中性粒細胞在腫瘤發(fā)生和進展中的作用研究進展①

畢艷娜 張穎 顏晰 趙連梅（河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院科研中心，石家莊 050035）

中性粒細胞是從骨髓造血干細胞發(fā)育而來，具有活躍的變形運動和吞噬功能的一類白細胞，約占白細胞總數(shù)的50%~70%，能夠抵御病原微生物入侵，在機體非特異性細胞免疫中發(fā)揮重要作用［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞與多種癌癥的不良預后密切相關，且中性粒細胞的功能在不同小鼠品系和腫瘤類型間存在顯著差異，這種因種系不同而引起的功能差異可能是導致中性粒細胞在癌癥治療中一直存在爭議的主要原因［3-5］。此外，中性粒細胞不僅能影響腫瘤進展，其分泌的IL-6、IL-8、IL-10及CXCR2還有助于良、惡性腫瘤鑒別［6］。另外，腫瘤細胞對中性粒細胞形態(tài)、功能及壽命也具有很大影響［7-8］。因此深入了解中性粒細胞與腫瘤間相互作用的特點是探索以中性粒細胞為靶點進行腫瘤免疫治療的基礎。

本文就中性粒細胞與腫瘤關系的研究進展進行綜述，旨在深刻認識中性粒細胞在腫瘤進展中的作用及以中性粒細胞為基礎的癌癥治療領域的最新研究進展，為深入研究腫瘤免疫治療提供參考。

1 腫瘤相關中性粒細胞概述

腫瘤相關中性粒細胞（tumor?associated neutro?phils，TANs）是浸潤到腫瘤微環(huán)境（tumor microenvi?ronment，TME）的中性粒細胞，既是一種重要的炎癥細胞，又能夠調(diào)控腫瘤進展［9］。越來越多證據(jù)表明，TANs具有較強的可塑性，根據(jù)TME中刺激因素的不同能夠極化為N1、N2兩種亞型，N1型中性粒細胞主要通過中性粒細胞的細胞毒性、刺激適應性免疫系統(tǒng)和Fas/Fas配體途徑增加細胞毒性，或抑制抗腫瘤免疫抑制反應從而抑制腫瘤；相比之下，N2型中性粒細胞主要通過釋放胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil ex?tracellular traps，NETs）抑制免疫應答，以及產(chǎn)生細胞因子、蛋白酶等衍生物促進腫瘤增殖、轉移和侵襲［9-11］。但TANs極化的機制尚不清楚，盡管N1、N2型中性粒細胞功能不同，但尚未能找到明確識別N1、N2型中性粒細胞的特異性標志物。據(jù)報道，TANs的兩種表型可互相轉化，當TGF-β存在或粒細胞集落刺激因子（colony-stimulating factor，G-CSF）刺激時，TME中的N2型中性粒細胞浸潤逐漸增多［12］。當阻斷IFN-Ⅰ或TGF-β時會誘導小鼠和人TANs向抗腫瘤N1型轉化［13］。上述轉化過程及TANs分型特點如圖1所示。

圖1 TANs分型Fig.1 TANs typing

中性粒細胞的可塑性主要取決于TME［5］。TME中各種刺激因子導致TANs表現(xiàn)出不同表型，因此根據(jù)中性粒細胞所處TME的不同定義中性粒細胞是研究中性粒細胞表型轉換的關鍵。雖然目前對N1和N2型中性粒細胞的研究多數(shù)為動物模型［9］，但OHMS等［14］研究證實，在體外將血液來源人中性粒細胞極化為N1和N2亞型是可行的。總之，以TANs為靶點的腫瘤免疫治療方法為傳統(tǒng)腫瘤治療開辟了新途徑。

2 中性粒細胞對腫瘤的抑制作用

2.1 中性粒細胞的細胞毒性中性粒細胞的細胞毒性是抑制腫瘤細胞增殖的關鍵［15-16］。其中，表達IgGFc受體的中性粒細胞可通過與腫瘤細胞表面IgG抗體的Fc段結合，發(fā)揮抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cyto?toxicity，ADCC）殺傷腫瘤［7，17］。據(jù)報道，中性粒細胞通過ADCC作用殺傷腫瘤細胞是通過中性粒細胞內(nèi)吞或癌細胞質(zhì)膜的主動機械性破壞導致抗體調(diào)節(jié)的癌細胞死亡，且這種吞噬作用的機制與其他免疫細胞發(fā)揮細胞毒性的作用途徑存在差異［18］。此外，抗體阻斷實驗結果表明，通過干擾免疫系統(tǒng)的負向調(diào)節(jié)信號通路CD47-SIRPA信號復合體形成可增強中性粒細胞對抗體依賴的腫瘤細胞的清除能力［18］。但目前基于抗體的癌癥治療研究尚不全面，臨床中使用的所有抗體類型均為IgG型，治療策略尚未考慮到中性粒細胞或其他免疫球蛋白類型。

