CAR-T 細胞療法中細胞因子釋放綜合征的研究進展

于肖肖，沈永明

（天津市兒童醫(yī)院檢驗科，天津 300134）

嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）-T 細胞療法作為一種治療癌癥的新型療法受到了廣泛關注，該療法的原理是利用患者自身的T 淋巴細胞在體外修飾后回輸?shù)交颊唧w內來達到清除腫瘤細胞的目的。CAR-T 細胞表面的“定位導航”CAR 結合腫瘤相關抗原后，細胞被激活并釋放一系列的毒性分子（穿孔素、顆粒酶、TNF-ɑ 等）誘導腫瘤細胞死亡。從第一代CAR-T 細胞到第四代CAR-T 細胞，逐步提高了CAR-T 細胞在體內更持久的作用活性。與傳統(tǒng)抗腫瘤療法相比，CAR-T 免疫療法具有特異性高、起效快、緩解率高、療效持久等特點。盡管CAR-T 細胞療法在血液系統(tǒng)腫瘤的治療過程中表現(xiàn)出了巨大的潛力，但是在實際應用過程中仍有很多難題需要解決。疾病治療除了關注療效外，亦要關注治療過程中的毒副作用，CAR-T 細胞療法在治療過程中最常見的且最嚴重的副作用是細胞因子釋放綜合征。在即將到來的聯(lián)合免疫治療時代，為擴大免疫治療的應用范圍，對CRS 的正確認知及處理變得至關重要。CAR-T 細胞療法與常規(guī)的生物療法不同，它是一種活的T 細胞治療藥物，如何降低治療過程中產(chǎn)生的毒副作用是目前亟待解決的難題。本文主要對CAR 的結構、CRS 的概念及分級、CRS 發(fā)生機制及藥物管理、CAR 結構的優(yōu)化作一綜述，通過這些策略，未來的CAR-T 細胞療法將有效降低CRS 產(chǎn)生，使患者得到更好的治療效果，有望為臨床提供有效的預防和管理策略，以提高這種療法的安全性并擴大其應用范圍。

1 CAR 的結構

CAR 主要由胞外抗原識別段、跨膜段、胞內信號傳導域三部分組成[1]。胞外抗原識別段通常是來源于單克隆抗體抗原結合區(qū)域的scFv 段，可以特異性識別腫瘤相關抗原?？缒ざ螌τ谡麄€受體的穩(wěn)定性是必需的。胞內信號傳導域通常是CD3ζ，可以將激活信號傳遞給T 細胞。CD3ζ 可能無法提供完全有效的激活信號，因此需要共刺激信號。例如，CD28和4-1BB 可以與CD3ζ 一起使用以傳遞增殖/活化信號，或者將三者一起串聯(lián)使用。此外，CAR 可以將細胞外抗原識別結構域與細胞內信號分子之間建立聯(lián)系，而細胞內信號分子又可以激活T 細胞，從而發(fā)揮免疫治療作用。

2 CRS 的概念及分級

CRS 是一種因免疫細胞被激活并釋放大量細胞因子而引發(fā)的嚴重的全身炎癥反應綜合征，臨床表現(xiàn)以發(fā)熱和多器官功能障礙為特征。CRS 一般出現(xiàn)在CAR-T 細胞與腫瘤細胞抗原結合作用的過程中，大量細胞因子（例如IFN-y、TNF-α、IL-6 等）被釋放，這些細胞因子又會引發(fā)進一步的連鎖反應，激活宿主免疫細胞，最終導致CAR-T 細胞和內源性免疫細胞共同釋放大量細胞因子，引起過度炎癥反應、毛細血管滲漏、凝血級聯(lián)反應等一系列不良反應，進而導致器官受損和腦腫脹，最終危及生命[2]。美國移植和細胞治療學會（ASTCT）在2019 年發(fā)表了關于CRS 分級共識指南指出，發(fā)熱≥38℃是CRS分級的必要條件，根據(jù)低血壓和缺氧的嚴重程度，CRS 被分為1～4 級，大于3 級即認為是嚴重的CRS，1 級定義為伴有或不伴有全身癥狀的發(fā)熱（≥38℃）；2 級定義為發(fā)熱（≥38℃），伴有低血壓但不需要血管升壓藥，同時伴有缺氧，需要使用低流量鼻導管（≤6 L/min）或面罩給氧；3 級定義為發(fā)熱（≥38℃），伴有低血壓，需要一種升壓藥加用或不加抗利尿激素，同時伴有缺氧，需要高流量鼻導管或面罩給氧；4 級定義為發(fā)熱（≥38℃），伴有低血壓，需要多種升壓藥（抗利尿激素除外），同時伴有缺氧，需要正壓呼吸（CPAP、BiPAP、氣管插管、呼吸機）。這個分級系統(tǒng)已在臨床研究中證實可對臨床CRS 的嚴重程度進行準確，客觀和可具有重復性的評估[3]。Alvi RM 等[4]對接受商業(yè)CAR-T（Yescarta 或Kymriah）以及其他非商業(yè)CAR-T 細胞治療的患者進行研究，有59%的患者在回輸2～7 d 后發(fā)生CRS，其中39%為2 級，4%為3 級及以上。而在其他臨床研究中CAR-T 治療引起的CRS 也并不少見。

