化痰通絡(luò)方對(duì)腦梗死大鼠半暗帶腦血管內(nèi)皮細(xì)胞及血腦屏障的影響

徐家淳，孫偉明，王 凱，趙志恒，周 震

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300250）

血腦屏障（BBB）是腦內(nèi)重要的結(jié)構(gòu)和功能單元，可維持組織穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)腦內(nèi)物質(zhì)交換的平衡，而腦血管內(nèi)皮細(xì)胞（BVECs）是構(gòu)成BBB的基本單元。腦梗死發(fā)生后，BVECs受損、基底膜成分降解均可破壞BBB，使其通透性增加，引發(fā)一系列炎性反應(yīng)，加重腦梗死［1-2］。因此，保護(hù)BVECs、促進(jìn)BBB修復(fù)，對(duì)腦梗死的治療具有重要意義。中醫(yī)藥治療腦梗死方法多樣，本課題組臨床中一直采用化痰通絡(luò)方治療腦梗死患者，療效顯著［3-4］。為揭示化痰通絡(luò)方的療效機(jī)制，本研究采用光鏡、透射電鏡、伊文思藍(lán)（EB）染色觀察其對(duì)大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）大鼠BVECs形態(tài)和BBB的影響，為臨床應(yīng)用該方提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠81只，體質(zhì)量240～260 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。大鼠飼養(yǎng)于放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，12 h光照/黑暗交替，室溫23～25℃，相對(duì)濕度50%～60%。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、中藥組，每組27只。造模前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，食水自由。

1.2 主要試劑與儀器

蘇木素伊紅試劑盒（索萊寶，G1120），戊二醛（上海士鋒生物科技，R0652），EB溶液（上海源葉生物，S19046-5 g），透射電子顯微鏡（TEM，日立，HT7800），超薄切片機(jī)（Leica，EM UC7），石蠟切片機(jī)（Leica，RM2125RTS），光學(xué)顯微鏡（Leica，DM6MLIBS）。

2 方法

2.1 中藥制備

化痰通絡(luò)方由天麻10 g、半夏10 g、丹參30 g、膽南星5 g、川芎10 g、地龍10 g、酒大黃5 g組成。將5劑中藥加水濃煎500 mL，濃縮后生藥濃度0.8 g/mL。由天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑中心制備，4℃保存。

2.2 動(dòng)物造模

中藥組及模型組均參照Zea Longa線栓法［5］，制備MCAO模型：①大鼠固定、備皮、消毒；②剪開頸部皮膚，撕開頸部淺筋膜，鈍性分離，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)；③分離左側(cè)頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈；④夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸總和頸外動(dòng)脈近心端；⑤插栓至頸總動(dòng)脈分叉處18 mm左右，固定線栓；⑥清理、縫合并消毒手術(shù)創(chuàng)口。假手術(shù)組大鼠僅暴露并分離頸總、頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈，不進(jìn)栓。所有大鼠術(shù)前禁食24 h。

2.3 灌胃給藥

造模成功后，參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》［6］中“人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值表”，按7.2 g/kg生藥濃度，中藥組大鼠每日予9 mL/kg化痰通絡(luò)方灌胃1次，假手術(shù)組和模型組大鼠每日予同體積蒸餾水灌胃1次。

2.4 觀察指標(biāo)

各組大鼠分別于實(shí)驗(yàn)后1 d、3 d、7 d采用相應(yīng)方法取材。

2.4.1 光鏡觀察半暗帶BVECs微觀結(jié)構(gòu)

每組于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取3只大鼠，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)按照下列步驟灌注取材：麻醉→分離并夾閉腹主動(dòng)脈→開胸暴露心臟→生理鹽水沖洗→沖至右心耳切口處流出澄明色液體，肝臟變白→推入100 mL 4%多聚甲醛→斷頭取腦→放入盛有4%多聚甲醛的小瓶中→染色切片→拍照觀察。

2.4.2 TEM觀察半暗帶BVECs超微結(jié)構(gòu)

每組于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取3只大鼠，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)按照下列步驟灌注取材：麻醉→分離并夾閉腹主動(dòng)脈→開胸暴露心臟→生理鹽水沖洗→沖至右心耳切口處流出澄明色液體，肝臟變白→緩慢推入戊二醛電鏡固定液灌注→斷頭取腦→冰上將半暗帶組織切成1 mm3小塊（半暗帶的確定參照Ashwal方法［7］）→戊二醛電鏡固定液中固定→染色切片→TEM觀察照相。

2.4.3 EB染色檢測(cè)BBB通透性

每組于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取3只大鼠，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)接受尾靜脈注射EB，灌注取全腦，以滲出的EB溶液含量檢測(cè)BBB通透性。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)半暗帶BVECs微觀結(jié)構(gòu)比較

