煙草葉斑病病原菌Epicoccum latusicollum的鑒定、生物學(xué)特性及室內(nèi)藥劑篩選

安宣鮮，桑維鈞*，盧燕回，孔 菲，王五權(quán)*，李昊熙，楊江敏，彭麗娟，楊茂發(fā)

煙草葉斑病病原菌的鑒定、生物學(xué)特性及室內(nèi)藥劑篩選

安宣鮮1，桑維鈞1*，盧燕回2，孔 菲2，王五權(quán)2*，李昊熙1，楊江敏1，彭麗娟1，楊茂發(fā)1

1. 貴州大學(xué)煙草學(xué)院/貴州省煙草品質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025；2. 中國(guó)煙草總公司廣西壯族自治區(qū)公司科技處，廣西南寧 530022

葉斑類(lèi)病害是危害大田期煙草的主要病害之一，大多由真菌侵染所致，病害易暴發(fā)流行，對(duì)煙草的品質(zhì)及產(chǎn)量造成重大影響。本研究采用組織分離法從廣西‘K326’煙葉具有典型病斑的葉片上分離、純化獲得菌株，通過(guò)致病性測(cè)定結(jié)合形態(tài)學(xué)特征以及分子生物學(xué)手段對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，同時(shí)采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定不同培養(yǎng)基、溫度、pH、碳源、氮源、光照，致死溫度處理以及10種常用化學(xué)藥劑對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響。該葉斑病的典型病癥為：初期煙葉產(chǎn)生灰白色小圓斑，病害加重圓斑逐漸擴(kuò)散成不規(guī)則狀，病斑中心形成穿孔，顏色為灰白色，邊緣棕褐色，伴隨褪綠的黃色暈圈。通過(guò)分離純化獲得2個(gè)菌株，分別命名為HZFC36和HZZS76。致病性測(cè)定結(jié)果表明，2個(gè)菌株均可在葉片無(wú)傷條件下導(dǎo)致健康‘K326’煙葉部產(chǎn)生病斑。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和多基因位點(diǎn)（、、和）系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析將引起廣西煙草葉斑病的病原菌鑒定為。該病原菌在CMA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，最適生長(zhǎng)溫度為28℃，最適pH為6，最佳碳源、氮源為蔗糖和牛肉浸粉，全光照條件更利于病原菌的生長(zhǎng)，致死溫度為47℃，水浴10 min。室內(nèi)藥劑初步篩選結(jié)果顯示，50%啶酰菌胺和25%吡唑醚菌酯對(duì)病原菌的抑制效果最好，平均EC50值分別為4.752×10–2、4.989×10–2mg/L。本研究結(jié)果為引起煙草葉斑病的田間防控奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

葉斑??；病原菌鑒定；生物學(xué)特性；殺菌劑篩選

煙草作為我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，是政府稅收和農(nóng)民收入的主要來(lái)源之一，目前國(guó)內(nèi)種植面積已經(jīng)超過(guò)200萬(wàn)hm2，種植區(qū)域主要分布在云南、廣西、四川、貴州等南方?。▍^(qū)）[1-3]。在煙草生產(chǎn)過(guò)程中常見(jiàn)的病害可以大致分為根莖病害、葉斑類(lèi)病害和病毒病[4-5]。其中，煙草葉斑病作為直接危害煙葉的病害，對(duì)產(chǎn)量和烤后質(zhì)量造成重大影響，是煙草產(chǎn)業(yè)發(fā)展所面臨的重要問(wèn)題[6]。近年來(lái)，隨著種煙年限的增長(zhǎng)和種植面積的不斷擴(kuò)大，煙草栽培模式落后、植煙土壤肥力下降和品種退化等現(xiàn)象層出不窮，煙草葉斑病的種類(lèi)也隨之發(fā)生較大演變[7]。國(guó)內(nèi)外常見(jiàn)的煙草真菌性葉斑病害有普通鏈格孢菌（）、長(zhǎng)柄鏈格孢菌（）引起的煙草赤星病[8]；山扁豆生棒孢（）引起的煙草棒孢霉葉斑病[9]；煙草尾孢菌（）引起的煙草蛙眼病[10]；立枯絲核菌（）引起的煙草靶斑病[11]和炭疽病菌（）引起的煙草炭疽病[12]等，其中以煙草赤星病危害最為嚴(yán)重。

