寒痹康湯通過Notch調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路及調(diào)節(jié)T細(xì)胞糖代謝治療RA的作用機(jī)制研究

龐學(xué)豐，林 菊，韋夏惠，黃政治，馮玉青，吳燕紅，王思思，廖家瑜，李玉玲

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種難以治愈的慢性自身免疫性疾病，其致殘率高，未經(jīng)系統(tǒng)治療者后期常出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形和功能喪失，迄今為止仍無根治性藥物［1］。RA的發(fā)生、發(fā)展涉及包括PI3K/Akt信號(hào)通路在內(nèi)的多種信號(hào)通路。研究表明糖代謝影響T細(xì)胞的功能，與RA的發(fā)病密切相關(guān)。甲氨蝶呤治療RA效果明顯，二甲雙胍對(duì)RA模型小鼠關(guān)節(jié)癥狀具有改善作用，也具有治療RA的功效［2］。本研究采用CⅡ乳劑進(jìn)行皮下注射誘導(dǎo)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠模型，分別予不同劑量的寒痹康湯提取物藥液進(jìn)行灌胃，并與甲氨蝶呤、二甲雙胍進(jìn)行對(duì)照，觀察寒痹康湯通過Notch調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)T細(xì)胞糖代謝的變化情況。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物清潔級(jí)Wistar雌性大鼠140只，體質(zhì)量為（100±10）g，購(gòu)于長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司［動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2019-0013］，放置于廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行喂養(yǎng)。

1.2 試藥本研究造模所用的弗氏不完全佐劑和牛Ⅱ型膠原蛋白從美國(guó)Chondrex公司購(gòu)買；甲氨蝶呤片（國(guó)藥準(zhǔn)字H22022674）為通化茂祥制藥有限公司產(chǎn)品；二甲雙胍片（國(guó)藥準(zhǔn)字H13021647）為河北天成藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；寒痹康湯提取物由我院新藥研發(fā)中心制備成浸膏，按照本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)要求，于大鼠灌胃時(shí)，臨用前將浸膏加入溶液（由乙醇和生理鹽水按比例組成）中進(jìn)行溶解，配制成實(shí)驗(yàn)所需濃度為2×10-7g/L的溶液。

1.3 試劑單克隆抗體Notch1蛋白（Cell Signaling Technology）；單克隆抗體Hes1蛋白（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：BST17494488）；單克隆抗體Jagged1蛋白［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，批號(hào)：XF3828084］；單克隆抗體PI3K蛋白（批號(hào)：10016961）、單克隆抗體Akt蛋白（批號(hào)：10022173）、單克隆抗體mTOR蛋白（批號(hào)：10018370）、單克隆抗體β-肌動(dòng)蛋白（β-actin，批號(hào)：10024215）、單克隆抗體Glut1蛋白（批號(hào)：21829-1-AP）、單克隆抗體c-Myc蛋白（批號(hào)：10828-1-AP）均購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；單克隆抗體HIF1蛋白（Affinity Biosciences，貨號(hào)：70h9774）；多克隆抗體己糖激酶（HK，批號(hào)：00107731）、多克隆抗體葡萄糖激酶（GK，批號(hào)：00023801）和多克隆抗體磷酸果糖激酶（PFK，批號(hào)：00082470）均購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：thermo scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，批號(hào)：01182505］；上機(jī)試劑盒：Hieff qPCR SYBR Green Master Mix［翌圣生物科技（上海）股份有限公司，批號(hào)：H2102161］。

