混合真菌發(fā)酵制備支化β-1,3-葡寡糖

楊澤林，楊雪晨，吳劍榮，夏小樂，張洪濤，詹曉北

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

真菌葡聚糖是一大類結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣的D-葡聚糖，由于生物來源不同，在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上有很大差異。根據(jù)葡萄糖苷異頭碳結(jié)構(gòu)不同，可分為α-D-葡聚糖、β-D-葡聚糖和復(fù)合α,β-D-葡聚糖。此外，真菌葡聚糖在糖苷鍵類型、分支度、支鏈結(jié)構(gòu)和分子量上也有很大差別[1]，其中，以β-1,3-D-葡聚糖為主鏈、帶有不同程度β-1,6支鏈的葡聚糖因其較好的生物活性受到廣泛關(guān)注和研究[2]。此類支化β-1,3-D-葡聚糖具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降低“三高”、促進(jìn)傷口愈合、改善腸道菌群等功能，已廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥行業(yè)[3-4]。真菌葡聚糖的生物活性通常與其結(jié)構(gòu)和分子量有關(guān)，而分支度為0.20～0.33的支化β-1,3-葡聚糖被證明具有最高的抗腫瘤活性，分支度更高或者更低則活性都會(huì)下降[5-6]。早期研究認(rèn)為此類真菌葡聚糖的生物活性和它們的三螺旋結(jié)構(gòu)以及大的分子量有關(guān)，然而近年來發(fā)現(xiàn)小分子的β-1,3-葡寡糖具有更顯著的抗腫瘤活性[7-10]。真菌葡聚糖通常分子量較大，如小核菌多糖能達(dá)到1.0×107，這導(dǎo)致其水溶性很差，直接影響了其生物活性和應(yīng)用領(lǐng)域，因?yàn)槟苋苡谒摩?葡聚糖生物活性要遠(yuǎn)好于不能溶于水的葡聚糖生物活性[11]。

通過水解降低真菌葡聚糖分子量是一種有效提高真菌葡聚糖水溶性和生物活性的方法。目前，常用于水解葡聚糖的方法主要有酶水解[12]、酸水解[13]和物理水解[14]。其中，酸水解和物理水解方法存在低聚糖收率低、聚合度(DP)不可控等問題，因此，酶水解是目前制備β-葡寡糖的最佳方法。哈茨木霉能分泌外切β-1,3-葡聚糖酶和內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶，其內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶能夠沿著多糖鏈隨機(jī)切割β-1,3-糖苷鍵產(chǎn)生寡糖，具有良好的應(yīng)用價(jià)值[12]。筆者所在課題組前期將產(chǎn)熱凝膠的土壤桿菌和哈茨木霉混合培養(yǎng)，成功制得了DP 20左右、分子量均一的線性β-1,3-葡寡糖，實(shí)驗(yàn)證明其具有良好的水溶性和抗腫瘤活性[15-16]。

本研究以β-1,3-葡聚糖為主鏈、每3個(gè)葡萄糖連接一個(gè)β-1,6支鏈結(jié)構(gòu)的真菌葡聚糖進(jìn)行水溶性寡糖制備研究，此類真菌葡聚糖來源包括齊整小核菌[17]、裂褶菌[18]和繡球菌[19]等。其中，齊整小核菌所產(chǎn)的小核菌多糖相對產(chǎn)量較高，產(chǎn)量最高可達(dá)32.62 g/L[17]。另外，裂褶菌具有藥用價(jià)值，且比繡球菌更易培養(yǎng)。因此，通過構(gòu)建齊整小核菌-哈茨木霉以及裂褶菌-哈茨木霉混合培養(yǎng)體系，可直接發(fā)酵法制備支化β-1,3-葡寡糖(bOβG)，以期為降解真菌多糖提供一種新的方法，并且拓展真菌深層發(fā)酵的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

齊整小核菌(Sclerotiumrolfsii) WSH-G01，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M2017646；裂褶菌(SchizophyllumcommuneGDMCC 5.43)、哈茨木霉(TrichodermaharzianumGDMCC 3.442)，廣東省微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

