門靜脈成纖維細(xì)胞有望成為可再生肌成纖維細(xì)胞的新來源

馬鴻倩 鄢和新

作者單位：200127 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院麻醉科

多種肝臟疾病如慢性肝炎和膽汁淤積性肝損傷都會通過纖維化途徑導(dǎo)致肝硬化，但不同肝損傷最初表現(xiàn)出的纖維化模式不盡相同。例如，在膽汁淤積性疾病如原發(fā)性膽管炎和原發(fā)性硬化性膽管炎中，纖維化起初僅分布在門靜脈周圍，而酒精相關(guān)性肝病顯示纖維物質(zhì)沉積在中心靜脈和肝竇周圍[1]。這些不同的纖維化模式表明，發(fā)生在不同位置的細(xì)胞特異性損傷可能與表型獨特的成纖維細(xì)胞相互作用，啟動不同的信號通路。

肝臟間充質(zhì)細(xì)胞由位于肝竇的HSCs和血管周圍細(xì)胞組成，包括門靜脈和中央靜脈周圍的血管平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。這些間充質(zhì)細(xì)胞來源于胚胎橫隔間充質(zhì)(STM)[2]，STM誘導(dǎo)腹側(cè)前腸內(nèi)胚層擴(kuò)張形成肝芽。原始肝細(xì)胞長入間充質(zhì)，形成肝竇狀結(jié)構(gòu)；位于肝細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞之間的間充質(zhì)細(xì)胞最終將發(fā)育成HSCs[3]。貫穿于發(fā)育中的肝芽靜脈分支，即新生的門靜脈系統(tǒng)，通過導(dǎo)管板的形態(tài)發(fā)生，驅(qū)動肝母細(xì)胞分化形成膽管細(xì)胞。肝內(nèi)動脈分支沿著新生的肝內(nèi)膽管分支，從發(fā)育中的肝臟中央?yún)^(qū)域延伸到周圍區(qū)域，嵌入肝臟間充質(zhì)，形成由門靜脈、肝動脈和總膽管組成的門靜脈三聯(lián)體。

在過去的30年里，HSCs因具有向肌成纖維細(xì)胞分化的能力而被廣泛研究。HSCs是一種處于靜息狀態(tài)的、富含維生素A的間充質(zhì)細(xì)胞，是第一個被鑒定為肝損傷時肌成纖維細(xì)胞來源的細(xì)胞[4]。隨著HSC分離技術(shù)的改進(jìn)，許多研究確定了HSCs是肝纖維化中肌成纖維細(xì)胞的主要來源。最近的一項研究根據(jù)HSCs在肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展不同階段的作用將其分為兩類亞群，即靜止的、產(chǎn)生細(xì)胞因子的HSC(cyHSCs)和激活的肌成纖維細(xì)胞(myHSCs)。cyHSCs通過產(chǎn)生肝細(xì)胞生長因子HGF保護(hù)肝細(xì)胞免于死亡，在肝細(xì)胞癌初期抑制腫瘤發(fā)展；myHSC通過產(chǎn)生Ⅰ型膠原蛋白形成纖維化微環(huán)境，在肝細(xì)胞癌后期促進(jìn)腫瘤發(fā)展[5]。

越來越多的證據(jù)表明，其他肝臟間充質(zhì)細(xì)胞(尤其是門靜脈間充質(zhì)細(xì)胞)也可以生成肌成纖維細(xì)胞，這些細(xì)胞受到了越來越多的關(guān)注[6-9]。事實上，早在幾十年前Schaffner等[10]就發(fā)現(xiàn)了位于肝竇以外的肝間充質(zhì)細(xì)胞，使人們認(rèn)識到肝成纖維細(xì)胞空間分布的特異性。門靜脈成纖維細(xì)胞(PFs)的空間定位使它們成為膽管纖維化的介質(zhì)，2002年Kinnman和Housset[11]首次提出PFs是膽道纖維化的第一反應(yīng)者，隨后被肝星狀細(xì)胞(HSCs)取代。此外，十多年前Dranoff和Wells[12]系統(tǒng)地討論了PFs在肝纖維化發(fā)生中的作用，并提出了需要進(jìn)一步探索的領(lǐng)域。

對于門靜脈成纖維細(xì)胞的研究主要瓶頸在于缺乏可以分離或在體內(nèi)示蹤門靜脈成纖維細(xì)胞的表面標(biāo)志物。Mourabi等[3- 4, 12]從大鼠肝臟膽道血管樹片段成功分離了門靜脈肌成纖維細(xì)胞，與肝干細(xì)胞不同，門靜脈間充質(zhì)細(xì)胞可以產(chǎn)生高度增殖的、具有促血管生成特性的COL15A1+肌成纖維細(xì)胞。然而，在這些研究中門靜脈肌成纖維細(xì)胞的前體細(xì)胞尚未被真正確定。為此，Lei[11]從膽道血管樹分離并分選出門靜脈間充質(zhì)細(xì)胞，使用生物信息學(xué)分析來進(jìn)一步定義門靜脈間充質(zhì)的細(xì)胞組成，確定了區(qū)分肌成纖維細(xì)胞亞群的標(biāo)志物，并確定了PFs在小鼠和人類肝病病理中的作用。

