韋振源,龔敏陽,鐘 江,楊正騰,陳 朝,吳 霜,馬家寶,黃 慶
(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530023)
壯藥凈癬洗劑是廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科鐘江教授治療足癬、手癬、頭癬、體癬的經(jīng)驗(yàn)方,其臨床療效良好,且無明顯不良反應(yīng)[1]。凈癬洗劑由土荊皮、功勞木、蛇床子、白鮮皮、地膚子、苦參、廣藿香等中藥組成,具有清熱解毒、消炎止痛、消腫殺蟲止癢等功效;尤其是在皮膚病滲出期不宜使用外用藥膏階段,可使用凈癬洗劑收斂殺菌,提高臨床治愈率。為保證臨床安全用藥,本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜法鑒別處方中功勞木、苦參中藥材,并采用高效液相色譜法對(duì)苦參堿進(jìn)行含量測(cè)定,現(xiàn)報(bào)道如下。
1.1 儀器YOKO-CS紫外線透射反射成像儀(武漢藥科新技術(shù)開發(fā)有限公司);LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司);GH-252電子分析天平(日本A&D公司);CD-UPT超純水機(jī)(成都越純科技有限公司);KQ5200DB超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司);pHS-3E pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司);HH-2水浴鍋(金壇市科研儀器有限公司);G型薄層層析硅膠板(規(guī)格為20cm×20cm,青島海洋工廠);毛細(xì)管(國藥控投有限公司)。
1.2 試劑和對(duì)照品功勞木對(duì)照藥材(批號(hào):121461-201503)、鹽酸小檗堿(批號(hào):110713-201212)、苦參對(duì)照藥材(批號(hào):121019-201006)、苦參堿對(duì)照品(批號(hào):110805-200508,供含量測(cè)定用)均由中國食品藥品檢定研究院提供;乙腈(色譜純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);甲醇(分析純,西隴科學(xué)股份有限公司);磷酸(色譜純,上海展云化工有限公司);三乙胺(色譜純,成都市科隆化學(xué)品有限公司);三氯甲烷(分析純,成都市科隆化學(xué)品有限公司);濃氨水(分析純,西隴科學(xué)股份有限公司);純化水為實(shí)驗(yàn)室自制。
1.3 樣品凈癬洗劑(批號(hào):20191110、20191202、20191226)及陰性樣品均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室制備。
2.1 功勞木的薄層鑒別[2]
2.1.1 對(duì)照品溶液的制備取功勞木對(duì)照藥材0.1 g,加10 ml甲醇超聲處理15 min,濾過,蒸干,殘?jiān)蛹状? ml使溶解,作為對(duì)照藥材溶液。另取鹽酸小檗堿對(duì)照品,加甲醇制成每1 ml含0.2 mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。
2.1.2 供試品溶液的制備取凈癬洗劑10 ml,置寬口錐形瓶中,蒸干,殘?jiān)蛹状?0 ml,超聲處理15 min,濾過,濾液蒸干,殘?jiān)蛹状? ml使溶解,作為供試品溶液。
2.1.3 缺功勞木陰性溶液的制備取缺功勞木藥材制成的陰性樣品10 ml,同2.1.2項(xiàng)供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。
2.1.4 薄層層析照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0502)試驗(yàn),分別吸取供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各2 μl,對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液各1 μl,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)為展開劑,展開,展距約8.0 cm,取出,晾干,紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中,在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn),而陰性無此斑點(diǎn)。結(jié)果見圖1。
圖1 功勞木薄層色譜圖
2.2 苦參的薄層鑒別[2]
2.2.1 對(duì)照品溶液的制備取苦參對(duì)照藥材0.2 g,置磨口錐形瓶中,加25 ml氯仿、0.3 ml濃氨水,超聲處理15 min,濾過,蒸干,殘?jiān)勇确? ml使溶解,制成對(duì)照藥材溶液。另取苦參堿對(duì)照品,加乙醇制成每1 ml含0.2 mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。
2.2.2 供試品溶液的制備取凈癬洗劑5 ml,置磨口錐形瓶中,蒸干,殘?jiān)?5 ml氯仿、0.3 ml濃氨水,超聲處理15 min,放置過夜,濾過,濾液蒸干,殘?jiān)勇确? ml使溶解,作為供試品溶液。
2.2.3 缺苦參陰性溶液的制備取缺苦參藥材制成的陰性樣品5 ml,同2.2.2項(xiàng)供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。
