集BALF后，快速完整取出小鼠肺組織，濾紙吸干表面水分后稱(chēng)重。肺指數(shù)（%）=（肺重/體重）×100%。

1.2.5 肺水腫評(píng)估和肺組織MPO測(cè)定各組小鼠隨機(jī)選擇6只，取右肺組織，濾紙吸干表面水分稱(chēng)濕重（W），然后在60℃烘箱中烘烤48 h至恒重，稱(chēng)干重（D），計(jì)算W/D［9］。測(cè)得W/D后，將小鼠左肺組織研磨勻漿，37℃水浴15 min，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作方法檢測(cè)肺組織中MPO活性。

1.2.6 肺組織病理學(xué)檢測(cè)各組剩余6只小鼠，左肺置于4%甲醛中固定，右肺液氮速凍。左肺組織固定48 h后，脫水透明，包埋切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，分析小鼠肺組織病理學(xué)變化。

1.2.7 TUNEL法檢測(cè)各組小鼠肺組織中細(xì)胞凋亡情況利用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)小鼠肺組織細(xì)胞凋亡情況。從每組小鼠肺組織中隨機(jī)選擇5張切片，并在高倍鏡下（×400）選擇5個(gè)視野，觀察計(jì)數(shù)染色后的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.8 小鼠肺組織中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平測(cè)定取出液氮速凍的肺組織，研磨勻漿，采用ELISA試劑盒檢測(cè)肺組織勻漿中IL-6、IL-1β、TNF-α水平［10］。

1.2.9 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平提取小鼠肺組織勻漿中總蛋白，BCA法對(duì)蛋白進(jìn)行定量分析。取20μg用于SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后封閉，孵ANXA1、FPR2一抗，4℃過(guò)夜，洗膜加二抗，室溫孵育2 h，洗膜，顯色曝光，使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察，以β-actin為內(nèi)參蛋白，分析目的條帶表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)以比較各組間差異。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 西樂(lè)葆對(duì)重癥肺炎小鼠肺指數(shù)的影響如圖1所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠肺指數(shù)顯著升高（P<0.05）；西樂(lè)葆各處理組及地塞米松組小鼠肺指數(shù)顯著降低（P<0.05）。

圖1 各組小鼠肺指數(shù)比較Fig.1 Comparison of lung index of mice in each group

2.2 西樂(lè)葆對(duì)重癥肺炎小鼠肺水腫和肺組織MPO活性的影響與對(duì)照組相比，模型組小鼠肺組織W/D、MPO活性顯著升高（P<0.05）；西樂(lè)葆各處理組及地塞米松組小鼠肺組織W/D、MPO活性顯著降低（P<0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠肺水腫和肺組織MPO活性的比較Fig.2 Comparison of pulmonary edema and MPO activity of lung tissue in each group of mice

2.3 西樂(lè)葆對(duì)重癥肺炎小鼠BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)的影響與對(duì)照組相比，模型組小鼠BALF中嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增多（P<0.05）；西樂(lè)葆各處理組及地塞米松組小鼠BALF中嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)顯著降低（P<0.05，表1）。

表1 各組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)比較（±s，n=10，×104 cells/ml）Tab.1 Comparison of number of inflammatory cells in BALF of mice in each group（±s，n=10，×104 cells/ml）

表1 各組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)比較（±s，n=10，×104 cells/ml）Tab.1 Comparison of number of inflammatory cells in BALF of mice in each group（±s，n=10，×104 cells/ml）

Note：1）P<0.05 vs control group，2）P<0.05 vs model group.

Groups Control Model Celecoxib low-dose Celecoxib medium-dose Celecoxib high-dose Dexamethasone Neutrophils 0.05±0.14 3.89±0.511）2.76±0.342）1.53±0.272）0.84±0.182）1.18±0.212）Eosinophils 0.04±0.16 158.41±7.691）132.48±5.732）90.64±3.522）66.23±2.472）78.43±1.952）Lymphocytes 0.23±0.47 51.62±6.381）40.26±5.672）25.82±2.642）16.71±2.312）20.41±3.022）Macrophages 3.56±0.82 38.42±1.581）35.21±1.05 34.86±1.26 34.56±1.37 34.62±1.40

2.4 西樂(lè)葆對(duì)重癥肺炎小鼠肺組織結(jié)構(gòu)的影響對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡壁和肺泡結(jié)構(gòu)完整，無(wú)水腫現(xiàn)象；模型組肺泡大小不等，肺泡壁和肺泡隔結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔增厚，可見(jiàn)明顯充血，并伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；西樂(lè)葆各劑量組與模型組相比，肺泡壁和肺泡隔結(jié)構(gòu)得到一定程度的修復(fù)，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，且隨著西樂(lè)葆劑量增大，肺組織損傷程度降低。見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠肺組織HE染色（×200）Fig.3 HE staining of lung tissue of mice in each group（×200）

2.5 西樂(lè)葆對(duì)重癥肺炎小鼠肺組織細(xì)胞凋亡率的影響與對(duì)照組相比，模型組小鼠肺組織細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.05）；西樂(lè)葆處理組及地塞米松組小鼠肺組織細(xì)胞凋亡率顯著降低（P<0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 各組小鼠肺組織細(xì)胞凋亡比較Fig.4 Comparison of cell apoptosis in lung tissue of mice in each group

2.6 西樂(lè)葆對(duì)重癥肺炎小鼠肺組織中炎癥因子水平的影響與對(duì)照組相比，模型組小鼠肺組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著升高（P<0.05）；西樂(lè)葆處理組及地塞米松組小鼠肺組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著降低（P<0.05，表2）。

表2 各組小鼠肺組織中IL-6、IL-1β、TNF-α水平的比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of IL-6，IL-1βand TNF-αlevels in lung tissues of mice in each group（±s，n=10）

表2 各組小鼠肺組織中IL-6、IL-1β、TNF-α水平的比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of IL-6，IL-1βand TNF-αlevels in lung tissues of mice in each group（±s，n=10）

Note：1）P<0.05 vs control group；2）P<0.05 vs model group.

