RNA治療和基因編輯技術(shù)在肝臟疾病中的應(yīng)用

曾婉嘉 吳昱 陳香梅 魯鳳民

作者單位：100191 北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系暨感染病中心(曾婉嘉，吳昱，陳香梅，魯鳳民)；北京大學(xué)人民醫(yī)院肝病研究所

肝臟是重要的代謝器官，不僅在碳水化合物、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)代謝中起關(guān)鍵作用，同時(shí)可以將各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為身體必需物質(zhì)，并承擔(dān)血液的過(guò)濾、凈化及解毒等重要功能。肝功能障礙會(huì)導(dǎo)致肝臟特異性和全身性疾病，其中遺傳性代謝病多為單基因突變引起的常染色體隱性遺傳病，部分可采用酶替代療法，但其應(yīng)用范圍較小，容易產(chǎn)生中和抗體。而某些疾病只能通過(guò)肝移植進(jìn)行治療，存在肝臟來(lái)源少且需要術(shù)后長(zhǎng)期監(jiān)護(hù)等問(wèn)題；病毒性肝炎引起的肝纖維化、肝硬化及肝細(xì)胞癌等也是重要的肝臟相關(guān)死亡原因，其中慢性乙型肝炎(CHB)尚缺乏有效的治愈藥物，且患者發(fā)展為終末期肝病的風(fēng)險(xiǎn)較高。因此，亟需新型的靶向肝臟的治療方式予患者更多選擇。

由于肝臟具有大量分泌蛋白的功能和運(yùn)輸潛力，同時(shí)也是遺傳載體在體內(nèi)遞送時(shí)主要富集的場(chǎng)所之一，因此成為當(dāng)前基因治療技術(shù)的理想靶器官。傳統(tǒng)的基因治療多采用腺病毒載體(AAV)進(jìn)行基因補(bǔ)充，但存在循環(huán)中和抗體等潛在問(wèn)題。近年來(lái)，治療性RNA及基因編輯技術(shù)已成為一類新的治療手段，在很多臨床試驗(yàn)中都獲得了令人鼓舞的結(jié)果，同時(shí)也在肝臟疾病中開展了相關(guān)研究，但還有很多問(wèn)題函待解決[1]。本文主要探討了近期包括信使RNA(mRNA)遞送、小分子干擾RNA(siRNA)和反義寡核苷酸(ASO)在內(nèi)的RNA療法，以及不同基因編輯策略的臨床研究最新進(jìn)展，這些研究為發(fā)病率高且選擇有限的罕見遺傳代謝病和難以治愈的慢性肝病的治療提供了新的方向。

一、RNA治療

RNA除了具有攜帶肽鏈編碼信息的作用以外，在調(diào)節(jié)基因表達(dá)、剪接其他RNA和運(yùn)送氨基酸構(gòu)建蛋白質(zhì)等方面也發(fā)揮著重要功能?，F(xiàn)有的RNA治療方案基于其生物特性研發(fā)，大致可分為三類：遞送mRNA表達(dá)目的蛋白、RNA干擾(RNAi)技術(shù)靶向沉默mRNA和RNA適配體靶向調(diào)節(jié)目的蛋白，現(xiàn)主要介紹mRNA遞送及RNAi療法的基本原理及臨床應(yīng)用現(xiàn)狀。

