一測多評法測定槐花顆粒中7種有效成分含量

辛曉芳，劉特津，張公安

（1.廣州中醫(yī)藥大學附屬中山中醫(yī)院，廣東 中山 528401；2.廣東藥科大學，廣東 中山 528458）

槐花顆粒為廣東省中山市中醫(yī)院的院內制劑，由槐花、野菊花、甘草組成，具有涼血止血、清肝瀉火的功效，主要用于治療便血、痔血、血痢、崩漏、吐血、肝熱目赤、頭痛、眩暈等，臨床療效顯著?；被w粒目前的質量標準過于簡單，無法全面反映和控制產品的質量。一測多評法（quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS）已廣泛應用于中藥及復方制劑的質控研究［1-4］，通過中藥有效成分內在函數關系和比例關系，以藥材中對照品廉價易得的典型成分為內標，建立該成分與其他成分間的相對校正因子，再通過校正因子同步計算出其他成分的量，從而實現多成分的同步測定。為了提高制劑質量，本研究采用一測多評法建立槐花顆粒的多成分質控模式，為該制劑的質量控制提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；Waterse 2695高效液相色譜儀［沃特世科技（上海）有限公司］；色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司）；色譜柱Agilent ZORBAX RX-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司）；色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司）；色譜柱Merck Purospher STARRP-18 endcapped（4.6 mm×250 mm，5 μm，德國默克公司）；醫(yī)用離心機2-16R（湖南恒諾儀器設備有限公司）；SQP型Sartorius天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］。

1.2 試藥對照品綠原酸（批號110753-202018）、蘆?。ㄅ?00080-201811）、甘草苷（批號111610-201908）、木犀草苷（批號111720-201810）、蒙花苷（批號111528-201911）、木犀草素（批號111520-202006）、槲皮素（批號100081-201610），均購于中國藥品生物制品檢定所；乙腈（色譜純），甲醇（分析純）；槐花顆粒（粵 藥 制 備 字Z20200038000，批 號20001、20002、20003、20004、21001、21002），由廣東省中山市中醫(yī)院制劑室提供。

2 方法與結果

2.1 混合對照品溶液的制備分別精密稱取綠原酸、蘆丁、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、槲皮素、木犀草素對照品適量，加甲醇溶解并定容至50 ml，制成質量濃度分別 為0.021 0 mg/ml、0.450 0 mg/ml、0.210 0 mg/ml、0.020 0 mg/ml、0.092 5 mg/ml、0.212 5 mg/ml、0.075 0 mg/ml的混合對照品儲備液，用封口膜封口并避光保存。

2.2 供試品溶液的制備取同一批號的槐花顆粒5 g，加入70%乙醇（固液比1∶20）在80℃水浴中加熱，索氏提取法抽提4 h，待提取液冷卻后過濾，除去提取液中的藥材粉末，分批將濾液置于同一蒸發(fā)皿中水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移到棕色容量瓶中并定容至50 ml，取定容后的試液少許，以轉速13 500 r/min離心15 min，取上清液1 ml置于10 ml棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得供試品溶液，用封口膜封口并避光保存。

2.3 陰性溶液的制備按槐花顆粒制劑的配制工藝分別制成缺槐花、缺野菊花、缺甘草的陰性顆粒。然后按上述2.2提取方法，分別制備出甘草陰性樣品溶液、槐花陰性樣品溶液、野菊花陰性樣品溶液。

2.4 色譜條件色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.5%磷酸水溶液（B），梯度洗脫程序為：0～20 min，10%～19%乙腈洗脫；20～30 min，19%～20%乙腈洗脫；30～50 min，20%～21%乙腈洗脫；50～85 min，21%～60%乙腈洗脫；85～95 min，10%乙腈洗脫；流速：1.0 ml/min；檢測波長：334 nm；柱溫：25℃；進樣量：5 μl。在上述色譜條件下，混合對照品和供試品中綠原酸、蘆丁、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、槲皮素、木犀草素分離良好，且蘆丁峰的理論塔板數不低于3 000。見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察分別精密吸取“2.1”項下混合對照品儲備液各1.0 ml、2.0 ml、4.0 ml、6.0 ml、8.0 ml于10 ml量瓶中，用甲醇稀釋并定容，制得系列混合對照品溶液。將系列混合對照品溶液及混合對照品儲備液，在“2.4”項色譜條件下測定其峰面積。以混合對照品溶液的濃度為橫坐標（X，μg/ml），測得的峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得回歸方程及相關系數r2，結果r2均大于0.999，顯示進樣濃度與峰面積呈良好線性關系，結果見表1。