Groups Control Model Celecoxib low-dose Celecoxib medium-dose Celecoxib high-dose Dexamethasone IL-6/（pg·ml-1）11.86±0.72 62.57±1.591）45.83±1.132）36.18±0.942）23.64±1.052）27.55±1.122）IL-1β/（ng·ml-1）0.31±0.09 1.54±0.161）1.37±0.122）1.04±0.092）0.76±0.112）0.87±0.132）TNF-α/（ng·ml-1）0.26±0.08 1.72±0.151）1.50±0.172）1.24±0.132）0.91±0.082）1.12±0.112）

2.7 西樂(lè)葆對(duì)重癥肺炎小鼠肺組織中ANXA1、FPR2蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組相比，模型組小鼠肺組織ANXA1、FPR2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）；西樂(lè)葆處理組及地塞米松組小鼠肺組織ANXA1、FPR2蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 各組小鼠肺組織中ANXA1、FPR2蛋白相對(duì)表達(dá)水平Fig.5 ANXA1 and FPR2 protein expression levels in lung tissues of mice in each group

3 討論

肺炎是一種炎癥性疾病，其特征是包括細(xì)菌、病毒和真菌在內(nèi)的病原體下呼吸道感染［11］。眾所周知，肺炎與微生物病原體（內(nèi)毒素等）的炎癥刺激有關(guān)，是嚴(yán)重肺炎的誘因之一［12-13］。本研究利用肺炎克雷伯桿菌構(gòu)建小鼠重癥肺炎模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠肺組織肺泡壁和肺泡隔結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔增厚，可見(jiàn)明顯充血，并伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，小鼠肺指數(shù)、細(xì)胞凋亡率、W/D、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞數(shù)及IL-6、IL-1β、TNF-α水平均顯著升高，提示模型建立成功。MPO為血紅素過(guò)氧化物酶超家族的成員，主要表達(dá)于嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞［14］。MPO活性升高與機(jī)體的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激增加有關(guān)［15］。模型小鼠肺組織的MPO活性較對(duì)照組顯著升高，表明重癥肺炎小鼠的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，肺組織損傷嚴(yán)重。

西樂(lè)葆（塞來(lái)昔布）是一種COX-2選擇抑制劑，已應(yīng)用20余年，特別是作為抗炎藥物。LIU等［16］研究發(fā)現(xiàn)，西樂(lè)葆可通過(guò)抑制NF-κB活性減輕高氧支氣管肺發(fā)育不良大鼠的肺損傷。西樂(lè)葆還可降低LPS誘導(dǎo)的大鼠氣管高反應(yīng)性和肺部炎癥反應(yīng)［17］。本研究中，在西樂(lè)葆作用下，重癥肺炎小鼠肺泡壁和肺泡隔等肺組織結(jié)構(gòu)得到一定程度的修復(fù)，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，小鼠肺指數(shù)、細(xì)胞凋亡率、W/D、MPO活性及嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞數(shù)均顯著降低，表明西樂(lè)葆可減少肺炎小鼠炎癥反應(yīng)，減輕肺組織病理變化。在實(shí)驗(yàn)性骨關(guān)節(jié)小鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)，西樂(lè)葆與RA10-6聯(lián)合可明顯抑制滑膜組織中IL-6表達(dá)減輕炎癥反應(yīng)［18］。西樂(lè)葆和鋰共同用藥可減少躁狂癥動(dòng)物模型中的炎癥參數(shù)，降低IL-1β、TNF-α水平［19］。本研究中，西樂(lè)葆處理組肺組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平均顯著降低，表明西樂(lè)葆可明顯減輕肺炎小鼠肺組織的炎癥反應(yīng)。

ANXA1是一種特殊的內(nèi)源性抗炎蛋白，受糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)，已被證明在先天免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)中介導(dǎo)炎癥［20］。FPR2是一種模式識(shí)別受體，除了促炎性病原體衍生化合物外，還識(shí)別抗炎內(nèi)源性配體ANXA1［21］。ANXA1-FPR2信號(hào)軸具有主要抗炎作用，ANXA1主要通過(guò)調(diào)節(jié)FPR2誘導(dǎo)炎癥消退。ANXA1可通過(guò)FRP2促進(jìn)宿主防御，從而控制肺炎鏈球菌肺炎期間的炎癥和細(xì)菌傳播［22］。本研究在重癥肺炎小鼠肺組織內(nèi)觀察到ANXA1、FPR2蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明ANXA1、FPR2蛋白缺失可加劇小鼠炎癥反應(yīng)。在西樂(lè)葆處理后，重癥肺炎小鼠肺組織ANXA1、FPR2蛋白表達(dá)水平顯著升高，表明西樂(lè)葆可減輕重癥肺炎小鼠炎癥反應(yīng)，可能與促進(jìn)ANXA1、FPR2蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，重癥肺炎小鼠在西樂(lè)葆作用下，炎癥反應(yīng)和肺組織損傷明顯減輕，可能與激活A(yù)NXA1/FPR2信號(hào)通路有關(guān)。然而，肺炎的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，西樂(lè)葆的藥效仍有待進(jìn)一步研究。