1.4 主要儀器328041H01型超低溫冰箱（Thermo Fisher Scientific）；JXFSTPRP-CL型全自動(dòng)樣品冷凍研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（Thermo Fisher Scientific）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（BioTek Instruments）；五段程控金屬?。ㄌ旄萍加邢薰荆?；BIO-RAD電泳儀（Mini-Protean Tetra Cell）；WI53711型超微量分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific）；熒光定量PCR儀（LightCycler 96 Instrument）；Amersham ImageQuant 800型超靈敏多功能成像儀（ChemiDoc MP）；2J3181型熒光正置顯微鏡（Olympus BX53F）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模及分組將140只清潔級(jí)Wistar雌性大鼠置于專用飼養(yǎng)籠中進(jìn)行喂養(yǎng)，觀察其適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后無異常，隨機(jī)選取出20只作為空白組，剩余的120只大鼠則參照文獻(xiàn)［3］中的方法給予注射CⅡ乳劑進(jìn)行造模：將弗氏不完全佐劑和牛Ⅱ型膠原蛋白按實(shí)驗(yàn)配制方法充分混勻，制成符合標(biāo)準(zhǔn)的CⅡ乳劑（混勻后液體滴入水中呈油包水狀）并保存于4℃冰箱備用。在進(jìn)行大鼠造模時(shí)，分別在大鼠的頸部和背部注射0.2 ml的CⅡ乳劑，間隔14 d后再次按照此前的注射方法和劑量進(jìn)行注射1次。按照文獻(xiàn)［3］的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)造模是否成功進(jìn)行判斷，造模成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)：大鼠四肢的足爪已經(jīng)出現(xiàn)嚴(yán)重腫脹，并且踝關(guān)節(jié)直徑經(jīng)測(cè)量發(fā)現(xiàn)其增長(zhǎng)幅度≥2 mm者，則評(píng)為4分，≥4分則表明造模成功。由本研究組兩位成員進(jìn)行觀察判斷，并進(jìn)行詳細(xì)記錄。造模成功后，再通過隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、甲氨蝶呤組、二甲雙胍組、寒痹康湯提取物低劑量組、寒痹康湯提取物中劑量組、寒痹康湯提取物高劑量組，每組20只。本實(shí)驗(yàn)研究按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)的相關(guān)要求處理所用大鼠。

2.2 給藥按實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行，模型組大鼠按20 ml/kg予生理鹽水進(jìn)行灌胃，每天1次；甲氨蝶呤組大鼠灌服濃度為13.5 mg/kg的甲氨蝶呤藥液，每周1次；二甲雙胍組予1.35 g/kg濃度的二甲雙胍藥液進(jìn)行灌胃，每天2次；而寒痹康湯提取物低、中、高劑量組大鼠分別灌胃給予不同劑量的寒痹康湯提取物（28.13 g/kg、56.25 g/kg、112.5 g/kg），每天2次；低、中、高劑量根據(jù)文獻(xiàn)［4］進(jìn)行計(jì)算得出：即按70 kg人體質(zhì)量與200 g大鼠的換算系數(shù)進(jìn)行計(jì)算?？瞻捉M大鼠則任其自由飲水、進(jìn)食與活動(dòng)。

2.3 標(biāo)本采集和相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)給藥治療36 d后，各組大鼠均用水合氯醛進(jìn)行麻醉，充分麻醉后于無菌條件下采集大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜，其中一部分立即放入凍存管并置于液氮罐保存，后移置于-80℃冰箱保存，留待以RT-PCR、Western blot法進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)；另取一部分置于10%中性福爾馬林液浸泡保存，留待以免疫組織化學(xué)法檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，所有檢測(cè)均按照試劑盒說明按步驟進(jìn)行。