(一)mRNA遞送 mRNA作為帶有負(fù)電荷的大分子無(wú)法自由穿過(guò)細(xì)胞膜，而真核細(xì)胞內(nèi)吞的mRNA通常積累在溶酶體中無(wú)法進(jìn)行翻譯。因此，為了避免mRNA被內(nèi)環(huán)境中的核糖核酸酶降解，并促進(jìn)其進(jìn)入靶細(xì)胞的胞漿進(jìn)行翻譯，形成具有治愈功能的目的蛋白，具有保護(hù)作用和定向運(yùn)送功能的遞送載體不可或缺[1]，如脂質(zhì)納米顆粒(LNPs)及細(xì)胞外囊泡等。 LNPs是目前發(fā)展最成熟的遞送手段之一，可用于遞送mRNA、siRNA、DNA及基因編輯復(fù)合物等，通常由四部分構(gòu)成：可電離陽(yáng)離子脂類、磷脂(多為磷脂酰膽堿)、膽固醇和聚乙二醇脂[2]?？呻婋x陽(yáng)離子的脂類具有在酸性條件下質(zhì)子化而在中性條件下呈電中性的特點(diǎn)，有利于在體外酸性條件下包裝核酸，并促進(jìn)LNPs與肝細(xì)胞的酸性內(nèi)體膜融合從而釋放內(nèi)容物。此外，電中性的狀態(tài)可以防止靜脈給藥時(shí)誘發(fā)免疫反應(yīng)，同時(shí)也能提高向肝細(xì)胞遞送的效率[3]。磷脂是LNPs結(jié)構(gòu)的基本骨架，與膽固醇一同被稱為輔助脂，具有穩(wěn)定LNPs結(jié)構(gòu)的作用，也有研究證明，輔助脂成分的修飾能起到增加遞送效率或改變細(xì)胞靶向的作用[4]。聚乙二醇脂在避免LNPs早期被吞噬細(xì)胞捕獲方面發(fā)揮了重要作用，故被稱為隱形脂，同時(shí)還與LNPs的大小和體內(nèi)循環(huán)的半衰期相關(guān)[5]。除LNPs外，細(xì)胞外囊泡也可遞送核酸、氨基酸以及蛋白質(zhì)等，其作為天然囊泡相對(duì)于LNPs具有更好的生物相容性和更低的免疫原性。此外，不同細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外囊泡具有異質(zhì)性，并展現(xiàn)出獨(dú)特的功能，如來(lái)自血細(xì)胞的細(xì)胞外囊泡具有穿越血腦屏障的功能，而來(lái)自骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞外囊泡呈現(xiàn)出抗炎和旁分泌特性。細(xì)胞外囊泡的這些特點(diǎn)使其具有靶向運(yùn)輸和重復(fù)給藥的潛力，但目前在細(xì)胞外囊泡的分離提純和裝載效率方面還需要進(jìn)一步優(yōu)化[6]。

許多遺傳性肝臟代謝病均源于基因突變導(dǎo)致的蛋白質(zhì)功能異常，如人線粒體甲基丙二酰輔酶A變位酶(hMUT)缺乏或功能缺陷可引起甲基丙二酸血癥(MMA)，而葡萄糖6-磷酸酶(G6Pase-α)缺乏則會(huì)導(dǎo)致糖原貯積癥1a(GSD1a)。有研究在MMA小鼠模型中遞送hMUT mRNA進(jìn)行治療，成功地在小鼠肝臟內(nèi)檢測(cè)到了具有酶活性的hMUT蛋白，顯著改善了重癥MMA小鼠的生存和生長(zhǎng)情況，同時(shí)血清中甲基丙二酸含量降低，但仍高于野生對(duì)照組[7]。另一項(xiàng)利用裝載人G6PC mRNA的LNPs治療G6Pase-α基因敲除小鼠的實(shí)驗(yàn)也觀察到了類似結(jié)果，即治療組小鼠在禁食后血糖相較未治療組顯著升高，但仍未完全達(dá)到野生小鼠水平[8]。目前利用mRNA治療MMA(NCT04899310)的 I/II期臨床實(shí)驗(yàn)已在進(jìn)行中，治療GSD1a的項(xiàng)目(NCT05095727，尚未招募)也計(jì)劃評(píng)估成年患者靜脈注射MTX-LNP-hG6Pase mRNA的安全性、耐受性和有效性。