中性粒細胞也可通過分泌過氧化氫（H2O2）誘導腫瘤細胞死亡并抑制其轉移［16］。其中，腫瘤細胞表達的瞬時受體2（potential melastatin 2，TRPM2）是中性粒細胞發(fā)揮毒性作用的關鍵。TRPM2通過介導Ca2+內(nèi)流促進H2O2分泌，調(diào)節(jié)中性粒細胞毒性。且當腫瘤細胞表達的TRPM2水平下降時，中性粒細胞的細胞毒性也隨之減弱［17］。GERSHKOVITZ等［19］研究發(fā)現(xiàn)，與原發(fā)腫瘤組織相比，TRPM2在循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）中表達升高，CTC更易受中性粒細胞毒性攻擊，表明中性粒細胞的細胞毒性作用是抑制腫瘤轉移的關鍵。除上述兩種機制外，中性粒細胞還能識別腫瘤表達的異常糖基化模式，發(fā)揮中性粒細胞組織蛋白酶G介導的細胞毒性作用［20］。還有研究證明，中性粒細胞發(fā)揮細胞毒性作用殺傷腫瘤可能是通過誘導其鐵死亡途徑實現(xiàn)的，且腫瘤細胞壞死和中性粒細胞浸潤形成了一個正反饋回路，最終導致腫瘤細胞大量死亡［21-22］。綜上，中性粒細胞可從多方面發(fā)揮細胞毒性作用殺傷腫瘤，但其識別腫瘤細胞的機制尚不明確。

2.2 中性粒細胞表型轉化可增強化療藥物治療效果TANs功能上的可塑性為研究腫瘤機制和攻克化療耐藥提供了契機?；熓歉鞣N人類惡性腫瘤的主要治療策略之一，但腫瘤對化療藥物產(chǎn)生原發(fā)和繼發(fā)耐藥嚴重限制了化療藥物的效果和使用范圍。研究證明，通過調(diào)控中性粒細胞表型可改善腫瘤耐藥性［23］。如肺癌和肝癌同種異體移植模型發(fā)現(xiàn)，小檗堿可選擇性抑制N2型中性粒細胞并保持N1型中性粒細胞表型，從而維持癌細胞對阿霉素的敏感性［24］。另外，TGF-β的持續(xù)存在導致TANs不斷向N2型中性粒細胞轉化，且在骨肉瘤患者體內(nèi)監(jiān)測到TGF-β表達越高，腫瘤化療效果越差，越易產(chǎn)生化療耐藥性［25-26］。因此TGF-β阻斷可能是一種潛在的重要腫瘤治療策略，據(jù)報道，通過遺傳手段去除CD4+T細胞中的TGF-β受體，小鼠體內(nèi)腫瘤生長受到明顯抑制［27］。此外，接受先天免疫訓練的小鼠體內(nèi)注射β-葡聚糖，小鼠腫瘤中TANs基因組表觀遺傳改變，促使中性粒細胞向抗腫瘤表型重新編程。進一步分析顯示，接受β-葡聚糖刺激后，小鼠體內(nèi)TANs分泌的活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平顯著提高，從而表現(xiàn)出抗腫瘤活性［23］。這種通過人為手段誘導中性粒細胞表型改變從而與化療藥物聯(lián)用抑制腫瘤的方法是臨床腫瘤免疫治療的一種新機制、新療法，前景廣闊。