為了確定門靜脈間充質(zhì)細(xì)胞的組成，Lei等[13]從健康小鼠的膽管樹中分離出單細(xì)胞懸液，通過細(xì)胞分選富集了膽管細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞譜系標(biāo)志陰性的細(xì)胞，再對這些富集之后的門靜脈間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序。無監(jiān)督聚類分析發(fā)現(xiàn)了16個細(xì)胞群，其中包括可能來自Glissonean 肝蒂的間皮細(xì)胞，以及四個在分選過程中被遺漏的內(nèi)皮細(xì)胞群。在間充質(zhì)細(xì)胞成分中，他們確定了五個不同的成纖維細(xì)胞群和血管平滑肌細(xì)胞群，以及一個HSCs群。五個纖維細(xì)胞群均表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(包括幾種膠原蛋白)。然而，這些成纖維細(xì)胞群所展示出的獨特表達(dá)譜，暗示在纖維化形成過程中這些細(xì)胞具有不同的命運。例如，成纖維細(xì)胞群5與HSCs擁有共同的基因表達(dá)譜，表明該群可能是PFs和完全分化的HSCs之間的中間體。根據(jù)單細(xì)胞熵的測量，基于其信號混雜程度近似單細(xì)胞的分化潛能和可塑性，成纖維細(xì)胞群3和4被認(rèn)為是潛在的前體細(xì)胞[14]。使用軌跡分析和GO分析對成纖維細(xì)胞、VSMC和HSC群以及干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的分析，進(jìn)一步支持成纖維細(xì)胞群3和4具有間充質(zhì)干細(xì)胞多系分化的潛能和特征。這群細(xì)胞被稱為具有間充質(zhì)干細(xì)胞特征(PMSCs)的PFs。這一研究揭示了門靜脈間充質(zhì)復(fù)雜的細(xì)胞組成，并確定了可能是門靜脈肌成纖維前體細(xì)胞的細(xì)胞群。

細(xì)胞培養(yǎng)研究表明，PFs具有高度克隆性，表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物，并能進(jìn)行三系分化(間充質(zhì)干細(xì)胞的一個特征)。與懸浮培養(yǎng)相比，在基質(zhì)上平面培養(yǎng)時這些細(xì)胞會表現(xiàn)出門靜脈肌成纖維細(xì)胞的特征。因此，上述篩選策略和分離步驟確定了可能是門靜脈肌成纖維細(xì)胞前體細(xì)胞的PMSCs。隨后作者對靜止?fàn)顟B(tài)的PMSCs和HSCs，以及兩者轉(zhuǎn)分化后形成的肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行群體 RNA測序，以尋找能夠劃分這兩種細(xì)胞群在靜止和肌成纖維狀態(tài)下的差異基因，從而用于肝臟纖維化組織分析。在向肌成纖維細(xì)胞分化的過程中，PMSCs在培養(yǎng)中是克隆性的，而HSCs則無分裂能力。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果提示，Slit2是PMSC/PMSC-MF的特征基因，在PMSCs向肌成纖維細(xì)胞分化過程中始終穩(wěn)定表達(dá)，而在其他肝細(xì)胞類型，例如HSCs/HSC-MFs中幾乎沒有表達(dá)。體外研究發(fā)現(xiàn)，PMSC來源的Slit2可激活HSCs并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管新生。熒光原位雜交分析表明，在小鼠肝病模型和人類肝硬化樣本中，SLIT2+PMSC來源的肌成纖維細(xì)胞在纖維化隔膜中沿著新生血管聚集，并被SLIT2-HSCs來源的肌成纖維細(xì)胞所包圍。因此Lei等認(rèn)為，PMSCs的增殖可以促進(jìn)血管新生和HSCs來源的肌成纖維細(xì)胞的累積。他們確定了PMSCs的標(biāo)志物，明確了小鼠和人類肝臟樣本中門靜脈肌成纖維細(xì)胞的解剖分布和來源。PMSCs標(biāo)志物可用于確定纖維化肝病中存在的肌成纖維細(xì)胞的類型，以及這些肌成纖維細(xì)胞如何在疾病不同階段對不同損傷做出反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)肝臟纖維化的形成。此外，這項發(fā)現(xiàn)還有助于研究不同纖維化細(xì)胞群與膽管細(xì)胞之間潛在的信號網(wǎng)絡(luò)。原發(fā)性硬化性膽管炎的組織學(xué)特點是管周和橋狀纖維化，這一病理過程可能同時或先后涉及PFs和HSCs[15]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性硬化性膽管炎中的膽管細(xì)胞對損傷的反應(yīng)不一致。在受到損傷后，一些膽管細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯(即衰老)，而其他膽管細(xì)胞發(fā)生導(dǎo)管反應(yīng)并開始增殖[16]。這種對應(yīng)激反應(yīng)的差異及其與原發(fā)性硬化性膽管炎發(fā)病機(jī)制的關(guān)系仍不清楚。有數(shù)據(jù)表明，在疾病初始階段，活化的PFs是被招募到膽管周圍損傷部位的主要成纖維細(xì)胞類型，衰老膽管細(xì)胞相關(guān)的分泌表型可能在膽管周圍使PFs持續(xù)活化導(dǎo)致管周纖維化。當(dāng)膽管反應(yīng)的膽管細(xì)胞增殖超出原來的膽管結(jié)構(gòu)時，HSCs的大量聚集可能導(dǎo)致疾病晚期實質(zhì)橋接性纖維化。即衰老膽管細(xì)胞和PFs主要參與膽道周圍纖維化的發(fā)展和持續(xù)，而膽管反應(yīng)性細(xì)胞和HSCs則參與實質(zhì)纖維化的形成[17]。PMSCs的門靜脈定位使其成為膽汁纖維化的誘因，這可能涉及與其他細(xì)胞如膽管細(xì)胞、肝細(xì)胞、VSMCs及免疫細(xì)胞之間的細(xì)胞信號串?dāng)_。綜上，通過結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)化的特征性標(biāo)志物用于區(qū)分HSCs和PFs在不同病因下導(dǎo)致纖維化的差異，為進(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。