表1 槐花顆粒中7種成分的線性關系考察結果

2.5.2 精密性試驗取“2.1”項下混合對照品溶液，按“2.4”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，結果顯示綠原酸、蘆丁、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、槲皮素的峰面積相對標準偏差（RSD）依次為1.03%、0.99%、1.03%、1.03%、1.03%、1.02%、1.03%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復性試驗取同一批供試品（批號20004）6份，按“2.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，再按“2.4”項下色譜條件依次進樣測定，計算綠原酸、蘆丁、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、槲皮素的濃度分別為7.8 μg/ml、329.5 μg/ml、71.2 μg/ml、6.9 μg/ml、41.1 μg/ml、6.4 μg/ml、47.1 μg/ml，RSD分別為1.00%、1.03%、1.02%、1.03%、1.00%、1.02%、1.00%（n=6），表明方法重復性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗取同一批供試品（批號20004），按“2.2”項下方法制備供試品溶液，室溫下放置，分別在0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h測定，記錄峰面積，結果綠原酸、蘆丁、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、槲皮素的峰面積RSD依次為1.03%、1.03%、1.04%、1.04%、1.00%、1.01%、1.04%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗分別精密稱取綠原酸、蘆丁、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、槲皮素、木犀草素對照品適量，加甲醇溶解并定容至10 ml，制成質量濃度分 別 為1.950 mg/ml、65.016 mg/ml、15.080 mg/ml、1.740 mg/ml、9.500 mg/ml、1.506 mg/ml、10.500 mg/ml的混合對照品溶液。精密稱定9份已測定的槐花顆粒樣品（批號20004）2.5 g，分為低、中、高3組（分別加入0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml的混合對照品溶液），每組平行制備3份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.4”項下色譜條件進行測定，分別計算綠原酸、蘆丁、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、槲皮素的平均回收率，各成分平均回收率分別為98.89%、98.69%、98.49%、98.11%、98.21%、98.33%、98.30%，RSD依次為1.53%、0.98%、0.69%、0.88%、1.37%、0.62%、0.81%（n=9），表明該方法的準確性良好。

2.6 QAMS法

2.6.1 相對校正因子（fS/I）的測定取“2.5.1”項數據，以蘆丁為內參物（S），按公式fS/I＝（AS×CI）/（AI×CS）計算，AI、CI分別為待測成分對照品的峰面積和質量濃度，AS、CS分別代表內參物的峰面積和質量濃度。計算綠原酸、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、槲皮素的相對校正因子fS/A、fS/B、fS/C、fS/D、fS/E、fS/F的RSD分別為1.73%、2.71%、2.45%、2.26%、2.53%、1.64%，結果見表2。

表2 以蘆丁為內參物的fS/I測定結果

2.6.2 相對校正因子重現性考察

2.6.2.1 不同儀器對fS/I的影響試驗考察了2種高效液相色譜系統(tǒng)Agilent 1 260高效液相色譜儀和Waterse 2 695高效液相色譜儀對槐花顆粒中6種有效成分綠原酸、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、槲皮素的相對校正因子fS/A、fS/B、fS/C、fS/D、fS/E、fS/F的影響，結果顯示RSD依次為1.47%、1.19%、1.26%、0.65%、1.38%、0.73%，結果見表3。表明不同儀器對各成分的fS/I無顯著性差異。

表3 不同儀器對fS/I的影響

2.6.2.2 不同色譜柱對fS/I的影響試驗考察了4種色譜柱Merck Purospher STARRP-18 endcapped、Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18、Agilent ZORBAX RX-C18、Agilent ZORBAX SB-C18對槐花顆粒中6種有效成分綠原酸、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、槲皮素的相對校正因子fS/A、fS/B、fS/C、fS/D、fS/E、fS/F的影響，結果顯示RSD依次為1.00%、1.61%、1.99%、0.79%、1.94%、0.42%，結果見表4。表明不同色譜柱對各成分的fS/I無顯著性差異。

表4 不同色譜柱對fS/I的影響

2.6.2.3 不同柱溫對fS/I的影響試驗考察了同一色譜柱（Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18）不 同 柱 溫（20℃、25℃、30℃、35℃）對槐花顆粒中6種有效成分綠原酸、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、槲皮素的相對校正因子fS/A、fS/B、fS/C、fS/D、fS/E、fS/F的影響，結果顯示RSD依次為0.88%、0.77%、1.20%、0.39%、1.16%、0.66%，結果見表5。表明不同柱溫對各成分的fS/I無顯著性差異。