齊整小核菌平板培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯(去皮)200.0、葡萄糖20.0、瓊脂20.0；pH自然。種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30.0、NaNO33.0、酵母浸粉1.0、KH2PO41.0、MgSO4·7H2O 0.5、KCl 0.5；pH 4.0。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖55.0、NaNO32.5、酵母浸粉0.5、KH2PO41.0、MgSO4·7H2O 0.5、檸檬酸1.5、KCl 0.5；pH 4.0。

哈茨木霉平板培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯(去皮)200.0、葡萄糖20.0、KH2PO43.0、MgSO4·7H2O 1.5、硫胺素0.008、瓊脂20.0；pH 6.0。種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20.0、酵母浸粉15.0、(NH4)2SO42.5、KH2PO46.0、MgSO4·7H2O 0.8；pH 6.0。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：茯苓多糖20.0、小麥麩皮20.0、KH2PO45.0、MgSO4·7H2O 0.5；pH 6.0。

共培養(yǎng)上罐培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖75.0、NaNO33.0、酵母浸粉1.0、KH2PO41.0、MgSO4·7H2O 0.5、檸檬酸1.5、KCl 0.5；pH 4.5。

1.1.3 儀器與設(shè)備

7 L BioFlo115型發(fā)酵罐，Eppendorf公司；3K-15型高速冷凍離心機(jī)，Sigma-Aldrich公司；SBA-40E型生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；LC 2000型高效液相色譜儀(HPLC)，日本島津公司；基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF MS)，布魯克·道爾頓公司；DIONEX ICS-5000+SP-5型離子色譜儀，賽默飛世爾科技公司。

1.1.4 試劑與材料

食品級熱凝膠，日本Takeda-Kirin Food Co.公司；硅膠薄層層析板gel 60 F254，德國Merck公司；Sep-Pak C18固相萃取柱(1 g)，美國Waters公司；截留分子量500～1 000透析袋，北京索萊寶科技有限公司；其余試劑均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

搖瓶水平。齊整小核菌于平板培養(yǎng)基上活化，25 ℃培養(yǎng)4 d；從活化好的平板上挑取菌絲接種于種子培養(yǎng)基(裝液量50 mL的500 mL三角瓶)中，于30 ℃、220 r/min培養(yǎng)3 d；將種子液均質(zhì)后以7%(體積分?jǐn)?shù))接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(裝液量45 mL的250 mL三角瓶)中，于30 ℃、220 r/min培養(yǎng)48 h。哈茨木霉于平板培養(yǎng)基上活化，30 ℃培養(yǎng)3 d；將活化好的平板用生理鹽水沖洗打散，制成1×107CFU/mL的孢子懸浮液；接1 mL孢子懸浮液于種子培養(yǎng)基(裝液量50 mL的500 mL三角瓶)中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)18 h；以10%接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(裝液量50 mL的500 mL三角瓶)中，于30 ℃、200 r/min培養(yǎng)18 h。將培養(yǎng)18 h的哈茨木霉發(fā)酵液6 010g離心5 min，以齊整小核菌和哈茨木霉發(fā)酵液體積比0.9∶1將離心沉淀加入到培養(yǎng)48 h的齊整小核菌發(fā)酵液中，并且以20 g/L的質(zhì)量濃度補(bǔ)加小麥麩皮，30 ℃、220 r/min繼續(xù)培養(yǎng)直到發(fā)酵結(jié)束。

7 L發(fā)酵罐水平。齊整小核菌和哈茨木霉的平板活化和種子培養(yǎng)方法同搖瓶水平。發(fā)酵罐初始裝液量3.5 L，攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min，溫度恒定30 ℃，通氣量1 vvm，以5%的接種量接入齊整小核菌種子液。在溶氧為90%時(shí)接種培養(yǎng)18 h、孢子濃度為1×108CFU/mL的哈茨木霉種子液，初始接種比為V(齊整小核菌)∶V(哈茨木霉)=1∶1.5，并補(bǔ)加20 g/L的小麥麩皮，同時(shí)通過協(xié)同調(diào)節(jié)通氣量和轉(zhuǎn)速控制溶氧(DO)保持在50%以上，直至發(fā)酵結(jié)束。

