響應面法優(yōu)化大蝎子草水溶性總黃酮提取工藝及其水提液抗氧化活性分析*

董 賀，李 軍，晉海軍，唐曉琴，趙澤林，孫恒燦，張麗艷

(貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025)

大蝎子草是蕁麻科蝎子草屬植物大蝎子草(Girardiniadiversifolia(Link)Friis)的新鮮或干燥的全草，其為貴州省苗族、布依族等少數(shù)民族民間用藥，主要分布于貴州、云南、四川等地。大蝎子草用藥歷史悠久，《楚彝本草》、《滇藥錄》、《藏本草》等均有記載，其味苦、辛，性涼，有小毒，具有祛風除濕，活血化瘀的功效，常用于治療風濕麻木，跌撲損傷，骨折，坐骨神經痛，腎炎等[1]。截止到目前為止，對大蝎子草的研究以及報道較少，且相關文獻大多數(shù)為藥理研究[2-5]，對其黃酮類化合物研究極少，黃酮類化合物具有抗氧化、抗病毒，保肝、抗癌、抗炎等藥理作用，并且植物源黃酮類化合物具有天然低毒的特點[6]。本文采用回流提取的方式來提取大蝎子草水溶性總黃酮，通過Box-Behnken響應面法優(yōu)化其提取工藝，并設計其抗氧化活性試驗，為后期大蝎子草研究提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 試驗藥材與試劑

試驗用大蝎子草均產自貴州貴陽，經貴州中醫(yī)藥大學魏升華教授鑒定為蕁麻科蝎子草屬植物大蝎子草(Girardiniadiversifolia(Link)Friis)的干燥全草。芹菜素對照品(成都普思生物科技股份有限公司，含量≥98%，批號：PS010177)；DPPH(源葉生物科技有限公司，含量≥98%，批號：S08GS160451)；ABTS+(上海麥克林生化科技有限公司，含量≥99%，批號：C12819523)；過硫酸鉀(上海麥克林生化科技有限公司，含量≥99%，批號：C13043573)；維生素C(天津市科密歐化學試劑有限公司，含量≥98%，批號：20191202)；乙醇(重慶川東化工(集團)有限公司，含量≥99.7%)為分析純，蒸餾水，超純水均由貴州中醫(yī)藥大學藥物分析實驗室提供。

1.2 儀器

電子分析天平(梅特勒托勒斯，XS205)；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；紫外分光光度計(島津企業(yè)管理(中國)有限公司，型號：UV-2501PC)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海浦東物理光學儀器廠，HH-4)。

2 方法

2.1 標準曲線的制作

參照徐旖旎等[7]的方法，準確稱取10.05 mg的芹菜素標準品，置于25 mL容量瓶中，乙醇溶解并定容至刻度，精密吸取溶液3 mL，以60%乙醇定容于25 mL容量瓶中，得質量濃度為0.04824 mg/mL的芹菜素標準溶液。分別精密吸取上述標準溶液1mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL于25 mL容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度。以95%乙醇為空白對照，在269 nm下測定其吸光度值。以芹菜素濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制芹菜素標準曲線。

2.2 大蝎子草水溶性總黃酮提取及含量測定

精密稱取10 g大蝎子草干燥藥材，按照一定的浸泡時間、料液比和提取時間進行提取，抽濾，所有樣品均提取兩次，合并兩次濾液，濃縮至50 mL，精密吸取2 mL濃縮液，水浴揮干，用60%乙醇進行溶解并定容于25 mL容量瓶中并精密吸取2 mL溶液，95%乙醇定容于25 mL容量瓶中，作為待測液，按“2.1”項下方法測定吸光度并計算待測液中水溶性總黃酮得率。水溶性總黃酮得率公式：

(1)

式(1)中：W為大蝎子草水溶性總黃酮得率(%)；C為水溶性總黃酮的濃度(mg/mL)；V為待測液液體積；X為稀釋倍數(shù)；M為大蝎子草質量(mg)。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗

按“2.1”項下方法測定芹菜素對照品溶液吸光度6次，計算RSD為0.38%，表明精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗

按“2.2”項下方法提取水溶性總黃酮，分別在0 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min時按照“2.1”項下的方法測定吸光度值，計算的RSD為0.27%，表明大蝎子草水溶性總黃酮提取液在150 min內穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復性試驗

按“2.2”項下方法提取6樣品溶液，計算其水溶性總黃酮含量RSD為0.42%，表明該方法重復性良好。

2.3.4 加樣回收率試驗

精密稱取5 g已知含量大蝎子草干燥藥材6份，標準品加入量與所取供試品含量之比為1∶1的比例加入芹菜素標準品，按“2.2”項下方法制備待測液溶液，并計算回收率，平均回收率為101.46%，RSD為1.55%。

2.4 單因素試驗

分別考察浸泡時間(0 min、30 min、60 min、90 min、120 min)、料液比(1∶10 g/mL、1∶14 g/mL、1∶18 g/mL、1∶22 g/mL、1∶26 g/ mL)、提取時間(30 min、60 min、90 min、120 min、150 min)對大蝎子草水溶性總黃酮得率的影響。

2.5 響應面試驗設計

以大蝎子草水溶性總黃酮含量(Y)為響應值，浸泡時間(A)、料液比(B)、提取時間(C)為影響因素，設計3因素3水平響應面試驗，各因素水平見表1。

表1 設計實驗因素與水平Tab.1 Factors and levels of the experiment

2.6 抗氧化活性測定

2.6.1 DPPH自由基清除能力測定

參照桂利利等[8]的方法，略有改動。配置濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液。分別精密吸取2 mL不同濃度的大蝎子草水溶性總黃酮提取液和VC溶液，置于具塞試管中，再分別加入2 mL DPPH溶液，暗處避光反應30 min，離心取上清液，以無水乙醇進行調零，于517 nm處測吸光度值，根據(jù)公式(2)計算清除率，并計算半數(shù)抑制率IC50值[9]。

DPPH清除率公式：

(2)

式(2)中：A0為2 mL蒸餾水+2 mL DPPH溶液的吸光度值；A1為2 mL樣品+2 mL DPPH溶液的吸光度值；A2為2 mL樣品+2 mL無水乙醇溶液的吸光度值。

2.6.2 ABTS自由基清除能力測定

參照柴美靈等[10]的方法，精密配置7 mmol/L的ABTS溶液和2.5 mmol/L的過硫酸鉀溶液，分別精密吸取5 mL室溫下混合，避光反應12～16 h，即得ABTS工作液，使用前以無水乙醇進行稀釋，使其在734 nm下吸光度值為0.7±0.02。分別精密吸取0.3 mL不同濃度的大蝎子草水溶性總黃酮提取液和VC溶液，置于具塞試管中，再分別加入2.7 mL稀釋后的ABTS溶液，暗處避光反應30 min，離心取上清液，以無水乙醇進行調零，于734 nm處測吸光度值，根據(jù)公式計算清除率，并計算半數(shù)抑制率IC50值。ABTS清除率公式如式(2)。式中：A0為0.3 mL蒸餾水+2.7 mL ABTS溶液的吸光度值；A1為0.3 mL樣品+2.7 mL ABTS溶液的吸光度值；A2為0.3 mL樣品+2.7 mL無水乙醇溶液的吸光度值。

3 結果與分析

3.1 標準曲線的繪制

本實驗建立的芹菜素標準曲線，所得曲線方程y=0.06653x+0.02387，R2=0.99948，說明芹菜素在1.92960～11.57760 μg/mL范圍內線性關系良好，本實驗可根據(jù)此方程來計算大蝎子草中水溶性總黃酮的含量。

3.2 單因素試驗結果

3.2.1 浸泡時間對水溶性總黃酮得率的影響

如圖1所示，浸泡時間在30 min～60 min內，大蝎子草水溶性總黃酮得率隨著浸泡時間的增加緩慢提高，在60 min時，黃酮得率達到最大值0.54%，隨著浸泡時間繼續(xù)增大，水溶性總黃酮得率稍有降低，曲線趨于平緩，因此，浸泡60 min為最佳浸泡時間。

