壯藥凈癬洗劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

韋振源，龔敏陽(yáng)，鐘 江，楊正騰，陳 朝，吳 霜，馬家寶，黃 慶

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023）

壯藥凈癬洗劑是廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科鐘江教授治療足癬、手癬、頭癬、體癬的經(jīng)驗(yàn)方，其臨床療效良好，且無(wú)明顯不良反應(yīng)［1］。凈癬洗劑由土荊皮、功勞木、蛇床子、白鮮皮、地膚子、苦參、廣藿香等中藥組成，具有清熱解毒、消炎止痛、消腫殺蟲止癢等功效；尤其是在皮膚病滲出期不宜使用外用藥膏階段，可使用凈癬洗劑收斂殺菌，提高臨床治愈率。為保證臨床安全用藥，本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜法鑒別處方中功勞木、苦參中藥材，并采用高效液相色譜法對(duì)苦參堿進(jìn)行含量測(cè)定，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器YOKO-CS紫外線透射反射成像儀（武漢藥科新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）；LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；GH-252電子分析天平（日本A&D公司）；CD-UPT超純水機(jī)（成都越純科技有限公司）；KQ5200DB超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；pHS-3E pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；HH-2水浴鍋（金壇市科研儀器有限公司）；G型薄層層析硅膠板（規(guī)格為20cm×20cm，青島海洋工廠）；毛細(xì)管（國(guó)藥控投有限公司）。

1.2 試劑和對(duì)照品功勞木對(duì)照藥材（批號(hào)：121461-201503）、鹽酸小檗堿（批號(hào)：110713-201212）、苦參對(duì)照藥材（批號(hào)：121019-201006）、苦參堿對(duì)照品（批號(hào)：110805-200508，供含量測(cè)定用）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；乙腈（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；磷酸（色譜純，上海展云化工有限公司）；三乙胺（色譜純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；三氯甲烷（分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；濃氨水（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；純化水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 樣品凈癬洗劑（批號(hào)：20191110、20191202、20191226）及陰性樣品均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 功勞木的薄層鑒別［2］

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備取功勞木對(duì)照藥材0.1 g，加10 ml甲醇超聲處理15 min，濾過(guò)，蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。另取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 ml含0.2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備取凈癬洗劑10 ml，置寬口錐形瓶中，蒸干，殘?jiān)蛹状?0 ml，超聲處理15 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液。

2.1.3 缺功勞木陰性溶液的制備取缺功勞木藥材制成的陰性樣品10 ml，同2.1.2項(xiàng)供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.1.4 薄層層析照薄層色譜法（《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則0502）試驗(yàn)，分別吸取供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各2 μl，對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液各1 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，展距約8.0 cm，取出，晾干，紫外燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性無(wú)此斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 功勞木薄層色譜圖

2.2 苦參的薄層鑒別［2］

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備取苦參對(duì)照藥材0.2 g，置磨口錐形瓶中，加25 ml氯仿、0.3 ml濃氨水，超聲處理15 min，濾過(guò)，蒸干，殘?jiān)勇确? ml使溶解，制成對(duì)照藥材溶液。另取苦參堿對(duì)照品，加乙醇制成每1 ml含0.2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備取凈癬洗劑5 ml，置磨口錐形瓶中，蒸干，殘?jiān)?5 ml氯仿、0.3 ml濃氨水，超聲處理15 min，放置過(guò)夜，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)勇确? ml使溶解，作為供試品溶液。

2.2.3 缺苦參陰性溶液的制備取缺苦參藥材制成的陰性樣品5 ml，同2.2.2項(xiàng)供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.2.4 薄層層析照薄層色譜法（《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則0502）試驗(yàn)，分別吸取供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各2 μl，對(duì)照藥材溶液5 μl、對(duì)照品溶液3 μl，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮-甲醇（8∶3∶0.5）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，展距8 cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水（2∶4∶2∶1）10℃以下放置的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，展距8 cm，取出，晾干，依次噴以碘化鉍鉀試液和亞硝酸鈉乙醇試液。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙色斑點(diǎn)，而陰性無(wú)此斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 苦參薄層色譜圖

2.3 苦參堿的含量測(cè)定參照文獻(xiàn)［3］方法，采用高效液相色譜法對(duì)苦參中苦參堿進(jìn)行定量測(cè)定。

2.3.1 色譜條件色譜柱：Inertsil ODS-3柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（10∶90），用三乙胺調(diào)pH值至6.5；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μl；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；理論塔板數(shù)以苦參堿峰計(jì)算不小于4 000；苦參堿分離度大于1.5。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱定苦參堿對(duì)照品5 mg，加入甲醇溶解并定容至10 ml容量瓶中，搖勻，制成每1 ml含0.5 mg苦參堿的對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備精密量取凈癬洗劑5 ml，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加入2 ml濃氨水，輕輕搖勻。用氯仿提取3次，每次10 ml，收集3次氯仿液，于60℃水浴鍋上蒸干，將得到的殘?jiān)燃尤脒m量的甲醇溶解，再轉(zhuǎn)移定容至50 ml容量瓶中，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 陰性對(duì)照溶液的制備按處方稱取除苦參以外的各味藥材，并參考“2.3.3”項(xiàng)下的方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3.5 專屬性試驗(yàn)分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀測(cè)定，記錄色譜圖。對(duì)照品溶液中苦參堿色譜峰的保留時(shí)間為20.574 min，在供試品溶液中，苦參堿色譜峰保留時(shí)間為20.012 min，兩者出峰時(shí)間對(duì)應(yīng)。而陰性對(duì)照品中在對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間無(wú)色譜峰吸收，表明陰性樣品對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 HPLC色譜圖