2.4 RT-PCR法檢測(cè)各組大鼠滑膜組織Notch1、Hes1、Jagged1、PI3K、Akt、mTOR及Glut1、HIF1、c-Myc mRNA的基因表達(dá)取各組大鼠滑膜組織分別放入1.5 ml離心管，加入無酶研磨珠及1 ml Trizol溶液，置低溫研磨機(jī)中研磨3 min。將研磨好的組織勻漿取出后室溫靜置10 min，離心（4℃，12 000 rpm）5 min。再加入200 μl的Buffer EX，快速顛倒混勻，室溫靜置3 min。離心（4℃，12 000 rpm）15min，用移液槍吸取中上層水相約450 μl至新的1.5 ml離心管中。加入同體積預(yù)冷的異丙醇，室溫靜置10 min。離心（4℃，12 000 rpm）10 min，棄上清液。加入1 ml預(yù)冷的75%乙醇（無菌無酶水配制）洗滌沉淀。離心（4℃，7 500 rpm）5 min，棄去上清液，室溫靜置10 min以去除殘余乙醇。加入20 μl的無菌無酶水溶解Total-RNA，用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度。Notch1、Hes1、Jagged1、PI3K、Akt、mTOR、Glut1、HIF1、c-Myc特異性引物設(shè)計(jì)及合成根據(jù)NCBI GenBank已公布的大鼠Notch1、Hes1、Jagged1、PI3K、Akt、mTOR、Glut1、HIF、c-Myc和GAPDH、cDNA序列，利用PrimerPremier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)10對(duì)特異性引物，交由上海捷瑞生物工程有限公司合成，合成引物序列見表1。

表1 合成引物序列表

2.5 Western blot法檢測(cè)各組大鼠滑膜組織Notch1、Hes1、Jagged1、PI3K、Akt、mTOR及Glut1、HIF1、c-Myc的蛋白表達(dá)取各組大鼠的滑膜組織樣本，分別放入預(yù)先加入PMSF的RIPA裂解液中進(jìn)行提取滑膜組織中的總蛋白，通過BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度后，加入蛋白上樣緩沖液，在100℃條件下變性；分別使用7.5%和10%PAGE凝膠電泳分離等量的總蛋白質(zhì)（電壓80～120 v，90 min），然后在低溫條件下電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上（電流350 mA，50～150 min）；在室溫下使用無蛋白快速封閉液將膜浸潤(rùn)10 min；使用1×TBST溶液洗膜后分別使用相應(yīng)蛋白的一抗、β-actin一抗（稀釋比例均為1∶5 000）于4℃孵育12 h；TBST洗膜后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔/大鼠IgG二抗（稀釋比例1∶5 000）于室溫孵育1 h；膜上加入超靈敏化學(xué)ECL檢測(cè)試劑盒中1∶1的A、B液避光反應(yīng)1 min后，使用超靈敏多功能成像儀將膜顯影成像。使用Image J軟件測(cè)定各蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參檢測(cè)各蛋白的表達(dá)水平。

2.6 免疫組化法檢測(cè)各組大鼠滑膜組織HK、GK、PFK蛋白表達(dá)取10%中性福爾馬林液固定的大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，常規(guī)石蠟包埋切片，常規(guī)脫蠟脫水，PBS液浸泡，一抗孵育過夜，PBS沖洗，標(biāo)記二抗，緩沖液沖洗后DAB顯色，純水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明干燥，封片。光鏡下拍攝免疫組化染色圖片，采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析，將圖片灰度值轉(zhuǎn)換成光密度值，通過測(cè)量檢測(cè)區(qū)域的面積（Area）、累積光密度（integrated optical density，IOD），計(jì)算平均光密度（mean optical density，MOD）值，MOD=IOD/Area，MOD值作為滑膜組織的蛋白表達(dá)量。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Image J軟件讀取蛋白條帶灰度值，以灰度值作為蛋白的表達(dá)量，然后計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量，采用GraphPad Prism 9.4.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析及制圖。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 RT-PCR法檢測(cè)治療前后各組大鼠滑膜組織Notch1、Hes1、Jagged1、Akt、PI3K、mTOR、Glut1、HIF1、c-Myc基因表達(dá)情況與空白組比較，模型組大鼠滑膜中Notch1、Hes1、Jagged1、PI3K、Akt、mTOR、Glut1、HIF1、c-Myc的基因表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；治療后，與模型組比較，甲氨蝶呤、二甲雙胍及寒痹康湯提取物低、中、高劑量組Notch1、Hes1、Jagged1、PI3K、Akt、mTOR、Glut1、HIF1、c-Myc基因的表達(dá)水平均下降（P＜0.05）；寒痹康湯提取物低、中、高劑量組與甲氨蝶呤、二甲雙胍組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織Notch1、Hes1、Jagged1、Akt、PI3K、mTOR、Glut1、HIF1和c-Myc基因表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織Notch1、Hes1、Jagged1、Akt、PI3K、mTOR、Glut1、HIF1和c-Myc基因表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與甲氨蝶呤組比較，③P＞0.05；與二甲雙胍組比較，④P＞0.05；所有比較均經(jīng)過Bonferroni校正