2.3 其他抗腫瘤機制除細胞毒性機制外，中性粒細胞還能通過多種途徑殺傷腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞表達的IFN-Ⅰ可抑制腫瘤血管生成，是中性粒細胞的主要抗腫瘤活性機制之一［13］。另外，中性粒細胞不僅能直接作用于腫瘤細胞，還可通過影響TME中其他細胞狀態(tài)抑制腫瘤。如中性粒細胞能促進巨噬細胞產(chǎn)生IL-12，誘導T細胞進入Ⅰ型活化狀態(tài)，釋放IFN-γ，發(fā)揮抗腫瘤免疫功能［28］。最新研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞表達顆粒酶B是LipA抗腫瘤活性的關鍵［29］。此外，細胞周期是腫瘤進化和分裂的核心，中性粒細胞通過介導Fas-L信號部分調(diào)節(jié)腫瘤細胞周期蛋白表達，使腫瘤細胞增殖受到抑制［11］?？傊?，中性粒細胞可從多個角度發(fā)揮抗腫瘤活性，但目前研究主要基于體外細胞實驗和小鼠腫瘤模型，腫瘤研究相關數(shù)據(jù)相對匱乏，在臨床治療過程中需要根據(jù)腫瘤類型、腫瘤進展階段、個體水平差異進行深入研究［9］。

3 中性粒細胞對腫瘤的促進作用

中性粒細胞對腫瘤的促進作用主要表現(xiàn)為喚醒休眠的腫瘤細胞，促進腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移及新血管生成，抑制抗腫瘤免疫應答等［15］。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞發(fā)生轉移前，TME中已有大量中性粒細胞浸潤，并與TME中的間充質(zhì)細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）相互作用，導致中性粒細胞脂質(zhì)積累，為腫瘤轉移提供能量［30-31］。最近研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酸轉運蛋白2（fatty acid transport protein 2，F(xiàn)ATP2）可通過調(diào)節(jié)花生四烯酸（arachidonic acid，AA）積累和前列腺素2（prostaglandin，PG2）合成介導PMNMDSCs的免疫抑制功能［32］。以下將重點對中性粒細胞的各種促腫瘤機制進行總結。

3.1 NETs NETs是一種來源于中性粒細胞的DNA網(wǎng)狀結構，中性粒細胞在壞死或凋亡后將細胞內(nèi)DNA、組蛋白和其他功能蛋白釋放到細胞外，稱為NETs［33］。NETs最初被認為是中性粒細胞的殺菌機制之一，但隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)NETs參與多種疾病發(fā)病機制［33-34］。其中，NETs可作用于腫瘤發(fā)展的各階段，影響腫瘤增殖、轉移、血管生成、復發(fā)及腫瘤相關血栓形成［11，30，35-38］。據(jù)報道，結腸癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌和胃癌微環(huán)境中均已檢測到NETs，且NETs的數(shù)量從腫瘤組織到瘤旁組織呈逐漸下降趨勢［38-40］。

中性粒細胞釋放的NETs可包裹腫瘤細胞，保護其免受鄰近免疫細胞的影響［36］。NETs還可作為自身抗原導致癌癥相關血栓，提高血管炎癥形成概率［37］。近年關于NETs在腫瘤進展中的作用又有了新的發(fā)現(xiàn)，癌細胞表面存在的跨膜蛋白CCDC25能與NETs特異性結合，表明NETs與其他趨化因子類似，可向癌細胞趨化并與之相互作用。進一步分析發(fā)現(xiàn)，CCDC25基因敲除的細胞中NETs介導的腫瘤轉移被阻止，因此靶向CCDC25可能是預防癌細胞轉移的有力治療策略［30］。

復發(fā)是威脅癌癥患者生命的最高危險因素，引起癌癥復發(fā)的原因很多。如腫瘤細胞侵襲和轉移是原發(fā)部位腫瘤切除后癌癥復發(fā)的關鍵，是惡性腫瘤晚期進展的標志。最近在胰腺癌組織中發(fā)現(xiàn)，NETs能誘導腫瘤上皮細胞向MSC轉化，進而增強腫瘤細胞轉移和侵襲能力［38］。喚醒處于休眠期的癌細胞也是導致癌癥復發(fā)的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)，除中性粒細胞本身外，中性粒細胞釋放的NETs也能激活處于休眠狀態(tài)的癌細胞，且存在多種激活途徑。如NETs可將中性粒細胞分泌的彈性蛋白酶（elastase，NE）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metallo?proteinases，MMP-9）集中于層黏連蛋白順序切割并產(chǎn)生一個表位，從而激活癌細胞［15］。因此通過阻斷NETs抑制癌細胞激活、轉移及侵襲是防止癌癥復發(fā)的有效方法。但NETs形成的標志物和如何阻斷NETs尚不明確，是中性粒細胞研究領域的重點。