(二)RNAi治療 RNAi技術(shù)的策略是靶向沉默致病基因或病毒基因組來(lái)實(shí)現(xiàn)治療目的，包括siRNA及ASO等療法。siRNA源自秀麗隱桿線蟲，是一種含有20～25個(gè)核苷酸的雙鏈非編碼RNA，其在細(xì)胞質(zhì)中可與RNase III 核酸內(nèi)切酶、Argonaute蛋白和RNA結(jié)合蛋白相互作用并去除過(guò)客鏈，隨后產(chǎn)生成熟的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)。而RISC可結(jié)合與siRNA引導(dǎo)鏈互補(bǔ)的靶mRNA，并通過(guò)Argonaute蛋白誘導(dǎo)mRNA降解、mRNA polyA尾去腺苷酸化直接抑制翻譯等多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)基因沉默。將siRNA靶向遞送至肝細(xì)胞最常用的修飾手段是耦聯(lián)N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，其高度特異性能最大限度地減少全身性siRNA暴露，減少輸注反應(yīng)并延長(zhǎng)給藥間隔[9]，目前已有多種siRNA藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。近期，Vir Biotechnology公司宣布了VIR-2218的最新試驗(yàn)結(jié)果，在接受最高劑量組合療法48周后，有30.8%的CHB患者體內(nèi)檢測(cè)不到乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，并伴有抗-HBs血清轉(zhuǎn)換，提示宿主長(zhǎng)期暴露于高水平病毒抗原時(shí)的免疫抑制微環(huán)境可被siRNA部分逆轉(zhuǎn)。至于該系統(tǒng)的療效是否持久，停藥后是否會(huì)反彈等問(wèn)題還有待后續(xù)的臨床試驗(yàn)進(jìn)行探究[10]。

ASO是長(zhǎng)度為15～25個(gè)核苷酸的單鏈核酸聚合物，可以不依賴遞送系統(tǒng)而是通過(guò)受體介導(dǎo)的途徑進(jìn)入肝細(xì)胞，它不需形成復(fù)合體即可單獨(dú)通過(guò)互補(bǔ)核苷酸與目標(biāo)mRNA結(jié)合，經(jīng)由RNAse-H介導(dǎo)剪切目標(biāo)mRNA或抑制5’帽形成并阻斷核糖體亞基附著來(lái)發(fā)揮沉默功能。由于ASO在細(xì)胞質(zhì)中積累，其相對(duì)于積累在細(xì)胞內(nèi)體中的siRNA需要更頻繁且大劑量地給藥。另外，盡管遞送載體對(duì)ASO并非必需，但結(jié)合GalNAc后可增強(qiáng)肝細(xì)胞靶向性，并減少全身性暴露[9]。Bepirovisen是一種用于治療CHB的ASO類藥物，其靶向位點(diǎn)為HBV X蛋白開放閱讀框的中段，因此具有靶向所有HBV RNA的能力。近期公布的一項(xiàng)包含了457例樣本的IIb期臨床研究結(jié)果表明，持續(xù)使用Bepirovisen治療24周后，9%～10%的CHB患者在接下來(lái)長(zhǎng)達(dá)24周的時(shí)間內(nèi)HBsAg和HBV DNA均低于檢測(cè)下限[11]。此前的研究顯示，接受Bepirovisen治療的CHB患者出現(xiàn)了血清ALT的一過(guò)性升高，提示可能存在免疫激活并清除感染肝細(xì)胞的過(guò)程[12]。

二、基因編輯技術(shù)

基因組編輯技術(shù)依賴于基因組序列的靶向和特異性修飾，可分為無(wú)核酸酶和核酸酶引導(dǎo)兩類。前者的原理是基于與靶標(biāo)區(qū)同源的長(zhǎng)DNA序列，通過(guò)同源重組引入所需的編輯，特異性和安全性均較好，但是編輯效率通常較低；后者則是利用核酸酶在靶標(biāo)區(qū)誘導(dǎo)DNA雙鏈或單鏈斷裂，與前者相比編輯效率大大增加，但也可能出現(xiàn)在靶標(biāo)外的基因組區(qū)域發(fā)生脫靶編輯的風(fēng)險(xiǎn)。轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)核酸酶(TALEN)、鋅指核酸酶(ZFN)及CRISPR/Cas系統(tǒng)等都是經(jīng)過(guò)了深入研究的基因編輯技術(shù)，可構(gòu)建用于臨床前實(shí)驗(yàn)的體外模型和動(dòng)物模型，也可用于開發(fā)各種疾病的治療方法，目前應(yīng)用最廣泛的是CRISPR/Cas9系統(tǒng)。