2.3.6 線性關(guān)系考察精密吸取上述對(duì)照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣2 μl、4 μl、6 μl、8 μl、10 μl、12 μl、14 μl、16 μl、20 μl，測(cè)定相應(yīng)的峰面積值，并記錄下來(lái)。以苦參堿進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為Y=74 133X-5 914.7（r2=0.999 7）。結(jié)果表明，苦參堿的進(jìn)樣量在1～10 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.3.7 精密度試驗(yàn)精密吸取苦參堿對(duì)照品溶液（0.5 mg/ml）10 μl，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，并記錄峰面積值，以峰面積計(jì)算苦參堿的RSD為1.73%（n=6）。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)選取同一供試品溶液（批號(hào)為20191108），分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣測(cè)定，并記錄峰面積值，結(jié)果苦參堿的峰面積RSD為1.40%（n=6），表明供試品溶液中苦參堿在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.9 重復(fù)性試驗(yàn)選取凈癬洗劑（批號(hào)為20191108）1份，按“2.3.3”項(xiàng)下方法平行制備成6份供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積值。結(jié)果苦參堿含量分別為：16.368 6 mg/ml、16.297 6 mg/ml、15.711 0 mg/ml、16.096 9 mg/ml、16.345 0 mg/ml、16.568 2 mg/ml，平均值為16.23 mg/ml，RSD為1.87%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.10 加樣回收率試驗(yàn)精密量取已知含量的樣品（批號(hào)為20191108，濃度為16.23 mg/ml）5 ml，共6份，再精密加入22.6 mg/ml的苦參堿對(duì)照品1.0 ml，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備成6份供試品溶液，分別按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積值，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果平均回收率為100.77%，RSD為0.60%（n=6），表明該方法準(zhǔn)確度較好。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n=6）

2.3.11 樣品含量測(cè)定取3批不同批次的凈癬洗劑，每批各取3份，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果 （n=3）

3 討論與小結(jié)

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的考察通過(guò)查閱《中華人民共和國(guó)藥典》2015版一部［4］203和相關(guān)文獻(xiàn)［5］記載，苦參堿在215～225 nm處有較大的吸收峰，為保證得到較好的檢測(cè)結(jié)果，故本次實(shí)驗(yàn)中選擇220 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 供試品提取方法的考察絕大多數(shù)的生物堿在水中的溶解度幾乎為0，但在一些有機(jī)溶劑中有著較高的溶解度。在本實(shí)驗(yàn)的供試品制備中，經(jīng)查閱有關(guān)文獻(xiàn)［6-7］，比較了乙醚與氯仿對(duì)苦參堿提取效果的影響，最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：使用氯仿的提取效果更佳，可較大程度地提取其中的有效成分，且相應(yīng)色譜峰無(wú)干擾雜質(zhì)，分離度較好。

3.3 流動(dòng)相的考察在使用苦參堿對(duì)照品進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)甲醇-水-三乙胺（50∶50∶0.05）［6］、乙腈-甲醇-磷酸鹽緩沖液（pH=6.8）-三乙胺（22∶22∶70∶0.1）［8］等多種流動(dòng)相進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基線不穩(wěn)定，苦參堿色譜峰分離度和峰形較差，有拖尾現(xiàn)象，對(duì)峰面積值的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性有影響，隨后選用乙腈-0.1%磷酸溶液（用三乙胺調(diào)pH值至7.6）［4］895。通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸溶液的組成比例（10∶90、20∶80、25∶75、30∶70），發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙腈的組成比例增加時(shí)，苦參堿的出峰時(shí)間也隨之變短（分別為25.945 min、17.463 min、12.589 min、8.649 min），考慮到后期需通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值來(lái)改善峰形，為得到合適的保留時(shí)間，故選擇乙腈-0.1%磷酸溶液的組成比例為10∶90。在對(duì)0.1%磷酸溶液的pH值進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相在pH=6.5時(shí)，苦參堿色譜峰與溶劑峰分離度好，無(wú)干擾，保留時(shí)間適中，且拖尾現(xiàn)象得到改善。

3.4 誤差分析從本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)看，苦參堿的保留時(shí)間不完全一致對(duì)應(yīng)，有較大的誤差。有可能是因?yàn)榱鲃?dòng)相中的0.1%磷酸溶液（用三乙胺調(diào)pH值至6.5）為實(shí)驗(yàn)人員自行配制，存在過(guò)濾不全、流動(dòng)相不均勻等問(wèn)題，從而導(dǎo)致保留時(shí)間的提前或延后。

3.5 小結(jié)本文采用薄層色譜法，以專屬性好的對(duì)照品及對(duì)照藥材為對(duì)照，對(duì)功勞木、苦參進(jìn)行定性鑒別研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各供試品色譜中，在與對(duì)照品及對(duì)照藥材相應(yīng)的色譜位置上有相同橙黃色的熒光斑點(diǎn)，相應(yīng)藥材空白對(duì)照無(wú)干擾，專屬性良好。在含量測(cè)定項(xiàng)中，建立了HPLC法測(cè)定凈癬洗劑中苦參堿總含量的方法，通過(guò)方法學(xué)考察和含量測(cè)定，提示該方法可行性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確可靠，可為凈癬洗劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定和深入研究提供參考依據(jù)。