3.2.2 料液比對水溶性總黃酮得率的影響

如圖2，料液比在1∶10 g/mL～1∶18 g/mL之間時，大蝎子草水溶性總黃酮得率呈遞增趨勢，當料液比為1∶18 g/mL時，大蝎子草水溶性總黃酮得率達到最大0.55%，繼續(xù)加大料液比，總黃酮得率下降，因此，最佳料液比為1∶18 g/mL。

圖1 浸泡時間對大蝎子草水溶性總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of soaking time on the yield of water-soluble total flavonoids in Girardinia diversifolia

圖2 料液比對大蝎子草水溶性總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the yield of water-soluble total flavonoids in Girardinia diversifolia

3.2.3 提取時間對水溶性總黃酮得率的影響

如圖3所示，提取時間在30 min～60 min時，大蝎子草水溶性總黃酮得率呈上升趨勢，當提取時間為60 min時，大蝎子草水溶性總黃酮得率達到峰值0.56%，隨著提取時間的增加，水溶性總黃酮得率下降并逐漸趨于平緩，因此，最佳提取時間為60 min。

圖3 提取時間對大蝎子草水溶性總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of water-soluble total flavonoids in Girardinia diversifolia

3.3 響應面優(yōu)化結果與分析

根據(jù)單因素試驗結果，設計Box-Behnken試驗，方案及結果如表2所示。

采用Design-Expert8.0.6軟件對表2的試驗數(shù)據(jù)進行響應面回歸擬合，得到水溶性總黃酮含量響應值(Y)和各變量(A、B、C)之間的二次回歸模型為：Y=5.24+0.14A+0.17B+0.30C+0.16AB-0.17AC-0.074BC-0.32A2-0.50B2-0.40C2。

表2 Box-Behnken試驗設計和結果Tab.2 Design and results of Box-Behnken experiment

對該方程的回歸分析和方差分析如表3所示。

表3 方差分析結果Tab.3 Results of variance analysis

由表3可知，二次多項式擬合模型極顯著(P=0.0037<0.01)，失擬項不顯著(P=0.2916>0.05)，F(xiàn)值為9.37，表明此模型極顯著，即各因素與其響應值之間有著極為顯著的相關性。R2=0.9234，R2Adj=0.8249，CV為0.2493%，說明預測值與實際值高度相關，可解釋92.34%的水溶性總黃酮含量響應值變化。由此說明，該模型可對大蝎子草水溶性總黃酮含量進行分析和預測。

如表3所示，由P值可知單因素對大蝎子草水溶性總黃酮含量的影響順序依次為：C(提取時間)>B(料液比)>A(浸泡時間)，一次項C(P<0.01)差異極顯著；一次項A和B(P>0.05)不顯著；交互項AB、AC和BC(P>0.05)不顯著；二次項B2和C2(P<0.01)極顯著；A2(P<0.05)顯著；表明提取時間對大蝎子草水溶性總黃酮含量具有顯著的影響。

為考察各因素之間交互作用對大蝎子草水溶性總黃酮含量影響，通過Design-Expert 8.0.6軟件繪制各個因素交互的響應面圖。結果如圖4所示，交互項響應曲面的坡度越陡峭，且等高線呈橢圓形或馬鞍形，說明其交互作用多水溶性總黃酮含量影響較大，根據(jù)各交互圖可以看出，各交互項對大蝎子草含量的影響順序為AC>AB>BC。這與表3中回歸方程的方差分析結果一致。

圖4 各因素交合作用的等高線圖和響應面Fig.4 Contour and response surface diagrams of interaction of various factors

3.4 提取條件優(yōu)化及工藝驗證

根據(jù)響應面回歸模型預測可得大蝎子草水溶性總黃酮的最佳提取工藝參數(shù)為浸泡時間65.10 min，料液比1∶18.69 g/mL，提取時間69.81 min。為操作方便，實際操作將其調整為：浸泡時間為65 min，料液比為1∶19 g/mL，提取時間為70 min。進行3批驗證試驗，測得3批大蝎子草水溶性總黃酮含量分別為6.42 mg/g、6.45 mg/g、6.40 mg/g，RSD=0.3913%，說明該提取工藝穩(wěn)定可靠。

