南板藍(lán)根中多糖的含量測(cè)定及提取工藝的優(yōu)選*

周芳麗，李 軍，張麗艷，趙澤林

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

0 引言

南板藍(lán)根為爵床科馬藍(lán)(Baphicacanthuscusia(Nees)Bremek)的干燥根及根莖，性寒味苦，歸心、胃經(jīng)，具有清熱解毒、涼血消斑的功效，臨床用于溫疫時(shí)毒，發(fā)熱咽痛，溫毒發(fā)斑、丹毒[1]。廣泛分布于我國(guó)的華西、西南，尤其是廣西、福建，南方地區(qū)多以此入藥[2]。南板藍(lán)根為多年生草本，產(chǎn)量低，野生資源分散較少[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，南板藍(lán)根具有廣泛的藥理作用，主要包括抗病毒、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、保護(hù)肝臟等作用[4-9]。含有生物堿、氨基酸、多糖、苷類等多種有效成分[10-13]。其中多糖是研究較多的一類成分之一，具有多種生物學(xué)活性，可作為指標(biāo)性成分對(duì)南板藍(lán)根樣品進(jìn)行鑒別，其含量也可作為南板藍(lán)根的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。研究表明多糖具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)腸道菌群等多種藥理活性[14-16]，具有很好的開發(fā)前景。本實(shí)驗(yàn)主要圍繞多糖提取工藝以及含量測(cè)定兩方面進(jìn)行研究，以期為南板藍(lán)根多糖的工藝開發(fā)提供參考。

1 材料與試藥

1.1 儀器

UV2501PC紫外分光光度儀(日本島津公司)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市三和儀器有限公司)；ST-16R高速冷凍離心機(jī)(賽默飛公司)；EPED-E2-20TF型超純水器(南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司)；XS205型十萬分之一電子天平(瑞士梅特公司)。

1.2 試藥

無水乙醇(分析純，批號(hào)：20211101)；苯酚(分析純，批號(hào)：20190801)；濃硫酸(分析純，批號(hào)：20210701)；純水；葡萄糖對(duì)照品(批號(hào)：20200110，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。本實(shí)驗(yàn)采用的南板藍(lán)根樣品經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)魏升華教授鑒定為爵床科馬藍(lán)(Baphicacanthuscusia(Nees)Bremek)的干燥根及根莖，采集后放于干燥陰涼處備用，見表1。

表1 15批南板藍(lán)根樣品來源Tab.1 Sources of 15 batches of Baphicacanthus cusia samples

續(xù)表1

2 多糖含量測(cè)定

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱定干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品20.39 mg，置于100 mL的容量瓶中，然后配制成每1 mL含0.2039 mg對(duì)照品溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱定南板藍(lán)根樣品粉末(三號(hào)篩)1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入30 mL水，加熱回流50 min，抽濾定容至50 mL的容量瓶，混勻。精密量取2 mL的抽濾液，加無水乙醇至濃度為80%，搖勻，冷藏20 h后，置于離心機(jī)中，4000 r/min離心20 min，棄去上清液，沉淀用80%的乙醇洗滌2次，最后沉淀用熱水溶解并定容至10 mL，即得供試品溶液。

2.3 顯色測(cè)定方法

精密吸取2 mL的供試品溶液于試管中，分別加入2 mL 5%的苯酚，搖勻，加入5 mL 濃硫酸，搖勻，靜置10 min，于水浴中保溫15 min，冷卻至室溫。另取2 mL蒸餾水以同樣的方法配制空白對(duì)照組。

2.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的考察

分別量取對(duì)照品溶液和供試品溶液，按照2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色，于紫外分光光度計(jì)下200～800 nm波長(zhǎng)進(jìn)行掃描。結(jié)果顯示：南板藍(lán)根供試品與葡萄糖對(duì)照品在490 nm處均有最大吸收。因此以490 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察

精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、10.0 mL、20.0 mL，分別置20 mL的容量瓶中，加水定容。按照2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)(X)，吸光度為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=3.02874X+0.05769(r2=0.9991)。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在10.20～203.9 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.5.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液2 mL，按2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色，連續(xù)測(cè)6次吸光度，RSD為0.26%，表明儀器的精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱定南板藍(lán)根6份，按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色，測(cè)定吸光度，RSD為2.52%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批南板藍(lán)根供試品溶液，按照2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色，分別在0 h，1 h，2 h，3 h，4 h，5 h進(jìn)樣吸光度測(cè)定，其RSD為0.80%，表明該供試品溶液在5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的同一批次南板藍(lán)根6份，精密稱定，分別精密加入與樣品中含量相當(dāng)?shù)膶?duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，根據(jù)2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色，測(cè)定吸光度，見表2。平均回收率為101.25%，RSD為2.43%，表明樣品加樣回收率較好。

