貴州產(chǎn)望江南子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

譚 霖，龍 瀅

(黔東南州食品藥品檢驗檢測中心，貴州 凱里 556000)

望江南子為豆科植物望江南CassiaoccidentalisL.的干燥成熟種子。秋季摘取果實，曬干，打下種子，除去雜質(zhì)，是中醫(yī)臨床的用藥之一。本品始載于《救荒本草》[1]，在我省為常用中藥，1975年始在羅甸、望謨等氣候較高地區(qū)發(fā)現(xiàn)野生。《貴州省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》1988年版收載為“望江南”，最近的《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2003版收載“望江南子”。主要成分為蒽醌類及其苷類成分：含有大黃素甲醚，大黃酸，大黃酚，蘆薈大黃素[4]；揮發(fā)性成分 ：水蒸氣蒸餾法提取望江南子中的揮發(fā)性成分的實驗中，共分離了101個化學(xué)成分，鑒別出86個化學(xué)成分，占揮發(fā)油總量的90.07%，其主要成分為香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、葉綠醇、6，10，14-三甲基-2-十五烷酮、法尼基丙酮、正己醛、α-紫羅酮，含量最多的是香葉基丙酮[5]?，F(xiàn)我省使用的望江南子以野生為主，無規(guī)?；N植，經(jīng)過實地考察研究我省分布于羅甸、望謨、冊享、安龍等地。

按貴州省藥品監(jiān)督管理局對《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》換版要求，根據(jù)任務(wù)我組人員到安龍、冊亨、羅甸實地采集樣品，采集的臘葉標(biāo)本由貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥實驗室的孫慶文教授鑒定確認(rèn)，樣品來源見表1，原植物形態(tài)見圖1。

表1 樣品來源Tab.1 Sample sources

圖1 原植物形態(tài)Fig.1 Original plant morphology

將野外采集的3個藥材果實樣品曬干，打下種子，除去雜質(zhì)，按照《中藥鑒定學(xué)》[2]和《藥用植物學(xué)》[3]的性狀鑒定方法，對藥材樣品的大小、形狀、顏色、質(zhì)地、斷面等特征進(jìn)行對比觀察和描述。發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的藥材除了在大小方面稍有差異，其他特征相對比較穩(wěn)定。該藥材的性狀鑒別特征，呈扁卵形，直徑3～4 mm，外表黃綠色、灰綠色或紫棕色，略有光澤，凹凸不平，兩面中央均有一橢圓形平坦的疤痕，疤痕四周有白色網(wǎng)紋。先端有一短尖突起，形似鳥喙，其內(nèi)側(cè)有點狀種臍。質(zhì)堅硬，除去種皮后可見2片黃色或黃棕色的子葉。氣微，味微苦，嚼之有豆腥味。外觀見圖2。

圖2 藥材外觀Fig.2 Appearance of the medicinal material

1 顯微鑒別

將3個樣品分別粉碎，常規(guī)粉末制片。

1.1 儀器與試劑

萊卡DM2500顯微鏡和LAS V3.8顯像系統(tǒng)，以及常規(guī)顯微制片載玻片、蓋玻片、鑷子、水合氯醛、稀甘油、蒸餾水等。

1.2 方法

3個藥材樣品進(jìn)行常規(guī)粉末制片，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡對其組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)、后含物等進(jìn)行觀察、測量和描述，并對具有代表性的特征進(jìn)行拍照和繪圖。

歸納總結(jié)得粉末顯微特征為：本品粉末黃棕色。種皮柵狀細(xì)胞成片，無色至淡黃色，橫面觀細(xì)胞1列，狹長方形，壁較厚，光輝帶1條位于細(xì)胞近1/2處；表面觀呈類多角形，壁皺縮，細(xì)胞被較厚角質(zhì)層。種皮支持細(xì)胞1列，斷面觀方形，三面增厚，長10～25 μm；表面觀呈類圓形或多角形，直徑20～50 μm，并可見上下兩層同心圓圈。角質(zhì)層碎片表面觀可見多角形網(wǎng)脈樣紋理。內(nèi)胚乳細(xì)胞壁粘液質(zhì)化，胞腔內(nèi)物質(zhì)為黃棕色至紅棕色(圖3)。由于本品橫切面組織特征在鑒別上意義不大，故不予列出，列于此以供參考。

圖3 粉末顯微特征(10×40倍)Fig.3 Microscopic characteristics of the powder(10×40 times)