隸屬于子囊菌門(mén)（Ascomycota）、腔菌綱（Loculoascomycetes）、格孢腔菌目（Pleosporales）、亞隔孢殼科（Didymellaceae）、附球菌屬（）[13]。已有報(bào)道指出作為病原菌在多地引起多種植物病害，如2018年在廣東省引起火龍果莖斑病[14]；2019年在四川省引起山藥黑斑病[15]；2020年在貴州省引起煙草葉斑病[16]以及在云南省引起煙草爛根病[17]等。截至目前，在廣西壯族自治區(qū)的研究比較匱乏。

前人對(duì)于的研究主要集中在鑒定方面，鮮有病原菌生物學(xué)特性及相關(guān)防治方面的研究報(bào)道。因此，本研究采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定廣西煙草葉斑病菌的生物學(xué)特性，同時(shí)測(cè)定10種常用化學(xué)殺菌劑對(duì)其生長(zhǎng)的抑制作用，明確的生長(zhǎng)習(xí)性并篩選出高效低毒的化學(xué)殺菌劑，旨在為由引起的煙草葉斑病的有效防治提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 2021年7月，課題組在廣西壯族自治區(qū)賀州市植煙區(qū)開(kāi)展煙草病害調(diào)查，于富川瑤族自治縣（111°16′27″E, 24°49′13″N）和鐘山縣（111°16′23″3, 24°29′23″N）采集具典型癥狀特征的煙草葉斑病葉片，帶回實(shí)驗(yàn)室拍照，鏡檢，通過(guò)分離培養(yǎng)獲得純化菌株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 供試藥劑 供試藥劑名稱(chēng)及經(jīng)初篩后確定的復(fù)篩濃度等信息見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與純化 通過(guò)組織分離法用無(wú)菌剪刀在鏡檢病斑的病健交界處剪取5 mm× 5 mm大小的葉片組織，分別經(jīng)75%酒精浸泡30 s，1%次氯酸鈉消毒3 min，無(wú)菌水漂洗3次，置于無(wú)菌濾紙干燥處理后接種在PDA培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)：RXZ-380A，寧波江南儀器廠）中暗培養(yǎng)[18-19]。待接種點(diǎn)周?chē)L(zhǎng)出白色菌絲，用無(wú)菌接種針挑取邊緣菌絲接種至PDA培養(yǎng)皿上進(jìn)行純化培養(yǎng)，純化菌株以40%甘油凍存菌餅至–20℃冰箱中備用。

表1 供試藥劑及處理濃度

1.2.2 病原菌的致病性測(cè)定 采用菌餅接種法對(duì)菌株的致病性進(jìn)行測(cè)定[20]。菌株在PDA培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3 d后，用直徑5 mm的滅菌打孔器打取菌餅。選取健康的‘K326’盆栽煙株，將菌餅接種于無(wú)傷煙株中部位置葉片的兩側(cè)，并在接種部位附近放置濕潤(rùn)的無(wú)菌棉球保濕，以接種純PDA培養(yǎng)基餅為對(duì)照，每株接種3片葉。用自封袋對(duì)接種葉片進(jìn)行套袋，煙株置于28℃，相對(duì)濕度75%，12 h光照、12 h黑暗周期的人工氣候箱中培養(yǎng)，定期觀察記錄發(fā)病情況；對(duì)發(fā)病葉片進(jìn)行病原菌的分離鑒定，并與原接種菌株進(jìn)行比較，若菌株相同，則確定接種菌株為致病菌。

1.2.3 病原菌的形態(tài)學(xué)觀察 將菌株分別接種在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、燕麥瓊脂培養(yǎng)基（OA）和玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（CMA）上，28℃恒溫暗培養(yǎng)7 d，對(duì)菌株的培養(yǎng)性狀進(jìn)行直觀描述，并挑取菌絲體制作玻片在卡爾蔡司光學(xué)顯微鏡下分別觀察產(chǎn)孢器、分生孢子大小[21]。

