IL-6基因多態(tài)性與環(huán)境因素對(duì)原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的交互影響①

楊麗萍 毛寶宏 劉倩 王燕俠 李靜 代志蓉 李亞梅④

（甘肅省中醫(yī)院公共衛(wèi)生與醫(yī)院感染管理處，蘭州730050）

復(fù) 發(fā) 性 流 產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指在妊娠28周之前有2次以上的胎兒丟失，影響著2%~5%的育齡期女性［1］。RSA在臨床上缺乏特異性且致病原因復(fù)雜，主要與遺傳、解剖、內(nèi)分泌、感染、免疫、環(huán)境等因素密切相關(guān)，目前仍有50%的RSA患者原因未明［2］。有研究表明，Th1/Th2細(xì)胞平衡對(duì)母體免疫耐受和妊娠維持至關(guān)重要［3］。單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子在脂質(zhì)代謝、凝血、胰島素抵抗等方面的多功能作用均與原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）有關(guān)，而IL-6作為T(mén)h2細(xì)胞因子，在促進(jìn)胚胎著床、下調(diào)細(xì)胞免疫反應(yīng)以及維持妊娠方面具有重要意義［4］。盡管?chē)?guó)內(nèi)外已有部分研究涉及IL-6基因多態(tài)性與URSA的關(guān)系，但研究結(jié)論尚不一致，且未進(jìn)行環(huán)境-基因交互作用分析［5-6］。因此，本研究采用病例對(duì)照的研究方法，探討甘肅蘭州地區(qū)育齡期女性IL-6相關(guān)基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleo?tide polymorphism，SNP）及環(huán)境危險(xiǎn)因素與URSA的遺傳易感性，以期為臨床基因篩查和預(yù)防策略的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對(duì)象以2019年1月至2020年8月在甘肅省婦幼保健院復(fù)發(fā)性流產(chǎn)門(mén)診就診的150例URSA患者為病例組，入選標(biāo)準(zhǔn)：①因胚胎停止發(fā)育導(dǎo)致2次及2次以上URSA者；②甲狀腺激素、胰島素、性激素等內(nèi)分泌檢查正常；③月經(jīng)周期及排卵正常；④生殖系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)正常且無(wú)細(xì)菌、支原體、病毒等感染者；⑤免疫學(xué)相關(guān)抗體篩查（抗心磷脂抗體、抗核抗體、抗甲狀腺球蛋白抗體、抗β2-糖蛋白Ⅰ抗體）正常；⑥丈夫精液分析正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有甲狀腺及肝腎功能性疾病者；②凝血功能異常者；③染色體及生殖系統(tǒng)異常者；④其他由遺傳、免疫、感染等因素導(dǎo)致的流產(chǎn)。選取同期在本院體檢的150例健康女性為對(duì)照組，入選標(biāo)準(zhǔn)：①至少成功分娩過(guò)1胎的育齡期女性；②無(wú)RSA及死胎、死產(chǎn)史；③生殖系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)正常且無(wú)遺傳、內(nèi)分泌異常和感染。

1.1.2 主要試劑與儀器全自動(dòng)核酸純化儀HF16 Plus［愷碩生物科技（廈門(mén)）有限公司］；2720型PCR擴(kuò)增儀（ABI）；蝦堿酶（Promega）；外切酶Ⅰ（Epicentre）；SNaPshot Multiplex Kit（ABI）；FR-110紫外分析儀、FR-250電泳儀（上海復(fù)日科技有限公司）；凝膠成像儀（上海培清科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 基線(xiàn)調(diào)查方法經(jīng)甘肅省婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后，研究對(duì)象在自愿參與的基礎(chǔ)上，由統(tǒng)一培訓(xùn)的專(zhuān)職醫(yī)務(wù)人員以面對(duì)面詢(xún)問(wèn)的形式現(xiàn)場(chǎng)填寫(xiě)調(diào)查表，獲取一般人口學(xué)特征、生理生育史、環(huán)境暴露史及相關(guān)生活行為特征。同時(shí)采集每位研究對(duì)象外周血3 ml，于2 h內(nèi)入庫(kù)深低溫（-80℃）儲(chǔ)存。