3.2 免疫抑制腫瘤發(fā)展大致可分為三個階段：①腫瘤清除階段；②腫瘤平衡階段；③腫瘤逃逸階段。腫瘤免疫逃逸是指腫瘤細胞通過多種作用機制逃避機體免疫系統(tǒng)的識別和攻擊，是腫瘤在體內(nèi)生存的主要原因之一［9-10］。目前，關于腫瘤免疫抑制機制的研究主要集中于對T細胞功能的抑制［41］。中性粒細胞高表達并分泌誘導型一氧化氮合酶（in?ducible nitric oxide synthase，iNOS）和精氨酸酶，是導致T細胞抑制的主要機制［42］。此外，中性粒細胞介導的PD-L1/PD-1通路可通過多種方式抑制T細胞活性，誘發(fā)腫瘤免疫逃逸。如ZHANG等［43］和YEO等［44］發(fā)現(xiàn)，小鼠腦轉移細胞中表觀遺傳修飾相關蛋白EZH2在Y696位點發(fā)生磷酸化修飾后，EZH2的功能將轉變?yōu)樵黾觕-JUN表達的轉錄因子，而c-JUN通過上調(diào)G-CSF等致癌炎癥細胞因子，將過表達PD-L1的免疫抑制性中性粒細胞招募至腦內(nèi)促進腫瘤細胞轉移。另外，研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者體內(nèi)中性粒細胞GM-CSF-PD-L1和HMGB1-STAT3-PD-L1信號通路激活均能誘導中性粒細胞PD-L1高表達［45］。

臨床上抗PD-L1免疫治療通過抑制T細胞作用于惡性腫瘤細胞雖已取得了一定療效，但這種療法并不能適用于所有癌癥患者，還存在許多尚未解決的問題，包括非淋巴系免疫細胞的作用機制和可能的前導功能。研究證實，抗PD-1免疫治療可通過T淋巴細胞參與以外的機制作用于惡性腫瘤細胞。以中性粒細胞機制作為抗PD-L1免疫治療的靶點，具有潛在細胞毒性作用，是針對PD-L1/PD-1信號通路進行腫瘤免疫治療的一個新切入點［46］。

3.3 中性粒細胞衍生物

3.3.1 蛋白酶中性粒細胞可分泌多種蛋白酶，其中，對促進腫瘤進展起關鍵性作用的主要是NE和MMPs［47-48］。NE是中性粒細胞分泌的活性最高、含量最多的蛋白酶，也是中性粒細胞功能的主要貢獻者［48-49］。小鼠體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，中等濃度的NE（40~80 nmol/L）可誘導肺腺癌細胞增殖，而過量的NE則介導肺腺癌細胞死亡［50］。在癌癥背景下，NE可通過維持腫瘤表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）活性促進腫瘤細胞轉移，也能通過蛋白裂解作用降解組織中的多種蛋白，加重組織破壞，直接或間接導致腫瘤細胞發(fā)生和轉移［51-54］。此外，中性粒細胞分泌的NE可進入肺腺癌細胞內(nèi)部并影響肺腺癌細胞信號傳導，通過激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）通路促使腫瘤細胞增殖［55］。

中性粒細胞是TME及血管生成前組織中MMP-9的主要來源［25，48-49］。MMP-9可導致細胞外基質(zhì)（ex?tracellular matrix，ECM）重構、組織學屏障破壞及腫瘤血管生成［56-57］。通?；|(zhì)細胞在分泌MMP-9同時，還會釋放其抑制分子——金屬蛋白酶組織抑制物（tissue inhibitors of matrixmetallo proteinases，TIMPs），但TANs僅釋放MMP-9卻不表達TIMP-1，失去TIMP-1抑制的MMP-9更易促進腫瘤血管生成［47］。最近研究發(fā)現(xiàn)，與單體相比，MMP-9三聚體更能有效地受到局部TIMP-1抑制，MMP-9三聚體更能促進腫瘤進展［56］。此外，中性粒細胞分泌的MMP-9可通過調(diào)節(jié)整合素維持癌細胞侵襲性［55］。

3.3.2 細胞因子中性粒細胞可表達多種與腫瘤進展相關的細胞因子（表1）。中性粒細胞釋放的大多數(shù)細胞因子是CTC利用中性粒細胞增強其轉移能力的主要來源，當這些細胞因子釋放被阻斷后，中性粒細胞促瘤能力也隨之減弱［58］。以IL-17為例，研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞是IL-17的主要來源，也是介導IL-17對T細胞增殖抑制的基礎［49，59］。中性粒細胞分泌的IL-17能激活癌細胞JAK2/STAT3信號通路，導致胃癌細胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉化促進胃癌轉移［60］。此外，中性粒細胞分泌的IL-17也參與了癌變及血管生成過程［61］。