表2 多糖加樣回收測(cè)定Tab.2 Determination results of polysaccharides and spiked recovery

2.6 樣品測(cè)定

分別精密稱定15批南板藍(lán)根樣品粉末(3號(hào)篩)各1.0 g，按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，根據(jù)2.3項(xiàng)下方法顯色，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，見表3。

表3 15批南板藍(lán)根樣品中多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/g)Tab.3 Mass fraction of polysaccharides in 15 batches of Baphicacanthus cusia samples

3 提取工藝考察

3.1 提取方法

精密稱定南板藍(lán)根樣品2份，每份1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入30倍水，分別加熱回流和超聲提取30 min，抽濾定容至50 mL的容量瓶，混勻。精密量取2 mL，加無水乙醇至濃度為80%，按照供試品制備方法及顯色方法進(jìn)行處理，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，結(jié)果回流提取法中多糖的含量為43.82 mg/g，超聲提取中為34.18 mg/g。故以加熱回流法作為提取方法。

3.2 料液比

精密稱定南板藍(lán)根樣品4份，每份1.0 g，置具塞錐形瓶中，分別精密加入20、30、40、50倍水，加熱回流30 min，抽濾定容至50 mL的容量瓶，混勻。精密量取2 mL，加無水乙醇至濃度為80%，按照供試品制備方法及顯色方法進(jìn)行處理，得到多糖的測(cè)定結(jié)果分別為27.01 mg/g、33.04 mg/g、30.90 mg/g、27.17 mg/g。故選擇30倍水。

3.3 提取時(shí)間

精密稱定南板藍(lán)根樣品5份，每份1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入30倍水，分別加熱回流提取20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，抽濾定容至50 mL的容量瓶，混勻。精密量取2 mL，加無水乙醇至濃度為80%，按照供試品制備方法及顯色方法進(jìn)行處理，得到多糖的測(cè)定結(jié)果分別為36.72 mg/g、37.86 mg/g、38.57 mg/g、45.13 mg/g、38.77 mg/g。故以50 min作為提取時(shí)間。

3.4 醇濃度的優(yōu)化

精密稱定南板藍(lán)根樣品1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入30倍水，加熱回流50 min，抽濾定容至50 mL的容量瓶，混勻。精密量取4份提取液，每份2 mL，分別加無水乙醇至濃度為75%、80%、85%、90%，按照供試品制備方法及顯色方法進(jìn)行處理，得到多糖的測(cè)定結(jié)果分別為33.67 mg/g、41.90 mg/g、51.80 mg/g、40.78 mg/g。故選擇85%作為乙醇優(yōu)化濃度。

3.5 工藝驗(yàn)證

根據(jù)以上的提取工藝考察，最終確定的提取工藝為南板藍(lán)根樣品加30倍水，加熱回流提取50 min，以85%的乙醇進(jìn)行多糖的沉淀。

精密稱定南板藍(lán)根樣品1.0 g，置具塞錐形瓶中，按確定的工藝條件進(jìn)行提取，結(jié)果多糖的平均含量為45.63 mg/g，RSD為1.67%(n=3)。

4 討論

多糖具有多種生物學(xué)活性，是中藥研究中的重點(diǎn)關(guān)注對(duì)象。本實(shí)驗(yàn)通過水提醇沉法，可除去其中的可溶性糖以及相關(guān)雜質(zhì)的影響，運(yùn)用苯酚-硫酸法結(jié)合UV技術(shù)，測(cè)定15批南板藍(lán)根樣品中多糖的含量，結(jié)果不同產(chǎn)地與不同批次之間的多糖含量差異較大，這可能與樣品的生長(zhǎng)環(huán)境、栽培技術(shù)以及采收時(shí)間有關(guān)。多糖測(cè)定方法應(yīng)用最為廣泛的有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法，這兩種方法雖干擾因素多、重現(xiàn)性較差，但操作簡(jiǎn)單，易于快速測(cè)定[17]。苯酚-硫酸法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的測(cè)定，而蒽酮-硫酸法幾乎可以測(cè)定所有的碳水化合物，其測(cè)得值實(shí)際上是全部可溶性碳水化合物的總量，因此也可以說明苯酚-硫酸法的測(cè)定結(jié)果更為合理準(zhǔn)確，是多糖較為理想的含量測(cè)定方法[18]。

通過對(duì)提取方法、料液比、提取時(shí)間以及純優(yōu)化的考察，最終確定的提取工藝條件為30倍水加熱回流提取50 min，以85%的乙醇沉淀多糖最佳。該方法操作簡(jiǎn)單，提取效率較高，以期為南板藍(lán)根中多糖的提取工藝提供參考，致力于南板藍(lán)根的進(jìn)一步研究。