組 別空白組模型組甲氨蝶呤組二甲雙胍組寒痹康湯提取物低劑量組寒痹康湯提取物中劑量組寒痹康湯提取物高劑量組FP n 20 20 20 20 20 20 20 Notch1 1.05±0.20 1.40±0.18①0.49±0.15②④0.99±0.09②③0.74±0.14②③④0.77±0.34②③④0.75±0.10②③④14.30 0.000 Hes1 1.13±0.08 2.24±0.59①1.38±0.25②④0.89±0.32②③0.68±0.32②③④0.85±0.23②③④0.77±0.37②③④9.74 0.000 Jagged1 0.99±0.42 2.28±0.27①0.77±0.29②④0.79±0.31②③1.15±0.32②③④1.18±0.36②③④0.99±0.49②③④6.54 0.000 Akt 1.01±0.13 2.15±1.02①1.15±0.27②④1.32±0.44②③1.26±0.59②③④1.33±0.53②③④0.79±0.25②③④5.65 0.000 PI3K 1.09±0.47 2.63±0.86①1.57±0.46②④1.55±0.32②③0.97±0.44②③④1.35±0.45②③④1.11±0.24②③④5.91 0.000組 別空白組模型組甲氨蝶呤組二甲雙胍組寒痹康湯提取物低劑量組寒痹康湯提取物中劑量組寒痹康湯提取物高劑量組FP n 20 20 20 20 20 20 20 mTOR 1.09±0.47 2.63±0.86①1.57±0.46②④1.55±0.32②③0.97±0.44②③④1.35±0.45②③④1.11±0.24②③④9.03 0.001 Glut1 1.08±0.14 1.91±0.37①1.10±0.22②④0.67±0.28②③1.00±0.21②③④0.99±0.32②③④0.95±0.49②③④5.27 0.002 HIF1 1.22±0.43 2.91±0.53①1.01±0.44②④0.74±0.13②③0.84±0.36②③④1.19±0.51②③④0.96±0.33②③④5.09 0.002 c-Myc 1.08±0.42 1.94±0.42①0.66±0.22②④0.81±0.09②③1.07±0.39②③④0.98±0.24②③④1.14±0.46②③④7.10 0.000

3.2 Western blot法檢測(cè)治療前后各組大鼠滑膜組織Notch1、Hes1、Jagged1、Akt、PI3K、mTOR、Glut1、HIF1、c-Myc蛋白表達(dá)情況與空白組比較，模型組大鼠滑膜中Notch1、Hes1、Jagged1、PI3K、Akt、mTOR、Glut1、HIF1、c-Myc的蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；治療后，與模型組比較，甲氨蝶呤、二甲雙胍及寒痹康湯提取物低、中、高劑量組Notch1、Hes 1、Jagged1、PI3K、Akt、mTOR、Glut1、HIF1、c-Myc蛋白的表達(dá)水平均下降（P＜0.05）；寒痹康湯低、中、高劑量組與甲氨蝶呤、二甲雙胍組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1、表3。

圖1 各組大鼠滑膜組織Notch1、Hes1、Jagged1、Akt、PI3K、mTOR、Glut1、HIF1、c-Myc蛋白表達(dá)條帶圖

表3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織Notch1、Hes1、Jagged1、Akt、PI3K、mTOR、Glut1、HIF1和c-Myc蛋白表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織Notch1、Hes1、Jagged1、Akt、PI3K、mTOR、Glut1、HIF1和c-Myc蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與甲氨蝶呤組比較，③P＞0.05；與二甲雙胍組比較，④P＞0.05；所有比較均經(jīng)過Bonferroni校正