2 薄層色譜

根據(jù)望江南子的主要成分，本次實驗對望江南子貴州產(chǎn)3個地方樣品進(jìn)行了試驗，該方法色譜斑點清晰，易于檢出，重現(xiàn)性好。

供試品溶液制備：取藥材粉末約0.5 g，加入鹽酸-甲醇(1∶10)混合溶液25 mL，置水浴鍋上加熱回流30分鐘，取下放冷，過濾，濾液蒸干，殘渣加入乙酸乙酯2 mL溶解即得。對照品溶液制備：精密稱定大黃素甲醚對照品(中國食品藥品檢定研究院 批號：110758-200509 含量95.6%)，加乙酸乙酯溶解使?jié)舛燃s為0.5 mg/mL。薄層板：青島海洋化工有限公司制造硅膠H板(批號：20170811)。點樣：對照品2 μL，供試品5 μL。展開劑：正己烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10∶2∶0.5∶0.05)。顯色及檢視：置氨蒸汽中熏。結(jié)果：供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(圖4)。

圖4 薄層色譜圖Fig.4 TLC

2.1 薄層條件選擇

2.1.1 提取溶劑的考察

望江南子中含有大黃素甲醚、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素等有效成分，這些蒽醌類有效成分大多都是游離型蒽醌，一般選用乙醇、甲醇作為提取溶劑，可以把不同類型、性質(zhì)互異的蒽醌類成分提取出來，由于甲醇的溶解度大于乙醇，本次實驗的提取溶劑為甲醇。

2.1.2 提取方法的考察

提取游離型蒽醌，可以用稀酸水解后，用有機溶劑提取。比較了加熱回流和超聲提取后，發(fā)現(xiàn)加熱回流更適于本實驗，層析后的斑點更清晰。

2.1.3 水解時間的考察

本實驗對鹽酸水解的時間在對比試驗中分別設(shè)計了三個時間段。分別為30 min、60 min以及120 min，多次實驗后發(fā)現(xiàn)這三個時間段所提取的有效成分在色譜圖效果無明顯差異，所以本次實驗所取時間為30 min。

2.1.4 展開劑的選擇

本試驗對望江南子的展開劑進(jìn)行了比較和研究[6]，文獻(xiàn)報道的展開劑為石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)，因望江南子與決明子同為豆科植物又同為決明屬，因此也參考了決明子的薄層鑒別的展開劑石油醚(30～60℃)-丙酮(2∶1)，經(jīng)過多次反復(fù)研究，最終選用了正己烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10∶2∶0.5∶0.05)的比例作為望江南子薄層定性鑒別的展開劑。

2.1.5 薄層板的選擇

比較了硅膠G薄板，H板，結(jié)果表明，鑒別望江南子中大黃素甲醚的薄層鑒別實驗，使用硅膠H板作為吸附劑時，色譜圖上的斑點清晰、集中、重現(xiàn)性好、所提供的信息量大。

2.1.6 檢視條件

望江南子的主要成分是羥基蒽醌類，其在堿性條件下顯色，故選擇用氨蒸汽熏顯色檢視。

2.2 耐用性考察

2.2.1 不同薄層板的比較

青島海洋化工有限公司制造硅膠H板(批號：20170811)與青島勝海精細(xì)硅膠化工有限公司制造硅膠H板(批號：20150319)，分別按擬定的試驗方法試驗。結(jié)果表明，兩種薄層板斑點均清晰且分離較好。

2.2.2 不同溫度的比較

取點樣于青島海洋化工有限公司制造硅膠H板(批號：20170811)后的薄層板，分別在5℃和28℃的溫度環(huán)境下進(jìn)行展開。結(jié)果表明該方法對不同溫度的適應(yīng)性較好。

2.2.3 不同濕度的比較

取點樣于青島海洋化工有限公司制造硅膠H板(批號：20170811)后的薄層板，分別在28%和88%的濕度中展開。結(jié)果表明該方法對低濕環(huán)境的適應(yīng)性較好。

經(jīng)上述方法學(xué)驗證試驗，結(jié)果表明薄層板方面，青島海洋化工有限公司制造硅膠H板與青島勝海精細(xì)硅膠化工有限公司制造硅膠H板均可達(dá)到分離效果，且分離效果好、斑點集中；不同溫度濕度變化可導(dǎo)致色譜效果略有不同，均能達(dá)到鑒別需要。驗證及復(fù)核實驗?zāi)軌蜉^好重現(xiàn)，因此本方法耐用性良好。

3 水分

依照《中國藥典》2015版第四部通則0832水分測定法第二法，分別取三個地區(qū)的望江南子藥材測定水分。其值得9.80%～10.5%，均值為10.2%(結(jié)果見表2)，根據(jù)藥材測得的水分范圍和浮動20%，建議將藥材水分定為不得過13.0%。

表2 水分、總灰分、浸出物檢測數(shù)據(jù)Tab.2 Detection data of moisture，total ash and extract

望江南子為種子類藥材，含有少量揮發(fā)性物質(zhì)，因甲苯法適用于含有揮發(fā)性的物質(zhì)，烘干法適用于不含或少含揮發(fā)性的物質(zhì)，本次試驗比較了四部通則0832水分測定法的第四法(甲苯法)和第二法(烘干法)測定望江南子的水分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種方法下測出來的水分含量差異不大(見表2)，又因甲苯法需要的甲苯較多且甲苯本身對人體的中樞神經(jīng)傷害很大，烘干法簡便，對人體無明顯傷害，所以結(jié)合經(jīng)濟(jì)及健康情況考慮，本次實驗的水分含量的測定方法選用了烘干法。