1.2.4 病原菌的分子鑒定 將病原菌接種于覆有半透膜的PDA培養(yǎng)皿中央暗培養(yǎng)3 d，用無(wú)菌手術(shù)刀輕輕刮取邊緣菌絲采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒[產(chǎn)品編號(hào)：B518259，生工生物工程（上海）股份有限公司]提取菌株的DNA。采用引物（表2）對(duì)菌株對(duì)應(yīng)位點(diǎn)序列進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序參考對(duì)應(yīng)文獻(xiàn)，PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后由生工生物工程（上海）股份有限公司代為測(cè)序。所得序列通過(guò)BLAST比對(duì)分析，從GenBank中收集用于比較的其他序列相關(guān)信息，通過(guò)MAFFT v. 7（https://mafft.cbrc. jp/alignment/software/）進(jìn)行序列比對(duì)，使用TrimAl v. 1.3進(jìn)行序列剪切，以MEGA 7軟件將剪切后的序列進(jìn)行拼接，應(yīng)用IQ-TREE v.1.6.12的最大似然法（maximum likelihood, ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，bootstrap檢驗(yàn)重復(fù)次數(shù)為1000次。

表2 病原菌鑒定所用的引物

1.2.5 病原菌的生物學(xué)特性測(cè)定 （1）不同溫度處理。將直徑為5 mm的菌餅菌絲面朝下接于PDA培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)溫度梯度設(shè)置為5、10、15、20、25、28、30、35℃，置于恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)7 d，每個(gè)處理重復(fù)3次，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑[28]，下同。

（2）不同培養(yǎng)基處理。供試培養(yǎng)基分別為市售PDA培養(yǎng)基（青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司），CMA培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司），察氏培養(yǎng)基（CDA，北京索萊寶科技有限公司），OA培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司）和自配番茄汁瓊脂培養(yǎng)基（TomA），山藥汁瓊脂培養(yǎng)基（YA），煙葉汁瓊脂培養(yǎng)基（TobA）和水瓊脂培養(yǎng)基（WA），各培養(yǎng)基配方源自《植病研究方法》[29]。將直徑為5 mm的菌餅分別接種于上述8種培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)7 d，每個(gè)處理重復(fù)3次[30]。

（3）不同碳氮源處理。以查氏培養(yǎng)基（Czapek）[29]為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基中的碳源蔗糖分別用相同量的葡萄糖、乳糖、甘露醇、肌醇、山梨糖醇和可溶性淀粉替代；同理，分別以等量的蛋白胨、硝酸銨、牛肉浸粉、氯化銨，尿素、甘氨酸、丙氨酸代替培養(yǎng)基中的氮源硝酸鈉，將直徑為5 mm菌餅分別接于含不同碳氮源的培養(yǎng)皿上，置于恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)7 d，每個(gè)處理重復(fù)3次[31]。

（4）不同pH處理。以PDA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在滅菌前用1%HCl和1%NaOH溶液把培養(yǎng)基的pH調(diào)為8個(gè)不同梯度（4、5、6、7、8、9、10、11），將直徑為5 mm菌餅接于培養(yǎng)皿中央，置于恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)7 d，每個(gè)處理重復(fù)3次[32]。

（5）不同光照處理。將恒溫培養(yǎng)箱的光照條件設(shè)置為完全光照、完全黑暗和12 h明暗交替3種模式，將中央接有直徑為5 mm菌餅的PDA培養(yǎng)皿分別放于3種光照模式的培養(yǎng)箱中，28℃恒溫培養(yǎng)7 d，每處理3次重復(fù)。

1.2.6 病原菌的致死溫度測(cè)定 將直徑為5 mm菌餅分別置于裝有1 mL無(wú)菌水的1.5 mL滅菌離心管中，調(diào)節(jié)水浴鍋的溫度為40、45、50、55、60、65℃。將載有離心管的浮板放入不同溫度的水浴鍋中持續(xù)處理10 min（預(yù)熱1 min），計(jì)時(shí)結(jié)束時(shí)取出離心管置于常溫純凈水中冷卻。將處理后的菌餅接于PDA培養(yǎng)皿上，28℃恒溫培養(yǎng)7 d，每處理3次重復(fù)，首先得到病原菌的致死溫度范圍，再以1℃為溫度梯度，重復(fù)之前的步驟進(jìn)一步確定病原菌的致死溫度[33]。