組 別空白組模型組甲氨蝶呤組二甲雙胍組寒痹康湯提取物低劑量組寒痹康湯提取物中劑量組寒痹康湯提取物高劑量組FP n 20 20 20 20 20 20 20 Notch1 0.29±0.07 0.57±0.06①0.32±0.05②④0.28±0.08②③0.34±0.06②③④0.25±0.10②③④0.13±0.06②③④10.90 0.000 Hes1 0.27±0.03 0.57±0.10①0.25±0.08②④0.26±0.06②③0.22±0.05②③④0.20±0.03②③④0.19±0.06②③④13.54 0.000 Jagged1 0.39±0.03 0.69±0.16①0.42±0.04②④0.35±0.09②③0.28±0.05②③④0.21±0.07②③④0.26±0.01②③④11.72 0.000 Akt 0.24±0.04 0.54±0.08①0.25±0.04②④0.28±0.07②③0.24±0.04②③④0.22±0.06②③④0.19±0.04②③④13.64 0.000 PI3K 0.31±0.08 0.61±0.07①0.30±0.03②④0.24±0.07②③0.21±0.02②③④0.20±0.06②③④0.19±0.02②③④20.74 0.000組 別空白組模型組甲氨蝶呤組二甲雙胍組寒痹康湯提取物低劑量組寒痹康湯提取物中劑量組寒痹康湯提取物高劑量組FP n 20 20 20 20 20 20 20 mTOR 0.38±0.14 0.78±0.11①0.48±0.07②④0.47±0.06②③0.31±0.09②③④0.39±0.04②③④0.41±0.13②③④7.22 0.001 Glut1 0.15±0.06 0.36±0.01①0.16±0.02②④0.17±0.03②③0.12±0.04②③④0.07±0.02②③④0.13±0.05②③④15.97 0.000 HIF1 0.39±0.05 0.66±0.05①0.37±0.06②④0.42±0.01②③0.42±0.02②③④0.33±0.07②③④0.38±0.09②③④11.54 0.000 c-Myc 0.31±0.03 0.54±0.07①0.29±0.05②④0.33±0.02②③0.35±0.04②③④0.29±0.05②③④0.35±0.01②③④14.38 0.000

3.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)治療前后各組大鼠滑膜組織HK、GK、PFK蛋白表達(dá)情況與空白組比較，模型組大鼠滑膜中HK、GK和PFK的蛋白達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；治療后，與模型組比較，甲氨蝶呤、二甲雙胍及寒痹康湯提取物低、中、高劑量組HK、GK和PFK蛋白的表達(dá)水平均下降（P＜0.05）；寒痹康湯提取物低、中、高劑量組與甲氨蝶呤、二甲雙胍組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、表4。

圖2 各組大鼠滑膜組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（蘇木素色，×200，棕黃色代表陽性表達(dá)顆粒），標(biāo)尺=50μm

表4 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織HK、GK和PFK蛋白表達(dá)比較 （±s）

表4 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織HK、GK和PFK蛋白表達(dá)比較 （±s）

注：與空白組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與甲氨蝶呤組比較，③P＞0.05；與二甲雙胍組比較，④P＞0.05；所有比較均經(jīng)過Bonferroni校正

組 別空白組模型組甲氨蝶呤組二甲雙胍組寒痹康湯提取物低劑量組寒痹康湯提取物中劑量組寒痹康湯提取物高劑量組FP n 20 20 20 20 20 20 20 HK 0.31±0.00 0.36±0.00①0.32±0.01②④0.33±0.01②③0.32±0.01②③④0.34±0.01②③④0.32±0.01②③④15.266 0.000 GK 0.32±0.01 0.36±0.01①0.32±0.01②④0.32±0.01②③0.33±0.00②③④0.33±0.01②③④0.32±0.01②③④14.483 0.000 PFK 0.30±0.00 0.35±0.01①0.32±0.01②④0.33±0.01②③0.33±0.01②③④0.31±0.01②③④0.32±0.01②③④29.297 0.000