1.2.2 DNA提?、僭?.0 ml樣品管內(nèi)加入40μl蛋白酶K溶液（10 mg/ml），再加入400μl解凍后的全血樣本進(jìn)行預(yù)處理；②嚴(yán)格按照相關(guān)操作步驟，利用全自動(dòng)核酸純化儀HF16 Plus及其配套試劑盒進(jìn)行全自動(dòng)DNA提??；③使用分光光度計(jì)檢測(cè)提取DNA濃 度 和 純 度，DNA濃 度>20 ng/μl表 明 提 取成功。

1.2.3 基因分型本研究采用SNaPshot多重SNP分型技術(shù)對(duì)rs1800796位點(diǎn)進(jìn)行基因分型檢測(cè)。SNaPshot多重SNP分型技術(shù)由美國(guó)應(yīng)用生物公司（ABI）開(kāi)發(fā)的一種基于熒光標(biāo)記單堿基延伸原理的分型技術(shù)，也稱(chēng)小測(cè)序，主要用于中等通量的SNP分型，其優(yōu)勢(shì)為分型準(zhǔn)確、通量高、檢測(cè)速度快，且不受樣本個(gè)數(shù)與SNP位點(diǎn)多態(tài)性特性限制。引物用在線(xiàn)Primer3軟件設(shè)計(jì)（http：//bioinfo.ut.ee/prim?er3-0.4.0/），引物序列及長(zhǎng)度見(jiàn)表1。具體基因分型過(guò)程如下：①PCR擴(kuò)增：在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，程序如下：95℃2 min；94℃20 s，65℃（-0.5℃/循環(huán)）40 s，72℃1.5 min，11個(gè)循環(huán)；94℃20 s，59℃30 s，72℃2 min，24個(gè)循環(huán)；72℃2 min。將5 U蝦堿酶和2 U外切酶Ⅰ加入10μl PCR產(chǎn)物中，37℃溫浴1 h，然后75℃滅活15 min進(jìn)行純化。②SNaPshot多重單堿基延伸反應(yīng)：延伸反應(yīng)體系（10μl）包括5μl SNaPshot Multiplex Kit（ABI），2μl純化后多重PCR產(chǎn)物，1μl延伸引物混合物，2μl超純水。程序如下：96℃1 min；96℃10 s，55℃5 s，60℃30 s，28個(gè)循環(huán)。然后在10μl延伸產(chǎn)物中加入1 U SAP酶，37℃溫浴1 h，75℃滅活15 min進(jìn)行純化。③測(cè)序檢測(cè)：取0.5μl純化后的延伸產(chǎn)物，與0.5μl Liz120 SIZE STANDARD、9μl Hi-Di混勻，95℃變性5 min后用ABI3730XL測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序儀上收集的原始數(shù)據(jù)用GeneMapper 4.1軟件進(jìn)行分析。

表1 擴(kuò)增的SNP引物序列Tab.1 Primer sequence of amplified SNP

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以SAS9.4軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用χ2檢驗(yàn)完成組間一般特征分布及Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)。利用非條件Logis?tics回歸模型分析IL-6基因SNP位點(diǎn)及環(huán)境因素與URSA的關(guān)系?；诓嫔治龇ㄓ孟喑私换プ饔媚Ｐ吞接懎h(huán)境-基因交互作用對(duì)URSA的影響。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α取值0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況本研究共納入研究對(duì)象300例，其中URSA組150例，對(duì)照組150例。經(jīng)均衡性檢驗(yàn)，兩組在年齡、文化程度、家庭人均月收入、居住地、工作類(lèi)別等方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），URSA人群文化程度與家庭人均月收入普遍較低，以農(nóng)村人口居多，且多數(shù)從事中度以上體力勞動(dòng)，詳見(jiàn)表2。

表2 研究對(duì)象一般特征分布［例（%）］Tab.2 Distribution of basic characteristics of study population［n（%）］