4 總灰分

依照《中國藥典》2015版第四部通2302，分別取三個地方的望江南子藥材測定總灰分。其值得3.5%～3.8%，均值為3.6%(結(jié)果見表2)，根據(jù)藥材測得的總灰分范圍和浮動20%，建議將藥材總灰分定為不得過5.0%。

5 浸出物

依照《中國藥典》2015版第四部通則2201中的醇性浸出物熱浸法，以乙醇為溶劑，取三個地區(qū)的望江南子藥材測定浸出物，以干燥品計算浸出量其值得8.1%～8.8%，均值為8.4%(結(jié)果見表2)。根據(jù)藥材測得的范圍和浮動20%，建議將藥材浸出物定為不低于6.0%。

5.1 浸出物提取溶劑的考查

根據(jù)望江南子藥材所含主要化學(xué)成分浸出物的測定，采用有機溶劑更具經(jīng)濟(jì)性、安全性和穩(wěn)定性。實驗比較了甲醇和乙醇這兩種有機溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提取溶劑為甲醇時，浸出物的含量要高于乙醇為溶劑的含量。但出于安全性方面考慮，甲醇具有毒性對人體易造成傷害，所以本次實驗選用了乙醇作為提取溶劑。

5.2 浸出物提取方法的考察

實驗比較了熱浸出物和冷浸出物這兩種方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熱浸法更適于本實驗，因為和冷浸法比較起來，熱浸法提取的含量更高、更穩(wěn)定。

6 揮發(fā)油

本品依照《中國藥典》2015版第四部通則2204中的甲法對3個樣品進(jìn)行揮發(fā)油測定，結(jié)果揮發(fā)油含量均低于0.1%，其不適合用于作質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

7 含量測定

試驗試圖建立望江南子藥材所含化學(xué)成分較高的大黃素甲醚高效液相色譜法含量測定，但在實驗過程中發(fā)現(xiàn)供試品溶液制備后其中大黃素甲醚成分不穩(wěn)定，且回收率達(dá)不到要求，所以放棄建立高效液相色譜含量測定方法以建立浸出物測定方法代替。

8 結(jié)果和討論

經(jīng)過研究本品呈扁卵形，直徑3～4 mm，外表黃綠色、灰綠色或紫棕色，略有光澤，凹凸不平，兩面中央均有一橢圓形平坦的疤痕，疤痕四周有白色網(wǎng)紋；先端有一短尖突起，形似鳥喙，其內(nèi)側(cè)有點狀種臍；質(zhì)堅硬，除去種皮后可見2片黃色或黃棕色的子葉；氣微，味微苦，嚼之有豆腥味。顯微特征，本品粉末黃棕色，種皮柵狀細(xì)胞成片，無色至淡黃色，橫面觀細(xì)胞1列，狹長方形，壁較厚，光輝帶1條位于細(xì)胞近1/2處；表面觀呈類多角形，壁皺縮，細(xì)胞被較厚角質(zhì)層；種皮支持細(xì)胞1列，斷面觀方形，三面增厚，長10～25 μm；表面觀呈類圓形或多角形，直徑20～50 μm，并可見上下兩層同心圓圈；角質(zhì)層碎片表面觀可見多角形網(wǎng)脈樣紋理；胚乳細(xì)胞壁粘液質(zhì)化，胞腔內(nèi)物質(zhì)為黃棕色至紅棕色。薄層鑒別，取藥材粉末0.5 g，加入鹽酸-甲醇(1∶10)混合溶液25 mL加熱回流30分鐘，取下放冷，過濾，濾液蒸干，殘渣加乙酸乙酯2 mL使溶解，作為供試品溶液；取大黃素甲醚對照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作對照品溶液；吸取供試品溶液5 μL，對照品溶液2 μL，分別點于同一硅膠H薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10∶2∶0.5∶0.05)為展開劑，展開，取出，晾干；置氨蒸汽中熏，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，呈相同顏色的斑點。水分，不得超過13.0%。總灰分，不得超過5.0%。浸出物，照醇溶性浸出物測定法的熱浸法測定，用乙醇作溶劑，不得少于6.0%。

因望江南的特殊生長習(xí)性要求，在貴州省野生分布范圍較少，本次研究采集到的樣品有限，但也能基本代表貴州產(chǎn)望江南子藥材的質(zhì)量。本次研究沒有完成含量測定指標(biāo)，需要在今后的研究中找到代表成分進(jìn)一步完善。