4 討論

中醫(yī)學(xué)把RA歸屬于“痹病”“尪痹”等范疇，認(rèn)為其發(fā)病的內(nèi)因是人體正氣虧虛，外因是風(fēng)寒濕之邪內(nèi)襲，扶正祛邪為其基本治則，臨床上應(yīng)在此基礎(chǔ)上進(jìn)行辨證論治以及隨癥加減用藥。寒痹康湯是筆者治療RA的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由秦艽、黃芪、防風(fēng)、熟附子、麻黃、當(dāng)歸、青風(fēng)藤、淫羊藿、狗脊組成，內(nèi)含補(bǔ)腎和抗風(fēng)濕藥；課題組成員多年來開展了寒痹康湯治療寒濕型RA的臨床研究，結(jié)果表明其副作用少、療效較顯著［5］。

RA的病因迄今未明，其發(fā)生、發(fā)展過程以及出現(xiàn)的骨質(zhì)破壞和由此破壞產(chǎn)生的功能障礙，存在多種信號(hào)通路和炎性因子的共同參與，其中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在其中發(fā)揮著重要的作用。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，其由調(diào)節(jié)亞基PIK3R、p85及催化亞基PIK3C、pIIO等共同組成，這些酶與下游的Akt和mTOR在細(xì)胞分化、代謝、存活和增殖過程中起到重要的作用［6］。Liu等［7］研究提示，酒精可激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的下游分子P70S6K，下調(diào)Runx2，減少骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSCs）的成骨分化，上調(diào)過氧化物酶增殖物激活受體γ（PPARγ），增加BMMSCs的成脂分化，從而引起骨質(zhì)疏松。研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt通路在RA滑膜細(xì)胞中廣泛存在并處于異常激活的狀態(tài)，并且與RA患者的成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS）凋亡異常密切相關(guān)［8］。進(jìn)一步的研究證實(shí)，RA患者的滑膜細(xì)胞中存在Akt過度表達(dá)，PI3K可以活化Akt，而Akt能磷酸化多種靶蛋白產(chǎn)生抑制細(xì)胞凋亡的效應(yīng)；抑制異?；罨腜I3K/Akt通路可以誘導(dǎo)RA患者FLS的凋亡，從而起到顯著的治療RA作用。

研究結(jié)果證實(shí)不同的淋巴細(xì)胞在RA中具有不同的功能，現(xiàn)在已經(jīng)明確了輔助性淋巴細(xì)胞（helper T cells，Th）-1、Th17等T細(xì)胞在RA的發(fā)病中起到重要作用。研究表明，糖代謝可影響T細(xì)胞的功能，與RA的發(fā)病密切相關(guān)，而糖代謝紊亂與RA的發(fā)病具有密切的聯(lián)系，在RA的滑膜組織和血漿中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1（glucose transporter 1，Glut1）和糖酵解活性均有提高［9-11］。在RA滑膜組織和血漿中，醛縮酶、烯醇化酶、磷酸己糖異構(gòu)酶及葡萄糖6磷酸酶等代謝失調(diào)可以誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的活化和一些炎癥因子（如IL-17、TNF-α、IFN-γ）、自身抗體的產(chǎn)生，造成慢性炎癥反應(yīng)以及骨質(zhì)破壞［12-13］。RA中T細(xì)胞的分化增殖與糖代謝也具有密切的聯(lián)系，Th17細(xì)胞分化需要IL-6刺激，IL-6能夠活化mTOR，進(jìn)而導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）和糖酵解關(guān)鍵酶的過表達(dá)，糖酵解增強(qiáng)，表明上調(diào)T細(xì)胞糖酵解活性是Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵［14］。