(一)基因插入及校正 現(xiàn)有的基因編輯技術(shù)可以通過(guò)治療基因的插入、基因校正及基因敲除等手段靶向治療肝臟疾病。將治療基因靶向插入白蛋白的基因座后，可利用肝臟中白蛋白啟動(dòng)子的強(qiáng)大轉(zhuǎn)錄活性來(lái)治療因分泌型蛋白缺乏引起的遺傳性疾病，如血友病A、血友病B及黏多醣貯積癥。其中，GeneRide系統(tǒng)的原理是遞送攜帶治療性轉(zhuǎn)基因且側(cè)翼序列與白蛋白基因座3’端同源的重組AAV載體，從而誘導(dǎo)基因精準(zhǔn)整合到白蛋白終止密碼子上游，并通過(guò)一個(gè)具有自切割功能的蛋白酶序列使得兩種蛋白分別產(chǎn)生。該方法可以避免核酸酶的非靶向修飾及AAV基因組的隨機(jī)整合，但是低編輯效率也限制了其應(yīng)用范圍[13]。基于核酸酶的基因編輯系統(tǒng)具有靶向特定的DNA序列并發(fā)揮切割活性的功能，為了提高同源定向修復(fù)(HDR)率并改善治療效果，研究者將GeneRide系統(tǒng)與靶向插入位點(diǎn)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)聯(lián)合，在先天性葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶缺乏癥小鼠模型中將編輯效率提高了20～50倍，給藥后小鼠的肝臟組織學(xué)、炎癥標(biāo)志物和血漿白蛋白水平均正常，且預(yù)測(cè)部位未觀察到脫靶效應(yīng)，進(jìn)一步增加了其臨床應(yīng)用潛能[14]。盡管HDR介導(dǎo)基因座插入的效率較低，但通常足以實(shí)現(xiàn)治療水平的蛋白分泌，且該策略在校正后的肝細(xì)胞具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)時(shí)可以發(fā)揮較大的價(jià)值。同時(shí)，HDR還可用于編輯肝細(xì)胞基因組，以糾正致病突變，理想情況下可以實(shí)現(xiàn)無(wú)痕編輯，即將突變序列恢復(fù)成野生型序列。例如，α1-抗胰蛋白酶缺乏癥(AATD)可通過(guò)HDR校正突變基因，防止突變型α1-抗胰蛋白酶的積累，且校正后的肝細(xì)胞具有存活優(yōu)勢(shì)[15]。但是，鑒于當(dāng)前的HDR系統(tǒng)編輯效率普遍偏低，相關(guān)研究多為概念驗(yàn)證。

(二)基因敲除 基于核酸酶的基因編輯系統(tǒng)主要是通過(guò)在目標(biāo)區(qū)域誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂，并在后續(xù)的非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)過(guò)程中引入隨機(jī)的DNA插入或缺失(InDel)。這一機(jī)制可被用于引入編碼區(qū)的無(wú)義突變，編輯后的mRNA衰減最終會(huì)導(dǎo)致蛋白敲除。該系統(tǒng)已被用于底物還原療法，通過(guò)降低有毒代謝物的水平來(lái)治療因酶缺乏導(dǎo)致有毒代謝物積累的疾病，如抑制上游產(chǎn)生毒性代謝物的酶以治療原發(fā)性高草酸尿癥等代謝性疾病。有報(bào)道顯示，靶向草酸合成代謝途徑上游酶的AAV8-CRISPR/Cas9載體在小鼠體內(nèi)給藥后可以有效抑制酶活性，防止草酸過(guò)度產(chǎn)生，使得肝臟中的草酸水平出現(xiàn)治療性降低，避免腎臟損傷[16]。除了靶向宿主基因，CRISPR/Cas9系統(tǒng)還可有效降解病毒基因組，如HBV的復(fù)制模板共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)。有學(xué)者通過(guò)模擬微小RNA(miRNA)的生成過(guò)程，整合雙向?qū)NA(gRNA)介導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)和RNAi技術(shù)，構(gòu)建了gRNA-(miR-HBV)-gRNA三聯(lián)表達(dá)框架，不僅能高效破壞cccDNA，同時(shí)還可干擾病毒RNA的功能，從而促進(jìn)HBV清除[17]。