假手術(shù)組各個(gè)時(shí)點(diǎn)BVECs呈梭形，形態(tài)飽滿，胞質(zhì)粉染，核仁明顯，細(xì)胞間連接緊密，呈疊瓦狀分布于血管壁。模型組大鼠實(shí)驗(yàn)后1 d時(shí)BVECs脫落，聚集于管腔中央，胞體腫脹，胞質(zhì)少而淡，核腫脹，緊密連接消失；實(shí)驗(yàn)后3 d時(shí)BVECs分布不均勻，部分緊密連接，少見梭狀細(xì)胞，胞質(zhì)粉染，核形態(tài)各異；實(shí)驗(yàn)后7 d時(shí)BVECs數(shù)量減少，連接較緊密，稍向管腔突出，胞質(zhì)淡染，核仁不明顯。中藥組大鼠實(shí)驗(yàn)后1 d時(shí)，BVECs形態(tài)結(jié)構(gòu)與模型組大致相同；實(shí)驗(yàn)后3 d時(shí)BVECs近似梭形，胞質(zhì)淡染，可見空泡，部分核腫脹，表面光滑，細(xì)胞間連接緊密成完整的帶，突入管腔；實(shí)驗(yàn)后7 d時(shí)BVECs呈梭形，胞質(zhì)呈淡染，核漿比例較大，核深染，形態(tài)欠均，連接緊密。見圖1。

圖1 各組大鼠腦半暗帶血管內(nèi)皮細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)（×400）

3.2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)半暗帶BVECs超微結(jié)構(gòu)比較

實(shí)驗(yàn)后1 d時(shí)，假手術(shù)組BVECs核大、核膜完整，染色質(zhì)密度均勻，核仁明顯；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)連續(xù)，游離核糖體分布均勻；線粒體完整，可見清晰的雙層膜結(jié)構(gòu)與嵴。模型組大鼠BVECs輕度腫脹，核不規(guī)則增大；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂，游離核糖體明顯減少；部分線粒體明顯空化，僅留雙層膜。中藥組BVECs形態(tài)、細(xì)胞核、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體基本與模型組相同。見圖2。

圖2 實(shí)驗(yàn)后1 d各組大鼠腦半暗帶血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

實(shí)驗(yàn)后3 d時(shí)假手術(shù)組BVECs形態(tài)、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體與1 d時(shí)基本相同。模型組BVECs腫脹，核增大，部分核膜模糊，核仁不顯；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂、脫顆粒嚴(yán)重，核糖體呈不均勻分布、數(shù)量減少；線粒體嵴模糊伴嚴(yán)重的嵴斷裂、缺失。與模型組相比，中藥組BVECs腫脹減輕，核大，核膜完整，核仁明顯；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體改變同模型組。見圖3。

圖3 實(shí)驗(yàn)后3 d各組大鼠腦半暗帶血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

實(shí)驗(yàn)后7 d時(shí)假手術(shù)組BVECs形態(tài)、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體與1 d、3 d時(shí)相同。模型組BVECs仍腫脹，胞質(zhì)減少，核大，部分核膜模糊、斷裂，核仁不顯；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂、脫顆粒嚴(yán)重，游離核糖體明顯減少；大多數(shù)線粒體僅留雙層膜。與模型組相比，中藥組BVECs形態(tài)恢復(fù)較好，基膜清晰，內(nèi)膜完整；核大，核仁明顯；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)仍有脫顆粒，游離核糖體少；部分線粒體嵴和雙層膜結(jié)構(gòu)恢復(fù)。見圖4。

圖4 實(shí)驗(yàn)后7 d各組大鼠腦半暗帶血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

3.3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)BBB通透性比較

假手術(shù)組大鼠在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)僅可見微量EB溶液；模型組EB溶液含量在各時(shí)間點(diǎn)均明顯高于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中藥組各時(shí)間點(diǎn)EB溶液含量均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)伊文思藍(lán)（EB）溶液含量比較（±s，μg/g）

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)伊文思藍(lán)（EB）溶液含量比較（±s，μg/g）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 實(shí)驗(yàn)后1 d 實(shí)驗(yàn)后3 d 實(shí)驗(yàn)后7 d只數(shù) 只數(shù) 只數(shù) EB假手術(shù)組 3 3 3 0.73±0.33模型組 3 3 3 9.35±0.44*中藥組 3 3 3 2.23±0.25#EB 0.96±0.17 14.06±0.01*5.37±0.19#EB 0.83±0.31 12.93±0.18*3.86±0.28#

4 討論

腦梗死發(fā)生后病灶由缺血中心區(qū)及其周圍的缺血半暗帶組成，拯救缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞是治療腦梗死的關(guān)鍵。眾多研究表明，BVECs和BBB在缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞的恢復(fù)中發(fā)揮著重要作用［8-9］。BBB是大腦微循環(huán)的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，不僅可維持腦組織穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)腦內(nèi)物質(zhì)交換平衡、保護(hù)腦組織，還可以有效地調(diào)節(jié)腦血流，促進(jìn)半暗帶血流恢復(fù)［10-11］。腦梗死發(fā)生后，BBB的完整性被破壞，通透性增加，水和一系列大分子物質(zhì)通過開放的BBB進(jìn)入細(xì)胞外間隙，加速腦水腫形成；此外，BBB開放時(shí)血流速度減慢、基底膜破壞等加速了神經(jīng)細(xì)胞的破壞與功能喪失［12］。