轉(zhuǎn)錄因子c-Myc（c-Myc）能夠促進(jìn)T細(xì)胞的活化，并且能夠激活糖酵解中的關(guān)鍵酶，缺乏c-Myc的T細(xì)胞中多種糖酵解關(guān)鍵酶水平下降，從而阻礙了T細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖［15］。Glut1是c-Myc的一個(gè)重要靶點(diǎn)，靜息狀態(tài)下T細(xì)胞中Glut1的表達(dá)水平較低，活化的T細(xì)胞通過絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（serine-threonine kinase，Akt）途徑迅速轉(zhuǎn)錄，使糖酵解加速，增加了己糖激酶（hex-okinase，HK）和磷酸果糖激酶（phosphofruetokinase，PFK）的活性。葡萄糖激酶（GK）是HK家族的一種亞型，是人體內(nèi)唯一可以作為葡萄糖傳感器的HK，而HK是細(xì)胞內(nèi)葡萄糖攝取和利用過程中不可缺少的關(guān)鍵酶，是維持促進(jìn)葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞所需的梯度濃度的重要因素。所以說Glut1是支持效應(yīng)T細(xì)胞功能的關(guān)鍵酶。Macintyre等［16］研究發(fā)現(xiàn)Glut1是T細(xì)胞活化的關(guān)鍵，Glut1的缺乏可以導(dǎo)致效應(yīng)T細(xì)胞的分化受限。

Akt的下游基因是哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)（mTOR），而mTOR信號(hào)通路能上調(diào)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)，并且能激活糖酵解途徑［17-18］。已有資料指出，Notch可以誘導(dǎo)PI3K/Akt通路的激活，而此通路對(duì)糖代謝和有氧糖酵解的調(diào)控作用是已經(jīng)明確且被領(lǐng)域所公認(rèn)［19］。Maekawa等［19］報(bào)道Glut1參與調(diào)控記憶性CD4+T細(xì)胞的免疫活性，Akt磷酸化水平的降低導(dǎo)致Glut1的低表達(dá)，而Akt磷酸化水平受Notch調(diào)控，因此Notch信號(hào)通路可能參與了調(diào)控記憶性CD4+T細(xì)胞的免疫功能。Notch信號(hào)通路調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化與功能，從而參與了骨重建過程［21］。應(yīng)用Notch信號(hào)通路調(diào)節(jié)劑介導(dǎo)骨生成可以治療骨質(zhì)疏松等骨?。?2］。

甲氨蝶呤治療RA療效明確，是公認(rèn)的錨定藥和臨床常用藥，且常被選為實(shí)驗(yàn)研究的對(duì)照組用藥。二甲雙胍治療RA獲得較好效果的研究時(shí)有報(bào)導(dǎo)，如Fan等［23］通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍通過抑制小鼠全身炎癥和滑膜炎，進(jìn)而抑制軟骨層基質(zhì)降解、破骨細(xì)胞形成以及軟骨細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到骨保護(hù)作用。鄭魏等［24］在臨床研究中發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能夠促進(jìn)RA患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞中Treg細(xì)胞增長(zhǎng)，降低Th17/Treg比值并維持平衡狀態(tài)，能緩解患者病情，其副作用少、安全性高。基于對(duì)以上理論和研究進(jìn)展的認(rèn)識(shí)和了解，我們開展了寒痹康湯治療RA的研究，并選擇甲氨蝶呤和二甲雙胍作為對(duì)照藥物，觀察寒痹康湯提取物對(duì)CIA大鼠有關(guān)指標(biāo)的影響，并與兩個(gè)對(duì)照藥物進(jìn)行比較。

本實(shí)驗(yàn)觀察寒痹康湯提取物對(duì)CIA大鼠相關(guān)指標(biāo)的影響，研究結(jié)果表明寒痹康湯能通過Notch調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，從而調(diào)節(jié)T細(xì)胞糖代謝達(dá)到治療RA的作用，此為寒痹康湯提取物治療RA的機(jī)制之一。