3 CRS 的發(fā)生機制及藥物管理

CAR-T 細胞療法在腫瘤治療中的應用日益增加，CRS 的預防與緩解仍是CAR-T 細胞治療中科研工作者關注的焦點之一，或許在CRS 發(fā)生機制的多個環(huán)節(jié)進行干預可有效緩解CRS，提高其對更廣泛癌癥的安全性和有效性。大量研究表明[5-7]，內源性單核細胞和巨噬細胞在CAR-T 細胞治療過程中是引起CRS 的主要細胞，靶向巨噬細胞將是提高安全性的潛在策略之一。而GM-CSF 作為組織急性及慢性炎癥中起最關鍵作用的細胞因子，是激活巨噬細胞的關鍵因子之一。lenzilumab（一種抗人GMCSF 單克隆抗體）能夠中和GM-CSF 的活性，抑制由GM-CSF 啟動的炎癥級聯(lián)反應。ZUMA-19 的一項臨床研究（NCT04314843）表明[8]，在CD19 CAR-T（Yescarta）細胞治療彌漫大B 細胞淋巴瘤中聯(lián)合應用lenzilumab，在推薦劑量下，患者并未出現(xiàn)嚴重的細胞因子風暴。GM-CSF 中和抗體以及靶向巨噬細胞藥物聯(lián)合使用或許能夠使CRS 得到有效的控制。

CAR-T 細胞殺傷腫瘤時，腫瘤細胞焦亡發(fā)生漲破使細胞內ATP 大量釋放至細胞外激活巨噬細胞[9，10]，使巨噬細胞釋放大量的細胞因子導致CRS 發(fā)生。有研究表明[11]，很多腫瘤細胞中GSDME（gasdermins E）過量表達。CD19 CAR-T 細胞與CD19+原發(fā)性白血病細胞一起孵育時，CD19 CAR-T細胞釋放的顆粒酶B 激活胱天蛋白酶3 后可激活GSDME，最終引發(fā)表達CD19 的腫瘤細胞發(fā)生焦亡。另有研究表明[12，13]，GSDME 水平越高，CRS 越嚴重，同時也提出了可通過藥物干預焦亡發(fā)生，降低CRS發(fā)生概率。

妥珠單抗是全球首個獲批上市的靶向IL-6R的人源化單抗，也是FDA 批準的用于CAR-T 細胞治療過程中CRS 的治療性藥物，通過抑制下游炎癥級聯(lián)中起關鍵作用的IL6-信號降低CRS[14]。皮質類固醇已被證明可通過發(fā)揮強大的非特異性抗炎作用有效解決CAR-T 細胞輸注后的CRS 癥狀[15]。而對于CRS，皮質類固醇通常用于危及生命的（3 級或4級）或托珠單抗耐藥的CRS[16，17]。然而，皮質類固醇可能會通過抑制T 細胞功能、擴張和持久性，甚至誘導T 細胞凋亡而損害抗腫瘤功效[18]。另證據(jù)表明[19]，合理的皮質類固醇劑量方案可以保持CAR-T 細胞治療的完整療效，短期使用皮質類固醇可能是可行的。在臨床實踐中，需要進一步探索優(yōu)化皮質類固醇方案，包括其劑量、時機和持續(xù)時間。達沙替尼是一種酪氨酸激酶抑制劑，通過抑制淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶的磷酸化，破壞激活域CD3zeta 的信號傳導[20]，在臨床前模型研究中，達沙替尼能迅速緩解CRS[21]，未來其可能在不影響CAR-T 細胞結構域的同時來降低CRS 發(fā)生風險。