2.2.4 薄層層析照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0502)試驗(yàn),分別吸取供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各2 μl,對(duì)照藥材溶液5 μl、對(duì)照品溶液3 μl,點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以甲苯-丙酮-甲醇(8∶3∶0.5)為展開劑,展開,展距8 cm,取出,晾干,再以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水(2∶4∶2∶1)10℃以下放置的上層溶液為展開劑,展開,展距8 cm,取出,晾干,依次噴以碘化鉍鉀試液和亞硝酸鈉乙醇試液。供試品色譜中,在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同的橙色斑點(diǎn),而陰性無此斑點(diǎn)。結(jié)果見圖2。
圖2 苦參薄層色譜圖
2.3 苦參堿的含量測(cè)定參照文獻(xiàn)[3]方法,采用高效液相色譜法對(duì)苦參中苦參堿進(jìn)行定量測(cè)定。
2.3.1 色譜條件色譜柱:Inertsil ODS-3柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈-0.1%磷酸溶液(10∶90),用三乙胺調(diào)pH值至6.5;流速:1.0 ml/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10 μl;檢測(cè)波長:220 nm;理論塔板數(shù)以苦參堿峰計(jì)算不小于4 000;苦參堿分離度大于1.5。
2.3.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱定苦參堿對(duì)照品5 mg,加入甲醇溶解并定容至10 ml容量瓶中,搖勻,制成每1 ml含0.5 mg苦參堿的對(duì)照品溶液。
2.3.3 供試品溶液的制備精密量取凈癬洗劑5 ml,轉(zhuǎn)移至分液漏斗,加入2 ml濃氨水,輕輕搖勻。用氯仿提取3次,每次10 ml,收集3次氯仿液,于60℃水浴鍋上蒸干,將得到的殘?jiān)燃尤脒m量的甲醇溶解,再轉(zhuǎn)移定容至50 ml容量瓶中,搖勻,0.22 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。
2.3.4 陰性對(duì)照溶液的制備按處方稱取除苦參以外的各味藥材,并參考“2.3.3”項(xiàng)下的方法制成陰性對(duì)照溶液。
2.3.5 專屬性試驗(yàn)分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μl,注入高效液相色譜儀測(cè)定,記錄色譜圖。對(duì)照品溶液中苦參堿色譜峰的保留時(shí)間為20.574 min,在供試品溶液中,苦參堿色譜峰保留時(shí)間為20.012 min,兩者出峰時(shí)間對(duì)應(yīng)。而陰性對(duì)照品中在對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間無色譜峰吸收,表明陰性樣品對(duì)測(cè)定無干擾。結(jié)果見圖3。
圖3 HPLC色譜圖
2.3.6 線性關(guān)系考察精密吸取上述對(duì)照品溶液,按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件,分別進(jìn)樣2 μl、4 μl、6 μl、8 μl、10 μl、12 μl、14 μl、16 μl、20 μl,測(cè)定相應(yīng)的峰面積值,并記錄下來。以苦參堿進(jìn)樣量(X,μg)為橫坐標(biāo),峰面積(Y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程為Y=74 133X-5 914.7(r2=0.999 7)。結(jié)果表明,苦參堿的進(jìn)樣量在1~10 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。
2.3.7 精密度試驗(yàn)精密吸取苦參堿對(duì)照品溶液(0.5 mg/ml)10 μl,按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,并記錄峰面積值,以峰面積計(jì)算苦參堿的RSD為1.73%(n=6)。結(jié)果表明儀器精密度良好。
2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)選取同一供試品溶液(批號(hào)為20191108),分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣測(cè)定,并記錄峰面積值,結(jié)果苦參堿的峰面積RSD為1.40%(n=6),表明供試品溶液中苦參堿在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。
2.3.9 重復(fù)性試驗(yàn)選取凈癬洗劑(批號(hào)為20191108)1份,按“2.3.3”項(xiàng)下方法平行制備成6份供試品溶液,再按“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積值。結(jié)果苦參堿含量分別為:16.368 6 mg/ml、16.297 6 mg/ml、15.711 0 mg/ml、16.096 9 mg/ml、16.345 0 mg/ml、16.568 2 mg/ml,平均值為16.23 mg/ml,RSD為1.87%(n=6),表明該方法重復(fù)性良好。