參照文獻(xiàn)[20]進(jìn)行齊整小核菌菌體干質(zhì)量及多糖產(chǎn)量的測定。

1.2.3 支化β-1,3-葡寡糖產(chǎn)量測定

將共培養(yǎng)發(fā)酵液于9 391g離心10 min，取上清液。上清液中總糖含量采用苯酚-硫酸法[21]測定，殘?zhí)呛渴褂蒙飩鞲蟹治鰞x測定。支化β-1,3-葡寡糖產(chǎn)量為總糖含量減去殘?zhí)呛俊?/p>

1.2.4 內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶酶活測定

本研究中，內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶的單位酶活(U)定義：每1 min水解熱凝膠生成1 μg寡糖所需的酶量。具體測定方法參照文獻(xiàn)[22]。

1.2.5 支化β-1,3-葡寡糖的提取純化

取一定體積共培養(yǎng)的發(fā)酵上清液，加入10倍體積無水乙醇并于4 ℃醇沉過夜，于6 010g離心10 min獲得沉淀，N2吹干沉淀并復(fù)溶，溶液過0.22 μm水系膜備用。使用Sep-Pak C18固相萃取柱除去溶液中的蛋白，方法如下：首先使用10 mL乙腈對小柱進(jìn)行活化，再用20 mL水進(jìn)行平衡，隨后上樣1 mL，待樣品滴完，最后用10 mL水洗脫，收集洗脫液。上述洗脫液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到一定體積，使用截留分子量500～1 000透析袋透析2 d，除去離子和單糖。最后凍干，得到支化β-1,3-葡寡糖樣品。

1.2.6 熱凝膠寡糖的制備

沈老七新居落成后，又娶了一房太太。這時(shí)的沈家已是大不如從前了。該燒的都已經(jīng)燒了，眼下沈老七只有田產(chǎn)還可以變成現(xiàn)錢，他為娶這房太太又變賣了50畝上好的河沙地。

熱凝膠寡糖是以食品級熱凝膠為原料，通過酸水解制得，具體操作方法參照文獻(xiàn)[23]。

1.2.7 支化β-1,3-葡寡糖的結(jié)構(gòu)分析

共培養(yǎng)發(fā)酵上清液利用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行分析。具體條件：儀器島津LC 2000，柱子Superose 12 10/300 GL，流動(dòng)相0.1 mol NaNO3溶液，流速0.5 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

采用MALDI-TOF MS測定支化β-1,3-葡寡糖的分子量。使用FlexControl和FlexAnalysis 3.4.軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理。

參照文獻(xiàn)[24]進(jìn)行支化β-1,3-葡寡糖單糖組成分析。稱取5 mg寡糖樣品，加入300 μL 2 mol/L的三氟乙酸，100 ℃金屬浴6 h，冷卻后N2吹干，加入300 μL甲醇再吹干，重復(fù)3次，最后溶于水并稀釋至10 mg/L。配制10 mg/L的單糖混標(biāo)溶液，包括巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和果糖。樣品過0.22 μm水系膜，使用離子色譜儀進(jìn)行分析。

DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率的測定方法參照文獻(xiàn)[25]，還原力測定方法參照文獻(xiàn)[26]。

2 結(jié)果與討論

2.1 混合發(fā)酵法制備支化β-1,3-葡寡糖

前期實(shí)驗(yàn)中對齊整小核菌的生長以及產(chǎn)糖情況進(jìn)行了研究，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知：齊整小核菌菌絲體在0～72 h期間迅速生長，處于對數(shù)期，之后進(jìn)入遲緩期。齊整小核菌菌體干質(zhì)量在120 h時(shí)最高，為2.62 g/L。而小核菌多糖在24 h以后開始大量產(chǎn)生，在96 h時(shí)達(dá)到最高，為22.6 g/L。以此為基礎(chǔ)，進(jìn)行齊整小核菌-哈茨木霉混合發(fā)酵的研究。