4 CAR 結構的優(yōu)化

CAR 結構的設計與CRS 的發(fā)生也有一定的關系，進一步在源頭降低CRS 的發(fā)生成為未來CAR結構設計的焦點。利用蛋白質結構預測軟件預測CAR 融合蛋白結構以及尋找更優(yōu)的CAR 共刺激域也將是未來研究的重點之一。

臨床研究表明[22]，41BB 共刺激結構域較CD28共刺激結構域引發(fā)的CRS 的概率低。以41BB 為共刺激結構域的CD19 CAR-T 細胞在針對B 系血液腫瘤的兩項臨床研究中 CRS 發(fā)生概率NCT02435849（77%）以及NCT02030834（57%）均低于以 CD28 共刺激結構域的 CAR -T 細胞NCT02348216（93%）和NCT02601313（91%）。Ying Z等[23]通過改造CD8a 肽段，發(fā)現(xiàn)CD19-BBz（86）CAR-T 細胞的抗腫瘤效果沒有減弱，但細胞因子釋放明顯降低，且在相關臨床試驗中，25 例患者均未發(fā)生嚴重的CRS。

TALEN 和CRISPR-Cas9 等基因編輯技術已被用于設計具有GM-CSF 基因敲除的CAR-T 細胞[24-26]，從而減少促炎細胞因子（IL-6）和趨化因子（趨化因子配體2）的產(chǎn)生，通過減少對巨噬細胞的激活降低CRS 的發(fā)生。將自殺基因iCasp9 整合到CAR 結構內形成一個自殺開關，在發(fā)生CRS 時，利用小分子二聚體藥物誘導細胞迅速凋亡[27]，這種不可逆的細胞凋亡導致CAR-T 細胞治療終止，最終可能影響療效。

CAR-T 細胞傳導不依賴TCR 亞基，與腫瘤抗原接觸有強直性信號。Helsen CW 等[28]研發(fā)了一種新的嵌合受體-T 細胞抗原偶聯(lián)劑（TAC），該結構主要由3 部分組成：細胞外抗原結合域識別腫瘤抗原，細胞外anti-CD3 scfv 將TAC 分子與內源性TCR 銜接，CD4 共受體結構域將TAC 錨定在T 細胞表面并增加共受體功能。不同于CAR 結構，該結構本身沒有信號傳導功能，脫靶激活概率低，提示TAC 結構具有安全優(yōu)勢[29]。臨床前實驗表明[30]，TAC-T 細胞可以攜帶記憶T 細胞標記并有效侵入小鼠HER2+實體瘤中，但并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的CRS，同時臨床試驗也表明靶向HER2（TAC01-HER2）的TAC-T 細胞可有效控制腫瘤生長且沒有觀察到CRS 以及與免疫細胞有關的神經(jīng)毒性。另一款利用完整TCR 信號傳導的新型嵌合受體-T 細胞受體融合構建體（TRuC），它將抗原識別結構域（scfv）整合到TCR 亞基上，不需要與HLA 匹配直接激活T 細胞識別殺傷腫瘤細胞[31-34]。與常規(guī)CAR-T 細胞相比，TRuC 成為TCR 復合體的功能組成部分，在血液瘤以及實體瘤的小鼠腫瘤模型中體現(xiàn)出了表現(xiàn)出強大的抗腫瘤效果以及低細胞因子釋放，提示其未來臨床中的安全性。在Gavocel，TC-210 治療難治性間皮素臨床試驗中也初步驗證了其安全性[35]。

5 總結與展望

目前CAR-T 細胞療法在血液腫瘤治療中取得了顯著療效，因此提高其安全性，降低患者痛苦將成為未來研究焦點；且設計下一代CAR-T 細胞釋放較低的細胞因子，有效控制巨噬細胞等免疫細胞也將是解決CRS 最有潛力的方法。TAC-T 細胞以及TRuC-T 細胞技術平臺可以有效地利用T 細胞固有的TCR 亞基向下傳導信號，與普通CAR-T 細胞相比，具有在實體瘤治療中發(fā)揮天然T 細胞對腫瘤細胞的調控機制的優(yōu)點，在未來無論是在實體瘤治療中應用還是防控細胞因子的分泌都具有較好的前景。隨著研究者對CAR-T 細胞治療過程中CRS 的發(fā)生發(fā)展機制更加清晰以及基因工程技術不斷發(fā)展，未來更安全有效的CAR-T 細胞療法將很快實現(xiàn)。