1.2.7 室內(nèi)藥劑篩選 采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定供試藥劑對(duì)分離菌株的抑制效果[34]。經(jīng)初篩得出各藥劑的實(shí)驗(yàn)終濃度（表1）。將不同濃度的藥劑溶液加入PDA培養(yǎng)基中充分混勻，制作含藥平板，以只添加相同體積無(wú)菌水的PDA平板作對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。用直徑為5 mm的滅菌打孔器在培養(yǎng)5 d的菌落邊緣打取菌餅接種于不同含藥平板上，置于28℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)7 d，然后用十字交叉法測(cè)量各處理的菌落直徑。計(jì)算各藥劑對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)的相對(duì)抑制率，以各藥劑濃度的自然對(duì)數(shù)值作為自變量，以菌絲抑制百分率的Probit值作為因變量，計(jì)算藥效回歸方程和相關(guān)系數(shù)以及抑制有效中濃度EC50。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010軟件計(jì)算試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差以及構(gòu)建柱形圖，采用SPSS Statistics 26軟件的Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行單因素ANOVA檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間癥狀描述

2021年7月，在廣西壯族自治區(qū)富川瑤族自治縣和鐘山縣煙草種植區(qū)發(fā)現(xiàn)的葉部病害，發(fā)生于煙株的成熟期，煙草品種為‘K326’。發(fā)病初期，煙葉產(chǎn)生灰白色小圓斑，病害加重，圓斑逐漸擴(kuò)散成不規(guī)則狀，病斑中心形成穿孔，顏色為灰白色，邊緣棕褐色，常伴隨褪綠的黃色暈圈（圖1A）。

2.2 病原菌的分離、純化和致病性測(cè)定

經(jīng)分離獲得純培養(yǎng)菌株2個(gè)，分別編號(hào)為HZFC36和HZZS76。致病性測(cè)定結(jié)果顯示2個(gè)菌株均可引起健康煙株葉斑病，葉片無(wú)傷接種菌餅早期接種部位產(chǎn)生淡黃色病斑，7 d后變?yōu)榛液稚?，并產(chǎn)生黃色暈圈（圖1C），與田間癥狀（圖1A）相似，甚至?xí)霈F(xiàn)穿孔現(xiàn)象（圖1B），對(duì)照未表現(xiàn)出病癥（圖1D）。參照1.2.1的步驟對(duì)回接發(fā)病葉片進(jìn)行病原菌的分離鑒定，得到的菌株與回接菌株一致。

A：田間典型危害癥狀；B：菌株HZFC36接種煙草品種‘K326’7 d后的癥狀表現(xiàn)；C：菌株HZZS76接種煙草品種‘K326’7 d后的癥狀表現(xiàn)；D：對(duì)照。

2.3 病原菌的形態(tài)特征觀察

病原菌HZFC36和HZZS76的形態(tài)特征基本相同。菌株HZZS76在PDA培養(yǎng)基上（圖2A）培養(yǎng)7 d后，菌落表面呈同心圓分布，中央淺褐色，向外淺紅色，邊緣白色較整齊。菌絲白色，致密，氣生菌絲較發(fā)達(dá)；背面中央位置為淡紅色，向外顏色加深至深紅色，最外圍為淺膚色，有紅色的色素產(chǎn)生。在OA培養(yǎng)基上（圖2B），培養(yǎng)7 d后菌落表面中央為灰褐色，向外為淺紅色，最外為白色，白色氣生菌絲茂盛；背面中央呈黑色，外圍為淺紅色。在CMA培養(yǎng)基上（圖2C），培養(yǎng)7 d后菌落表面呈淡紅色，菌絲較稀疏，白色菌絲聚集成結(jié)。分生孢子黑色，單腔呈橢圓形，具孔口，埋生或表生于培養(yǎng)基表面，平均大小為123.737～305.366 μm×132.500～418.649 μm（=10，圖2D）；分生孢子無(wú)色，呈長(zhǎng)橢圓形，無(wú)隔，有1～2個(gè)油球，平均大小為7.01～7.21 μm×2.43～2.75 μm（=20，圖2E）；菌絲中間或末端著生膨大細(xì)胞，無(wú)色，呈梨狀（圖2F）。