2.3.10 加樣回收率試驗(yàn)精密量取已知含量的樣品(批號(hào)為20191108,濃度為16.23 mg/ml)5 ml,共6份,再精密加入22.6 mg/ml的苦參堿對(duì)照品1.0 ml,按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備成6份供試品溶液,分別按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,記錄峰面積值,計(jì)算加樣回收率。結(jié)果平均回收率為100.77%,RSD為0.60%(n=6),表明該方法準(zhǔn)確度較好。結(jié)果見表1。
表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)
2.3.11 樣品含量測(cè)定取3批不同批次的凈癬洗劑,每批各取3份,按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果見表2。
表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果 (n=3)
3.1 檢測(cè)波長的考察通過查閱《中華人民共和國藥典》2015版一部[4]203和相關(guān)文獻(xiàn)[5]記載,苦參堿在215~225 nm處有較大的吸收峰,為保證得到較好的檢測(cè)結(jié)果,故本次實(shí)驗(yàn)中選擇220 nm作為檢測(cè)波長。
3.2 供試品提取方法的考察絕大多數(shù)的生物堿在水中的溶解度幾乎為0,但在一些有機(jī)溶劑中有著較高的溶解度。在本實(shí)驗(yàn)的供試品制備中,經(jīng)查閱有關(guān)文獻(xiàn)[6-7],比較了乙醚與氯仿對(duì)苦參堿提取效果的影響,最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:使用氯仿的提取效果更佳,可較大程度地提取其中的有效成分,且相應(yīng)色譜峰無干擾雜質(zhì),分離度較好。
3.3 流動(dòng)相的考察在使用苦參堿對(duì)照品進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)中,對(duì)甲醇-水-三乙胺(50∶50∶0.05)[6]、乙腈-甲醇-磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)-三乙胺(22∶22∶70∶0.1)[8]等多種流動(dòng)相進(jìn)行考察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)基線不穩(wěn)定,苦參堿色譜峰分離度和峰形較差,有拖尾現(xiàn)象,對(duì)峰面積值的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性有影響,隨后選用乙腈-0.1%磷酸溶液(用三乙胺調(diào)pH值至7.6)[4]895。通過調(diào)整流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸溶液的組成比例(10∶90、20∶80、25∶75、30∶70),發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙腈的組成比例增加時(shí),苦參堿的出峰時(shí)間也隨之變短(分別為25.945 min、17.463 min、12.589 min、8.649 min),考慮到后期需通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值來改善峰形,為得到合適的保留時(shí)間,故選擇乙腈-0.1%磷酸溶液的組成比例為10∶90。在對(duì)0.1%磷酸溶液的pH值進(jìn)行優(yōu)化時(shí),發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相在pH=6.5時(shí),苦參堿色譜峰與溶劑峰分離度好,無干擾,保留時(shí)間適中,且拖尾現(xiàn)象得到改善。
3.4 誤差分析從本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來看,苦參堿的保留時(shí)間不完全一致對(duì)應(yīng),有較大的誤差。有可能是因?yàn)榱鲃?dòng)相中的0.1%磷酸溶液(用三乙胺調(diào)pH值至6.5)為實(shí)驗(yàn)人員自行配制,存在過濾不全、流動(dòng)相不均勻等問題,從而導(dǎo)致保留時(shí)間的提前或延后。
3.5 小結(jié)本文采用薄層色譜法,以專屬性好的對(duì)照品及對(duì)照藥材為對(duì)照,對(duì)功勞木、苦參進(jìn)行定性鑒別研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,各供試品色譜中,在與對(duì)照品及對(duì)照藥材相應(yīng)的色譜位置上有相同橙黃色的熒光斑點(diǎn),相應(yīng)藥材空白對(duì)照無干擾,專屬性良好。在含量測(cè)定項(xiàng)中,建立了HPLC法測(cè)定凈癬洗劑中苦參堿總含量的方法,通過方法學(xué)考察和含量測(cè)定,提示該方法可行性強(qiáng)、操作簡單、準(zhǔn)確可靠,可為凈癬洗劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定和深入研究提供參考依據(jù)。