3.5 大蝎子草水溶性總黃酮抗氧化活性分析

3.5.1 大蝎子草水提液對DPPH自由基清除作用

對3.4項下優(yōu)化得到的大蝎子草水提液和VC溶液進行DPPH清除試驗，試驗結果如圖5所示，在12.5 μg/mL～100 μg/mL范圍內，大蝎子草水提液對DPPH自由基的清除能力呈急劇上升趨勢。隨著大蝎子草水提液濃度的不斷增大，其對DPPH自由基的清除率曲線逐漸趨于平緩，當大蝎子草水提液濃度為300 μg/mL時，其清除率為73.375%，低于VC溶液的清除率97.342%。在12.5 μg/mL～300 μg/mL濃度范圍內，大蝎子草水提液對DPPH自由基清除能力明顯低于VC。經SPSS22.0軟件計算大蝎子草水提液和VC溶液對DPPH自由基的IC50值分別為59.616 μg/mL和0.018 μg/mL。

圖5 大蝎子草水提液對DPPH自由基的清除作用Fig.5 Scavenging rate of DPPH radical by water extract of Girardinia diversifolia

3.5.2 大蝎子草水提液對ABTS自由基清除作用

對3.4項下優(yōu)化得到的大蝎子草水提液和VC溶液進行ABTS清除試驗，試驗結果如圖6所示，在5 μg/mL～50 μg/mL范圍內，大蝎子草水提液和VC對ABTS自由基的清除能力均呈急劇上升趨勢。隨著大蝎子草水提液和VC濃度的不斷增大，其對ABTS自由基的清除率曲線逐漸趨于平緩，當濃度為70 μg/mL時，大蝎子草水提液的清除率為99.38%，VC的清除率為99.38063%，經SPSS22.0軟件計算大蝎子草水提液和VC對ABTS自由基的IC50值分別為12.086 μg/mL和13 μg/mL，說明大蝎子草水提液對ABTS自由基清除能力略高于VC。

圖6 大蝎子草水提液對ABTS自由基的清除作用Fig.6 Scavenging rate of ABTS radical by water extract of Girardinia diversifolia

4 討論

本實驗以水為提取溶劑，分別考察了冷浸、超聲和回流3種提取方式，結果顯示回流提取所得到的水溶性總黃酮含量較高。在單因素考察中，浸泡60 min時，藥材達到最大吸水率，初始階段可能因為濃度差原因，提取溶液迅速將樣品包裹，此時，提取液中水溶性總黃酮含量提高[11]，隨著浸泡時間的增加，樣品在提取液中逐漸沉降，導致水溶性總黃酮含量降低[12-13]；隨著料液比增大，水溶性總黃酮得率呈先升后降趨勢，主要原因可能為隨著提取溶劑的量的提高，增大了大蝎子草藥材與提取溶劑的接觸面積 ，促進了水溶性總黃酮的溶出，當提取溶劑的量達到一定時，繼續(xù)增加料液比，提取率反而下降，可能為水溶性總黃酮類物質已基本溶出，此時若繼續(xù)增大溶劑，不僅會造成雜質的溶解，還可能由于溶劑比例過大會增加提取過程中水溶性總黃酮的損耗[6]；在提取時間考察中，隨著提取時間的增加，總黃酮提取率呈現(xiàn)先增后減的趨勢，可能原因為隨著提取時間延長，溶劑對溶質的溶脹和滲透作用有助于黃酮類物質向溶劑擴散，從而水溶性總黃酮得率上升，但提取時間過長，大蝎子草中其他物質大量溶出，與黃酮類物質共同競爭溶出，從而導致水溶性總黃酮得率下降[14-15]，

Box-Behnken 響應面法與常用的均勻設計、正交設計、星點設計等方法相比較，其采用多元線性和二次項模型擬合能提高實驗精確度并預測最佳點，經過對大蝎子草相關文獻的研究，尚未發(fā)現(xiàn)對大蝎子草水溶性總黃酮含量進行響應面試驗，故本實驗采用響應面法優(yōu)化大蝎子草水溶性總黃酮的提取工藝，并進行DPPH和ABTS自由基清除試驗，既填補了文獻的空白，又為后續(xù)研究提供了基礎。