圖1 齊整小核菌生長曲線Fig.1 Time course of Sclerotium rolfsii

哈茨木霉作為一種生物防治真菌，能夠拮抗齊整小核菌這種植物病原真菌，基于此，這2種真菌的共培養(yǎng)只能在一段時(shí)間內(nèi)存在，只有讓2株菌在一段時(shí)間內(nèi)都能夠得到較好的生長，才能獲得較高的寡糖產(chǎn)量。因此，找到2株菌在混菌時(shí)合適的生物量至關(guān)重要。哈茨木霉相比齊整小核菌生長較快，且能夠達(dá)到更大的生物量，因此，在齊整小核菌發(fā)酵一段時(shí)間后，再接種培養(yǎng)18 h的哈茨木霉，并補(bǔ)料小麥麩皮，繼續(xù)進(jìn)行混合發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)果如圖2所示。因?yàn)楫?dāng)齊整小核菌單菌培養(yǎng)時(shí)，從24 h開始大量產(chǎn)生多糖，此時(shí)也達(dá)到了一定的生物量，因此從24 h開始接種哈茨木霉進(jìn)行混合發(fā)酵，結(jié)果如圖2(a)所示。由圖2(a)可知：支化β-1,3-葡寡糖的產(chǎn)量先上升后下降，在發(fā)酵48 h時(shí)接種哈茨木霉，寡糖產(chǎn)量最高，為3.0 g/L。如果哈茨木霉接種過早，抑制了齊整小核菌的生長，沒有產(chǎn)生足夠的多糖用來被水解生成寡糖，造成寡糖產(chǎn)量不高；而哈茨木霉接種過遲時(shí)，齊整小核菌生物量已經(jīng)較大，且此時(shí)產(chǎn)生了大量多糖，發(fā)酵體系黏度大造成供氧不足，影響了哈茨木霉的生長，使得哈茨木霉不能產(chǎn)生足夠的內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶來水解多糖，導(dǎo)致寡糖產(chǎn)量很低。因此，選擇發(fā)酵48 h為哈茨木霉最佳混菌接種時(shí)間。

圖2 齊整小核菌-哈茨木霉混合發(fā)酵制備寡糖的工藝優(yōu)化Fig.2 Fermentative production of glucan oligosaccharides by co-cultivation with Sclerotium rolfsii and Trichoderma harzianum

另外，在混菌培養(yǎng)時(shí)，哈茨木霉的接種量同樣也會(huì)影響寡糖的產(chǎn)量，因此可通過調(diào)整哈茨木霉種子液接種孢子的濃度來控制混菌時(shí)哈茨木霉的生物量。實(shí)驗(yàn)所制得的哈茨木霉孢子懸浮液原液的濃度約為1×108CFU/mL，而文獻(xiàn)[16]中所使用的最低孢子懸浮液濃度為2.5×106CFU/mL，因此對接種孢子懸浮液濃度進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2(b)所示。由圖2(b)可知：支化β-1,3-葡寡糖的產(chǎn)量在接種孢子濃度為1×107CFU/mL時(shí)達(dá)到最高，為4.0 g/L。同時(shí)，隨著哈茨木霉接種量的提高，內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶酶活也隨之升高。除了內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶外，哈茨木霉還會(huì)產(chǎn)生外切β-1,3-葡聚糖酶，當(dāng)2種酶酶活過高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致寡糖被繼續(xù)水解，從而造成產(chǎn)量的下降，而當(dāng)酶活較低時(shí)，寡糖產(chǎn)量也會(huì)比較低。因此，選擇最佳哈茨木霉接種孢子濃度為1×107CFU/mL。

培養(yǎng)基的pH會(huì)影響齊整小核菌的生長和多糖產(chǎn)量，也會(huì)影響哈茨木霉的生長和產(chǎn)酶情況。小核菌多糖在pH較低的情況下產(chǎn)量較高，單菌發(fā)酵優(yōu)化的結(jié)果是初始pH 4.0時(shí)多糖產(chǎn)量最高；而對于哈茨木霉單菌，初始pH 6.0時(shí)內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶產(chǎn)量達(dá)到最高。培養(yǎng)基初始pH優(yōu)化結(jié)果如圖2(c)所示。由2(c)可知：支化β-1,3-葡寡糖在pH為4.5時(shí)最高，為4.07 g/L；而內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶酶活在pH 5.5時(shí)最高，此時(shí)寡糖產(chǎn)量較低的原因可能是哈茨木霉生長情況較好，產(chǎn)生的外切酶及內(nèi)切酶過量，水解了生成的寡糖，導(dǎo)致寡糖產(chǎn)量的下降。因此選擇pH4.5為混菌發(fā)酵最佳初始pH。