2.2 IL-6基因rs1800796位點(diǎn)基因多態(tài)性與URSA易感性的關(guān)聯(lián)經(jīng)檢驗(yàn)，兩組人群IL-6基因rs1800796位點(diǎn)基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（P<0.05）。在共顯性模型中，與CC基因型相比，攜帶GC基因型女性發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)增加1.91倍（OR=1.91，95%CI：1.09~3.36），攜帶GG基因型女性發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)增加1.54倍（OR=1.54，95%CI：1.02~2.34）。顯性遺傳模型分析顯示，與未攜帶G等位基因女性相比，攜帶G等位基因發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)增加2.03倍（OR=2.03，95%CI：1.18~3.47）。隱性遺傳模型分析顯示，組間基因型分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。按流產(chǎn)次數(shù)進(jìn)一步進(jìn)行分層分析，結(jié)果顯示在共顯性遺傳模型、顯性遺傳模型及隱性遺傳模型中，G等位基因攜帶者均不增加2次RSA的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（OR=1.44，95%CI：0.92~2.26；OR=2.05，95%CI：0.95~3.47；OR=1.49，95%CI：0.68~3.26），但顯著增加3次以上RSA的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)（OR=2.46，95%CI：1.17~5.13；OR=2.15，95%CI：1.17~3.61；OR=2.15，95%CI：1.10~8.97），見(jiàn)表3。

表3 rs1800796位點(diǎn)SNP與URSA易感性的關(guān)系Tab.3 Association between rs1800796 SNP and risk of URSA

2.3 IL-6基因rs1800796位點(diǎn)基因多態(tài)性與URSA易感性的分層分析分別以年齡、工作屬性、吸煙（包括主動(dòng)和被動(dòng)）、環(huán)境高危因素進(jìn)行分層分析，結(jié)果顯示在高齡、重體力勞動(dòng)、吸煙（包括主動(dòng)和被動(dòng)）、接觸環(huán)境高危因素女性中，G等位基因攜帶者發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)分別增加3.96倍（OR=3.96，95%CI：1.17~12.47）、4.98倍（OR=4.98，95%CI：1.38~15.98）、1.86倍（OR=1.86，95%CI：1.19~2.92）與1.89倍（OR=1.89，95%CI：1.28~2.77）。同樣，顯性及隱性遺傳模型分析中，得到類(lèi)似的研究結(jié)果，見(jiàn)表4。

表4 rs1800796位點(diǎn)SNP與環(huán)境相關(guān)因素對(duì)URSA易感性的分層分析Tab.4 Stratified analysis on association between rs1800796 SNP and environmental risk factors and risk of URSA

2.4 IL-6基因rs1800796位點(diǎn)基因多態(tài)性與環(huán)境因素的交互作用分析叉生分析顯示，吸煙（包括主動(dòng)和被動(dòng)）、接觸環(huán)境高危因素且攜帶GC+GG基因型女性并未增加URSA的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)（OR=1.29，95%CI：0.98~1.69；OR=1.23，95%CI：0.99~2.98），但進(jìn)一步代入相乘交互作用模型分析顯示，吸煙（包括主動(dòng)和被動(dòng)）且攜帶GC+GG基因型女性發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)增加1.96倍（OR=1.96，95%CI：1.15~3.35）。接觸環(huán)境高危因素且攜帶GC+GG基因型女性 發(fā) 生URSA的 風(fēng) 險(xiǎn) 增 加2.18倍（OR=2.18，95%CI：1.29~3.68）。同理，從事重體力勞動(dòng)且攜帶GC+GG基因型女性發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)增加3.27倍（OR=3.27，95%CI：1.98~5.40），見(jiàn)表5。

表5 rs1800796位點(diǎn)SNP與部分環(huán)境因素的交互作用Tab.5 Analysis of interaction between environmental factors and rs1800796 SNP on risk of URSA

3 討論

URSA病因復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確，是目前生殖健康領(lǐng)域面臨的重點(diǎn)與難點(diǎn)問(wèn)題，嚴(yán)重影響著我國(guó)育齡期女性的生殖健康。母胎界面存在獨(dú)特的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，各因子之間的平衡及免疫調(diào)節(jié)對(duì)維持正常妊娠至關(guān)重要。有研究顯示，一定程度的炎癥反應(yīng)能促進(jìn)維持正常妊娠，但過(guò)度炎癥反應(yīng)又可導(dǎo)致胚胎著床失敗，引起URSA的發(fā)生，故母胎界面的免疫失衡在URSA的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用［7-9］。