表1 TANs分泌的與腫瘤進展過程相關的細胞因子Tab.1 Cytokines from TANs related to tumorigenesis development

3.3.3 ROS中性粒細胞表達的ROS對腫瘤進展存在雙重影響，一方面ROS通過氧化損傷表現(xiàn)出細胞毒性作用殺傷腫瘤細胞，另一方面ROS通過介導遺傳毒性效應導致DNA損傷和腫瘤形成［62］。低水平的ROS是促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展的信號分子，高水平的ROS則導致腫瘤細胞死亡［8］。體外實驗表明，利用蝦青素上調(diào)星形膠質(zhì)細胞瘤ROS水平，可觸發(fā)大量癌細胞凋亡［52］。另外，癌細胞中維持有效的氧化還原平衡狀態(tài)可保護腫瘤細胞免受氧化應激損傷，但這種氧化還原平衡一旦破壞，中性粒細胞內(nèi)ROS含量會隨之增加導致腫瘤細胞生長受到抑制［63-65］。此外，ROS表達是中性粒細胞調(diào)節(jié)NK細胞和腫瘤細胞相互作用的重要機制［42］?？偟膩碚f，ROS的雙重效應可作為腫瘤治療手段達到抑制腫瘤的目的。

越來越多的證據(jù)表明，外周血中性粒細胞與淋巴細胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）可全面反映癌癥患者炎癥和免疫狀態(tài)［66-70］。另外，一項回顧性分析發(fā)現(xiàn)，外周血NLR和卵巢內(nèi)NLR（iNLR）同時升高提示食管癌患者遠期預后不良，表明NLR和iNLR聯(lián)合檢測是預測患者不良預后的可靠預后標志物［71］。中性粒細胞作為腫瘤治療潛在靶點具有廣闊應用前景。

4 中性粒細胞與腫瘤的相互作用

大量實驗表明，腫瘤細胞與中性粒細胞間存在雙向作用［72］。如胃癌來源外泌體能刺激中性粒細胞激活并分泌大量細胞因子，相反，中性粒細胞及其分泌的細胞因子又作用于腫瘤促進其增殖遷移。另外，腫瘤來源外泌體可通過抑制中性粒細胞凋亡提高中性粒細胞存活率［73］。一項體外實驗發(fā)現(xiàn)，前列腺癌可激活骨源性中性粒細胞，而中性粒細胞對前列腺癌卻具有細胞毒性作用，導致前列腺癌細胞死亡，說明增強骨中性粒細胞的細胞毒作用可能為骨轉移性前列腺癌提供新的治療選擇［74］。

5 結語

腫瘤免疫治療是繼手術、放療、化療、靶向治療的第五類治療方法，為腫瘤患者帶來了新的希望，曾被預言為腫瘤的“終結者”，近年免疫檢查點抑制劑，包括CTLA4抗體、PD-1抗體、PD-L1抗體等，以及基于免疫細胞的CAR-T、TCR-T等新技術，在臨床研究及應用中取得了令人振奮的成績，但針對實體腫瘤晚期患者的一線和二線抗腫瘤免疫治療效果均不理想，即便是已用于實體瘤的免疫檢測點抑制劑也僅有20%左右患者能長期獲益。TME的復雜性是免疫治療效果局限的主要原因。中性粒細胞有望成為抗癌免疫治療的新靶點，但并不是對所有癌癥轉移均有效果，未來需進一步研究中性粒細胞治療對哪些癌癥或癌癥亞型有效。精準治療策略引導下的個體化治療是腫瘤防治的必然趨勢，因此有必要對患者進行更詳細的腫瘤分子分型和免疫分型，以確定其對哪種腫瘤治療策略產(chǎn)生更有效的反應。另外，了解中性粒細胞如何發(fā)生極化，其功能表型與其他細胞亞群有何聯(lián)系，探討保留中性粒細胞抗腫瘤功能的同時如何特異性靶向促進腫瘤發(fā)展的中性粒細胞亞型均是未來抗癌免疫的研究方向。總之，中性粒細胞與腫瘤間調(diào)節(jié)的分子機制十分復雜，更好地理解中性粒細胞與腫瘤的相互作用特性是開發(fā)新的腫瘤療法的前提和關鍵。