齊整小核菌單菌發(fā)酵時(shí)間一般為5 d，在研究過程中發(fā)現(xiàn)，小核菌多糖產(chǎn)量在4 d時(shí)達(dá)到最高，而哈茨木霉的發(fā)酵時(shí)間通常是3～6 d。因此，混合培養(yǎng)時(shí)，在齊整小核菌發(fā)酵2 d時(shí)加入培養(yǎng)18 h的哈茨木霉菌液，結(jié)果如圖2(d)所示。由圖2(d)可知：兩菌混合培養(yǎng)后，發(fā)酵液的內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶酶活隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而升高，但在4 d時(shí)支化β-1,3-葡寡糖產(chǎn)量達(dá)到最高，為4.5 g/L。而發(fā)酵液中殘?zhí)窃? d時(shí)就已處在很低的水平，在5 d時(shí)則基本耗盡，這為寡糖產(chǎn)量在4 d后開始下降提供了合理的解釋。所以，4 d后齊整小核菌可能就不再產(chǎn)生多糖，或者由于拮抗作用，齊整小核菌菌體被哈茨木霉水解消亡，而哈茨木霉產(chǎn)生的酶繼續(xù)水解寡糖，造成產(chǎn)量下降。因此，在搖瓶中混合發(fā)酵時(shí)間為4 d時(shí)寡糖有最高產(chǎn)量。

2.2 7 L發(fā)酵罐水平制備支化β-1,3-葡寡糖

齊整小核菌在7 L發(fā)酵罐中的生長曲線如圖3所示。由圖3(a)可知：菌體干質(zhì)量在120 h時(shí)為8.27 g/L，相比搖瓶水平提高了215%；多糖產(chǎn)量在72 h時(shí)最高，為26.31 g/L，相比搖瓶水平提高了16.4%。從16 h到32 h，溶氧(DO)從99.7%迅速下降到27.1%，此后繼續(xù)降低并一直維持在較低的水平，這可能是菌體進(jìn)入對數(shù)生長期，且大分子量的多糖大量產(chǎn)生，使發(fā)酵液黏度迅速升高，造成了溶氧水平的下降。因此，這段時(shí)間對于混菌發(fā)酵成功與否至關(guān)重要。

由于實(shí)驗(yàn)條件所限無法完成哈茨木霉單獨(dú)發(fā)酵、再離心混菌的操作，因此選擇直接加入搖瓶培養(yǎng)的哈茨木霉種子液進(jìn)行混合發(fā)酵。因?yàn)楣哪久股倭藛为?dú)培養(yǎng)這一過程，在混菌中的生物量處于劣勢，因此與搖瓶培養(yǎng)相比，接種的時(shí)間要提前，才能實(shí)現(xiàn)共培養(yǎng)的成功，結(jié)果如圖3(b)所示。由圖3(b)可知：在溶氧為90%即齊整小核菌發(fā)酵19 h時(shí)接種哈茨木霉，獲得了較高產(chǎn)量的支化β-1,3-葡寡糖。其中，寡糖的產(chǎn)量先上升后下降，在39 h達(dá)到最高，為9.94 g/L，相比搖瓶水平提高了119%。后期寡糖含量開始下降，這可能是因?yàn)榇罅慨a(chǎn)生的內(nèi)切酶和外切酶造成產(chǎn)物水解，寡糖產(chǎn)量下降。因此，必須控制好混菌接種的時(shí)機(jī)，使多糖與內(nèi)切酶同時(shí)產(chǎn)生，從而獲得更高的寡糖產(chǎn)量。另外，我們發(fā)現(xiàn)直接加入哈茨木霉種子液的方法可以成功制得支化β-1,3-葡寡糖的窗口期很窄，因此在放大實(shí)驗(yàn)中，如設(shè)備條件允許，還是應(yīng)該將哈茨木霉單獨(dú)發(fā)酵，再接入齊整小核菌發(fā)酵液中進(jìn)行共培養(yǎng)，這樣兩株菌能在較長時(shí)間內(nèi)共存，有利于獲得更高的產(chǎn)量。