(三)堿基編輯器 通過(guò)導(dǎo)入外源的修復(fù)模板，CRISPR/Cas9系統(tǒng)也可以實(shí)現(xiàn)HDR介導(dǎo)的精確編輯，但是由于編輯效率較低，其應(yīng)用相對(duì)受限。Cas9蛋白的核酸酶切割活性來(lái)源于RuvC和HNH結(jié)構(gòu)域，將這兩個(gè)保守的核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變后可以得到無(wú)切割活性，但仍保留靶向功能的dCas9(dead Cas9)蛋白。DNA堿基編輯器就是利用CRISPR/dCas9系統(tǒng)聯(lián)合不同類型的脫氨酶實(shí)現(xiàn)堿基轉(zhuǎn)化，包括胞嘧啶堿基編輯器(CBE)和腺嘌呤堿基編輯器(ABE)，其中CBE可以完成胞嘧啶向胸腺嘧啶的轉(zhuǎn)換，而ABE則能實(shí)現(xiàn)腺嘌呤到鳥嘌呤的突變。 堿基編輯器在治療肝臟疾病中已有諸多應(yīng)用，如編輯膽固醇相關(guān)基因及HBV基因組等。靶向編輯人前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(hPCSK9)基因可以在肝臟特異性hPCSK9敲入小鼠中有效降低膽固醇水平，且與基因組編輯相比，堿基編輯更為精確，未發(fā)現(xiàn)脫靶編輯或染色體易位[18]。除了在肝臟代謝疾病中的應(yīng)用，堿基編輯器同樣適用于靶向抑制病毒復(fù)制。此前，Beam Therapeutics公司在細(xì)胞水平利用胞嘧啶堿基編輯器在HBV基因組的多個(gè)位置引入終止密碼子，有效抑制了病毒復(fù)制的各項(xiàng)指標(biāo)。近期，他們公布了最新的HBV感染小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用LNP遞送的多重堿基器導(dǎo)致小鼠血清HBsAg水平下降超過(guò)2 log10 IU/mL，同時(shí)HBV DNA水平下降了3 log10拷貝/mL，且在停藥后沒有出現(xiàn)病毒學(xué)反彈，為CHB患者的功能性治愈帶來(lái)了希望[19]。

三、總結(jié)

基于mRNA和RNAi的療法以及各類基因編輯技術(shù)是近年來(lái)基因治療領(lǐng)域的重要突破，為不適用酶替代療法和無(wú)法接受肝移植的遺傳代謝病患者，以及缺乏有效治愈手段的慢性肝炎患者提供了更多可供選擇的治療方案。這些治療系統(tǒng)的有效性和安全性已在部分動(dòng)物模型上得到驗(yàn)證，但仍然需要更多的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)一步評(píng)估。如CRISPR/Cas9系統(tǒng)仍存在一些安全性問(wèn)題，主要是脫靶編輯效應(yīng)和針對(duì)Cas9蛋白的免疫反應(yīng)[20]。未來(lái)通過(guò)采用經(jīng)改進(jìn)后的高保真Cas9蛋白、優(yōu)化瞬時(shí)遞送系統(tǒng)如LNPs和細(xì)胞外囊泡等，將可以有效避免CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)和免疫原性[21-23]。相信隨著與基因編輯技術(shù)和RNA療法相關(guān)的研究不斷深入，這些技術(shù)未來(lái)一定會(huì)在臨床應(yīng)用中發(fā)揮更大的價(jià)值。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。