BVECs及其緊密連接是構(gòu)成BBB的基礎(chǔ)單位，也是BBB的重要結(jié)構(gòu)與功能基礎(chǔ)，控制著BBB的完整性與物質(zhì)交換；BVECs可合成并分泌一氧化氮（NO）、內(nèi)皮素（ET）等活性物質(zhì)［13］，可調(diào)節(jié)血管平滑肌的舒縮功能，以保持血管的通暢、維持血液循環(huán)［14］。BVECs損傷、脫落可破壞BBB的完整性，加重腦組織缺血缺氧［12］。因此，促進(jìn)腦梗死后BVECs、BBB修復(fù)，可保護(hù)缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)?，F(xiàn)代研究圍繞促進(jìn)腦梗死后BVECs的修復(fù)方面做了許多工作［15-16］，其機(jī)制與促進(jìn)分泌細(xì)胞因 子［17-19］、血管內(nèi)皮生長因子和胰島素樣生長因子，進(jìn)而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)、生長有關(guān)［20-22］。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組中基本無EB溶液滲出，表明假手術(shù)組大鼠BBB的完整性良好。而模型組在實(shí)驗(yàn)后1 d時(shí)可見大量EB溶液滲出，表明腦梗死急性期BBB遭到嚴(yán)重破壞；但隨觀察時(shí)間延長，實(shí)驗(yàn)后3 d和7 d模型組EB溶液滲出較1 d時(shí)減少，表明腦梗死后BBB呈現(xiàn)一定的自我修復(fù)能力。研究表明急性腦梗死后BVECs首先發(fā)生細(xì)胞腫脹、固縮、壞死、緊密連接消失［23］，本研究結(jié)果與這一現(xiàn)象基本一致，實(shí)驗(yàn)后1 d時(shí)BVECs的改變以連續(xù)性消失、脫落、腫脹、基膜斷裂、細(xì)胞器丟失為主，實(shí)驗(yàn)后3 d和7 d BVECs細(xì)胞腫脹減輕，細(xì)胞器成分恢復(fù)，表明在腦梗死發(fā)生后存在BVECs的損傷及死亡，但隨觀察時(shí)間的延長，BVECs呈現(xiàn)出一定的修復(fù)現(xiàn)象。與模型組相比，中藥組在實(shí)驗(yàn)后7 d BVECs形態(tài)得到明顯改善，EB溶液滲出現(xiàn)象也明顯減少，表明化痰通絡(luò)方可促進(jìn)BVECs及BBB修復(fù)。

中醫(yī)學(xué)將腦梗死歸屬于中風(fēng)范疇，對(duì)其論治可追溯至《金匱要略》侯氏黑散、風(fēng)引湯。該病急性期與風(fēng)、火、痰、瘀等病因密切相關(guān)，根據(jù)“急則治其標(biāo)”的原則，在急性期使用化痰瀉濁、祛瘀通絡(luò)的方藥切中病機(jī)?；低ńj(luò)法是國醫(yī)大師張伯禮院士在其主持的國家“十五”科技攻關(guān)課題“中風(fēng)病急性期綜合治療方案研究”中提出的，經(jīng)臨床驗(yàn)證療效顯著。方中天麻甘、平，可息風(fēng)止痙、祛風(fēng)通絡(luò)；半夏辛、溫，膽南星辛、苦，共奏化痰息風(fēng)之功；川芎與丹參活血行氣逐瘀；地龍息風(fēng)通絡(luò)；酒大黃清熱祛瘀瀉濁。諸藥共用以祛風(fēng)化痰、逐瘀通絡(luò)。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，該方可促進(jìn)腦梗死急性期患者神經(jīng)功能恢復(fù)，提高日常生活能力，提升生活質(zhì)量［3-4］，其機(jī)制可能與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞有關(guān)［24-25］。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)化痰通絡(luò)方干預(yù)后，BVECs形態(tài)和基膜完整性基本恢復(fù)，受損的細(xì)胞核及細(xì)胞器均有改善，尤其是實(shí)驗(yàn)后7 d線粒體損害的嵴與雙層膜結(jié)構(gòu)均有好轉(zhuǎn)。且經(jīng)化痰通絡(luò)方干預(yù)后，通透性遭到破壞的BBB得到了一定程度的恢復(fù)，這與化痰通絡(luò)方對(duì)損壞的BVECs形態(tài)及細(xì)胞器的修復(fù)、保護(hù)作用具有一定關(guān)系。因此，化痰通絡(luò)方改善急性腦梗死后半暗帶BVECs損傷、促進(jìn)BBB修復(fù)可能是該法促進(jìn)腦梗死后神經(jīng)功能恢復(fù)的起效機(jī)制之一。