表5 不同柱溫對fS/I的影響

2.6.2.4 不同操作人員對fS/I的影響試驗考察了3名試驗人員對槐花顆粒中6種有效成分綠原酸、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、槲皮素的相對校正因子fS/A、fS/B、fS/C、fS/D、fS/E、fS/F的影響，結果顯示RSD依次為0.50%、0.63%、0.98%、0.39%、1.18%、0.23%，結果見表6。表明不同試驗人員對各成分的fS/I無顯著性差異。

表6 不同試驗人員對fS/I的影響

2.6.2.5 不同流速對fS/I的影響試驗考察了3種流速（0.8 ml/min、1 ml/min、1.2 ml/min）對槐花顆粒中6種有效成分綠原酸、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、槲皮素的相對校正因子fS/A、fS/B、fS/C、fS/D、fS/E、fS/F的影響，結果顯 示RSD依 次 為0.80%、1.39%、0.92%、0.39%、1.21%、0.33%，結果見表7。表明不同流速對各成分的fS/I無顯著性差異。

2.6.3 色譜峰定位參數考察利用相對保留時間（rI/S）進行峰定位，r（I/S）=tR（I）/tR（S）（注：I為待測成分，S為內參物），測得綠原酸、蘆丁、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、槲皮素的相對保留時間（rI/S）的結果，見表8。不同色譜條件所的到相對保留值變動較小，rA/S、rB/S、rC/S、rD/S、rE/S、rF/S的RSD（%）均＜2%，表明采用rI/S對綠原酸、蘆丁、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、槲皮素進行色譜峰的定位良好。

表8 不同儀器和色譜柱測得的相對保留時間

2.6.4 QAMS法與外標法測定結果比較取6批次的樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.4”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，分別采用外標法和QAMS法計算各批次樣品中綠原酸、蘆丁、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、槲皮素含量，并采用t檢驗對結果進行比較分析，結果見表9。結果顯示，兩組數據的方差無顯著性差異（P＞0.05），表明兩種方法計算的含量無顯著性差異，一測多評法用于槐花顆粒的多成分質量評價研究是可行的。

表9 QAMS法與外標法測定結果比較 （mg/g）

3 討 論

3.1 準確度的判斷判斷QAMS法的準確度，大多是將外標法實測值與QAMS法計算的結果進行t檢驗后進行評價，如果2種方法測定結果無顯著性差異，則說明QAMS法是準確的。如黃帥等［5］在應用QAMS法測定柴胡藥材中幾種不同皂苷的含量時，采用t檢驗法來評價QAMS法的準確性和科學性。另外，還可以利用夾角余弦算法來證明QAMS法計算結果與外標法有無顯著性差異，陳馳等［6］在應用QAMS法測定人參中不同人參皂苷的含量時就是采用夾角余弦算法來進行驗證。t檢驗法較夾角余弦算法更簡單易行，且認可度較高，因此，本文采用t檢驗法對QAMS法和外標法的測定結果進行精準度的判斷。

3.2 內參物的選擇研究發(fā)現，槐花顆粒中的綠原酸具有抑菌、抗氧化、抗病毒等作用［7］；蘆丁具有維生素P樣作用和抗菌抗炎等作用［8］；甘草苷具有抗抑郁、保護神經、保肝、抗氧化等作用［9］；木犀草苷具有呼吸系統(tǒng)及心腦血管保護作用、抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗病毒等作用［10］；蒙花苷具有抗衰老、抗缺氧和促進凝血等作用［11］；木犀草素具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、消炎、抗過敏等作用［12］；槲皮素具有抗氧化、清除自由基和免疫調節(jié)等作用［13］。所以本試驗選取上述7種成分為目標化合物，且上述成分含量相對較高，能作為槐花顆粒質量評價的指標。其中蘆丁化學性質穩(wěn)定，在槐花顆粒處方中含量較高，且蘆丁易于制備，價格便宜，將其作為內參物時，相對校正因子較穩(wěn)定，能體現QAMS法操作便捷、成本低以及效率高的特點，故選擇蘆丁為內參物。

3.3 QAMS法對待測色譜峰定位的重現性考察參考相關文獻［14-16］，本試驗通過考察不同品牌的高效液相色譜儀和色譜柱中各待測成分與蘆丁內參物rI/S的重現性。試驗結果顯示，可通過蘆丁與槐花顆粒中另外6種成分的相對保留時間來實現色譜峰定位，且相對保留時間的測定經常用于色譜研究中，重現性可靠，方法簡便，可操作性強。

本試驗建立的一測多評法適用于槐花顆粒中7種有效成分的含量測定，相對校正因子穩(wěn)定；該法不僅節(jié)約檢測成本、縮短檢測時間，而且簡化了槐花顆粒的定量檢測方法，具有很強的實用性，可為槐花顆粒后續(xù)的質量評價提供參考。