A：HZZS76菌株在PDA上培養(yǎng)7 d后的菌落形態(tài)（正、反面）；B：HZZS76菌株在OA上培養(yǎng)7 d后的菌落形態(tài)（正、反面）；C：HZZS76菌株在CMA上培養(yǎng)7 d后的菌落形態(tài)（正、反面）；D：分生孢子器；E：分生孢子；F：膨大細(xì)胞。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

將測(cè)序所獲得的菌株HZFC36和HZZS76的、、和基因序列上傳至GenBank，獲取登錄號(hào)分別為OK560049、OK559907、OK573447、OK573448、OK639091、OK639097、OL422486、OL422485。將8個(gè)序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)BLAST比對(duì)，比對(duì)結(jié)果顯示，2個(gè)菌株與和均具有99%以上的同源性，暫不能鑒定至種。從Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載與相關(guān)的23個(gè)菌株的、、、序列，通過(guò)最大似然法構(gòu)建得到系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖3），結(jié)果表明，菌株HZFC36、HZZS76與LC:5158、LC:8153、LC:4859、T41以100%的支持率聚在一支，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征與分子生物學(xué)分析，將菌株HZFC36和HZZS76鑒定為。

2.5 生物學(xué)特性測(cè)定

2.5.1 溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 菌株HZFC36和HZZS76在不同溫度條件下的生長(zhǎng)差異不顯著，且在不同溫度下菌絲的生長(zhǎng)速度隨處理溫度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)（圖4A）。5℃時(shí)，菌株菌絲不生長(zhǎng)，5～28℃范圍內(nèi)菌絲生長(zhǎng)速度加快，28℃時(shí)菌落平均直徑為78.58 mm，顯著高于其他溫度處理。28～35℃范圍內(nèi)，高溫對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用尤為明顯，菌絲生長(zhǎng)速度緩慢。

圖3 基于LSU-ITS-RPB2-TUB2構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

2.5.2 培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 菌株HZFC36和HZZS76在8種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況基本一致（圖4B）。在CMA培養(yǎng)基上菌株菌絲生長(zhǎng)速度最快，培養(yǎng)7 d后菌落平均直徑達(dá)79.08 mm；其次是PDA培養(yǎng)基，這2種培養(yǎng)基無(wú)顯著差異（<0.05）；菌株在WA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢，顯著低于其余7種培養(yǎng)基，說(shuō)明最適菌株菌絲生長(zhǎng)的培養(yǎng)基為CMA培養(yǎng)基。

2.5.3 碳源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 菌株HZFC36和HZZS76在7種供試碳源的培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，培養(yǎng)7 d后的菌落平均直徑均顯著大于對(duì)照，且菌株間生長(zhǎng)差異不顯著（圖4C）。當(dāng)以蔗糖為碳源時(shí)，菌株菌絲生長(zhǎng)最快，菌落平均直徑達(dá)到75.08 mm。

2.5.4 氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 菌株HZFC36和HZZS76在不同氮源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度存在差異，但均顯著高于對(duì)照（圖4D）。2個(gè)菌株菌絲生長(zhǎng)的最適氮源為牛肉浸粉，菌落直徑顯著高于其他氮源處理，其次是蛋白胨。并且，菌株HZFC36與HZZS76在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)差異較大。

2.5.5 pH對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 菌株HZFC36和HZZS76在pH 4～11的范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，且同一pH下菌株間生長(zhǎng)差異不大，但不同pH間菌株的生長(zhǎng)差異較為顯著（圖4E）。在pH 4～6范圍內(nèi)，菌絲生長(zhǎng)速度隨pH的升高而顯著增加；在pH 6～11的范圍內(nèi)，菌絲生長(zhǎng)速度又顯著降低。pH為6時(shí)，培養(yǎng)7 d后菌株的菌落平均直徑最大，為75.67 mm。由此可知，病原菌適宜在弱酸性條件下生長(zhǎng)。

2.5.6 光照對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 菌株HZFC36和HZZS76在全光照、黑暗光照交替和全黑暗條件下菌絲均可以生長(zhǎng)（圖4F），且彼此間差異不顯著。菌株菌絲在全光照條件下生長(zhǎng)最快，培養(yǎng)7 d后的菌落平均直徑為71.75 mm，說(shuō)明光照充足的環(huán)境更利于病原菌生長(zhǎng)。