人類(lèi)IL-6基因位于染色體7p15~21區(qū)域，由4個(gè)內(nèi)含子和5個(gè)外顯子組成。IL-6是白介素家族中的一種多肽類(lèi)促炎細(xì)胞因子，是機(jī)體復(fù)雜細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成員，主要在急性炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)及C反應(yīng)蛋白急性期的蛋白調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用，是一類(lèi)調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡的重要細(xì)胞因子［10-11］。有研究表明，URSA患者外周血中IL-6細(xì)胞因子水平與健康人群間存在顯著性差異，并指出IL-6基因rs1800796位點(diǎn)基因多態(tài)性可能增加了URSA的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，但其結(jié)論尚不一致［5-6，12-13］。本研究顯示，IL-6基因rs1800796位點(diǎn)攜帶G等位基因的育齡期女性發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)增加2.03倍，發(fā)生3次以上URSA的風(fēng)險(xiǎn)增加2.15倍。也有研究表明，IL-6基因參與蛻膜調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞中STAT3的磷酸化過(guò)程，而STAT3過(guò)度磷酸化會(huì)損害細(xì)胞的增殖，抑制Treg細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，影響母胎免疫耐受及胚胎植入，這可能是發(fā)生URSA的病理基礎(chǔ)［8］。

環(huán)境是人類(lèi)生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，在人類(lèi)長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，已逐漸對(duì)生態(tài)環(huán)境的變化做出了適應(yīng)和改造，形成一種動(dòng)態(tài)的過(guò)程平衡，而一旦這種平衡被打破將導(dǎo)致URSA等不良妊娠結(jié)局的發(fā)生［14］。有研究顯示，工作或生活環(huán)境中接觸過(guò)量苯、甲苯、甲醛等空氣污染物會(huì)引起胚胎毒性導(dǎo)致流產(chǎn)［15］；接觸環(huán)境鉛、砷、汞等重金屬化合物可干擾正常妊娠的內(nèi)分泌狀態(tài)，導(dǎo)致胚胎丟失［16］；接觸殺蟲(chóng)劑、化肥、增塑劑等合成化學(xué)品后改變體內(nèi)氧化應(yīng)激與免疫平衡狀態(tài)，引發(fā)自然流產(chǎn)。本研究顯示，G等位基因攜帶者中，接觸環(huán)境高危因素的育齡女性發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)增加1.89倍；吸煙（包括主動(dòng)和被動(dòng)）女性發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)增加1.86倍。進(jìn)一步進(jìn)行環(huán)境-基因交互作用分析顯示，接觸環(huán)境高危因素且攜帶GC+GG基因型育齡女性發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)增加2.18倍；從事重體力勞動(dòng)且攜帶GC+GG基因型女性發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)增加3.27倍。說(shuō)明環(huán)境高危因素及重體力勞動(dòng)分別與rs1800796位點(diǎn)基因多態(tài)性存在正向協(xié)同的交互作用，提示URSA病因復(fù)雜，環(huán)境與遺傳因素在其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中均發(fā)揮了非常重要的作用。

總之，IL-6基因表達(dá)產(chǎn)物在孕早期胚胎植入與胎盤(pán)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，其rs1800796位點(diǎn)的基因突變可能會(huì)改變母胎界面相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平，破壞調(diào)控平衡，造成妊娠丟失［17］，但它們?nèi)绾斡绊懞驼{(diào)節(jié)相關(guān)趨化因子的表達(dá)，還需要進(jìn)一步的探究。另外，環(huán)境-基因交互作用分析顯示，孕早期接觸環(huán)境高危因素、吸煙（包括主動(dòng)和被動(dòng)吸煙）、重體力勞動(dòng)均與IL-6基因rs1800796位點(diǎn)基因突變存在相乘的交互作用。說(shuō)明URSA是由環(huán)境和遺傳因素共同影響的復(fù)雜性疾病，在今后的研究中應(yīng)進(jìn)一步結(jié)合環(huán)境因素-內(nèi)表型-基因進(jìn)行交互分析，這將有助于從更廣泛的角度去闡明URSA的病理機(jī)制。