2.5.7 病原菌菌絲的致死溫度測(cè)定 將經(jīng)供試溫度水浴10 min處理后的菌餅接在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)，菌株HZFC36和HZZS76在45℃處理后菌絲均能生長(zhǎng)，在50℃處理下則未生長(zhǎng)。再以45℃為起始溫度，1℃為梯度進(jìn)行逐漸升溫水浴處理，結(jié)果顯示，經(jīng)溫度≥47℃水浴10 min處理后，菌絲在培養(yǎng)基上不再生長(zhǎng)，因此推斷病原菌菌絲的致死溫度為47℃水浴10 min。

不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.6 室內(nèi)藥劑篩選

10種化學(xué)藥劑對(duì)煙草葉斑病病原菌的抑制效果有差異（表3）。50%啶酰菌胺、25%吡唑醚菌酯、50%咯菌腈、450 g/L咪鮮胺、10%苯醚甲環(huán)唑和500 g/L異菌脲6種藥劑的抑制作用較為明顯，EC50分別為4.752×10–2、4.989×10–2、1.406×10–1、2.063×10–1、3.090×10–1、8.703×10–1mg/L，這6種藥劑均具有防治引起的煙草葉斑病的潛力，其中50%啶酰菌胺和25%吡唑醚菌酯的EC50最低，抑制效果最好。430 g/L戊唑醇、40%腈菌唑和80%代森錳鋅對(duì)病原菌的抑制效果相對(duì)較差，EC50分別為1.745×100、2.227×100、1.477×101mg/L，但是對(duì)引起的煙草葉斑病的防治也具有一定的指導(dǎo)意義。

3 討論

在廣西壯族自治區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)的不同于常見(jiàn)煙草葉斑類(lèi)病害的癥狀表現(xiàn)為：患病初期，葉片上出現(xiàn)灰白色的小圓斑，隨著病情發(fā)展，圓斑逐漸擴(kuò)散成不規(guī)則狀，病斑中心形成穿孔，顏色為灰白色，邊緣棕褐色，有褪綠的黃色暈圈。本研究通過(guò)科赫氏驗(yàn)證、形態(tài)特征和多基因序列（、、和）分析鑒定，將病原菌確定為，該病害特征與GUO等[16]報(bào)道的貴州省由導(dǎo)致的煙草葉斑病癥狀相似。

表3 不同殺菌劑對(duì)病原菌株的抑制效果

附球菌屬（）是由AVESKAMP等[35]通過(guò)利用4個(gè)基因（、、、）對(duì)亞隔孢殼科（Didymellaceae）進(jìn)行多位點(diǎn)系統(tǒng)發(fā)育研究建立的新屬，該屬典型的特征為能夠產(chǎn)生深色的葡萄串狀的厚垣孢子。CHEN等[36-37]利用多序列（ITS、、、）對(duì)附球菌屬進(jìn)行了修訂和補(bǔ)充，添加了5種不產(chǎn)生厚坦孢子的原莖點(diǎn)霉屬（）真菌和9個(gè)新種，其中包含。本研究中致病菌株HZFC36和HZZS76在PDA和OA培養(yǎng)基上均產(chǎn)生紅色色素，但未見(jiàn)厚垣孢子，與CHEN等[36]報(bào)道的高粱葉斑病致病菌株LC 5158的形態(tài)學(xué)特征有一定差異，主要表現(xiàn)為菌株LC 5158在PDA和OA培養(yǎng)基上無(wú)色素產(chǎn)生；而菌株HZFC36、HZZS76與貴州省煙草葉斑病病原菌T41、火龍果莖斑病病原菌HJ2、黑龍江省玉米莖腐病病原菌JF3[37]、云南省煙草爛根病病原菌HH12在形態(tài)特征上基本一致。本研究對(duì)的生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果表明，病原菌菌絲生長(zhǎng)最適溫度為28℃，最適pH為6，與肖顯梅等[14]報(bào)道的病原菌HJ12的最適生長(zhǎng)溫度為26℃和最適pH為6～7稍有差異，其原因可能與采集病原菌所處地理位置和不同寄主有關(guān)。

具有寄主多樣性，可侵染煙草[16-17]、番茄[15]、辣椒[15]、花菜[15]、山藥[15]、火龍果[14]、玉米[38]和胡頹子[39]等多種植物。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上及時(shí)采取有效措施對(duì)病害進(jìn)行控制是防止病害暴發(fā)流行和減少經(jīng)濟(jì)損失的關(guān)鍵。目前，針對(duì)引起的植物病害的防治研究基本處于空白，本研究采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了10種化學(xué)藥劑對(duì)的抑制效果，結(jié)果表明50%啶酰菌胺、25%吡唑醚菌酯、50%咯菌腈、450 g/L咪鮮胺、10%苯醚甲環(huán)唑和500 g/L異菌脲6種殺菌劑對(duì)均有較好的抑制效果，EC50值均小于1 mg/L，其中以50%啶酰菌胺和25%吡唑醚菌酯為最佳，EC50值分別為4.752×10–2mg/L和4.989×10–2mg/L，相關(guān)結(jié)果為后續(xù)田間試驗(yàn)與示范奠定了基礎(chǔ)。本研究為引起廣西壯族自治區(qū)煙草葉斑病的田間識(shí)別和藥劑防控提供了理論參考。

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Identification, Biological Characteristics and Fungicide Screening of Tobacco Leaf Spot Disease Pathogen

AN Xuanxian1, SANG Weijun1*, LU Yanhui2, KONG Fei2, WANG Wuquan2*, LI Haoxi1, YANG Jiangmin1, PENG Lijuan1, YANG Maofa1

1. College of Tobacco Science, Guizhou University /Guizhou Provincial Key Laboratory for Tobacco Quality Research, Guiyang, Guizhou 550025, China; 2. Department of Science and Technology, Guangxi Zhuang Autonomous Region Company, China National Tobacco Corporation, Nanning, Guangxi 530022, China

Leaf spot disease is one of the main tobacco diseases in the field period, which is mainly caused by fungal infection. It is easy to happen and spread, and has a great impact on the quality and yield of tobacco. In this study, the strain was isolated and purified from the leaves with typical leaf spot diseases of tobacco variety ‘K326’ in Guangxi Zhuang Autonomous Region by tissue separation, and through pathogenicity determination combined with morphological characteristics and molecular biological methods to identify pathogens. The mycelium growth rate method was used to measure the mycelium growth of pathogens in different media, temperature, pH, carbon source, nitrogen source, light, lethal temperature treatment and 10 common chemical conditions. In the early period of tobacco leaf spot disease, the typical symptoms of the leaf spot disease are gray white small round spots. As the disease worsens, the round spot gradually diffuses into irregular shape, and the center of the spot forms a perforation, the color is gray white, the edge is brown, and accompanied by a yellow halo.We isolated and purified two strains and named them as HZFC36 and HZZS76. The pathogenicity test results showed that both strains could cause disease spots on the leaves of healthy ‘K326’ tobacco plant under the condition of no leaf injury.was identified as the pathogen causing tobacco leaf spot disease in Guangxi, based on morphological characteristics of pathogen and phylogenetic analysis of multiple loci (,,and). The mycelia of the pathogen grew the fastest on CMA medium, and the optimal growth temperature was 28℃, the optimal pH was 6, the optimal carbon was sucrose and nitrogen source was beef extract powder. 24 h continuous light is favorable to the growth of the mycelia, and the mycelia did not grow after being continuously treated in water bath at 47℃ for 10 min. Preliminary screening results of chemical fungicides in the laboratory showed that 50% boscalid and 25% pyraclostrobine had the best inhibitory effect on the pathogen with EC50value 4.752×10–2mg/L and 4.989×10–2mg/L respectively. The results of the study would provide a theoretical basis for the field control of tobacco leaf spot caused by.

leaf spot disease; identification of pathogenic bacteria; biological characteristics; fungicide screening

S435.72

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.12.016

2022-05-10；

2022-06-14

中國(guó)煙草總公司廣西壯族自治區(qū)公司項(xiàng)目（No. 202145000024006）。

安宣鮮（1997—），男，碩士研究生，研究方向：煙草病原真菌學(xué)。*通信作者（Corresponding author）：桑維鈞（SANG Weijun），E-mail：984139246@qq.com；王五權(quán)（WANG Wuquan），E-mail：redtea_lu@126.com。