2.3 寡糖的結(jié)構(gòu)表征

將齊整小核菌與哈茨木霉混合發(fā)酵制得的支化β-1,3-葡寡糖命名為小核寡糖(Sr.bOβG)，將裂褶菌與哈茨木霉通過同樣混合發(fā)酵方法獲得的支化β-1,3-葡寡糖命名為裂褶寡糖(Sc.bOβG)。采用Superose 12凝膠柱對2種發(fā)酵上清液進(jìn)行分析，HPLC結(jié)果如圖4(a)所示。由圖4(a)可知：齊整小核菌、裂褶菌與哈茨木霉共培養(yǎng)得到的發(fā)酵上清液中只含有小分子量的寡糖(保留時(shí)間為34.646 min)，不含大分子量的多糖(保留時(shí)間40.147 min為溶劑峰)。單糖組成的結(jié)果如圖4(b)所示。由圖4(b)可知：小核寡糖和裂褶寡糖均只含有葡萄糖。因?yàn)楦咝б合嗌V的結(jié)果只能得到一個(gè)粗略的分子量范圍，并不能準(zhǔn)確得出所產(chǎn)支化β-1,3-葡寡糖的具體聚合度，所以，將上述樣品再進(jìn)行MALDI-TOF MS分析，結(jié)果如圖5所示。通過計(jì)算，小核寡糖的聚合度(DP)為5～12，裂褶寡糖的DP為5～15。由此可知，混合發(fā)酵所產(chǎn)支化β-1,3-葡寡糖的分子量分布范圍較小。另外，將搖瓶和發(fā)酵罐培養(yǎng)不同時(shí)間的樣品都進(jìn)行了MALDI-TOF MS分析，得出的結(jié)果都是一致的，因此這種混合培養(yǎng)的方法能得到固定分子量范圍的支化β-1,3-葡寡糖。

圖4 小核寡糖和裂褶寡糖HPLC譜圖及單糖組成分析Fig.4 HPLC profile and monosaccharide composition analysis of Sr.bOβG and Sc.bOβG

圖5 小核寡糖和裂褶寡糖MALDI-TOF MS分析結(jié)果Fig.5 MALDI-TOF MS analysis of Sr.bOβG and Sc.bOβG

2.4 寡糖體外抗氧化活性研究

天然多糖具有良好的抗氧化活性[7-10]，因此本研究進(jìn)一步測試不同支鏈和線性葡寡糖的抗氧化活性，結(jié)果如圖6所示。由圖6(a)可知：當(dāng)寡糖質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，裂褶寡糖對DPPH自由基的清除率為95.53%，小核寡糖的清除率為50.55%，熱凝膠寡糖的清除率為0.64%。因此，與熱凝膠寡糖相比，2種支鏈寡糖清除DPPH自由基活性明顯提高，其中裂褶寡糖又好于小核寡糖，雖都低于維生素C(Vc)，但仍證明2種支鏈寡糖有較好的抗氧化活性。另外，羥自由基在生物體內(nèi)很容易與許多大分子進(jìn)行反應(yīng)，如氨基酸、蛋白質(zhì)和DNA等，從而對生命體造成損傷[26]。因此，對羥自由基的清除能力是天然產(chǎn)物抗氧化活性評價(jià)的重要組成部分。

β-1,3-葡寡糖的羥自由基清除效果如圖6(b)所示。由圖6(b)可知：當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，裂褶寡糖對羥自由基的清除率為99.2%，小核寡糖的清除率為97.31%，兩者基本接近Vc的水平。另外，熱凝膠寡糖也有一定的效果，但相比之下效果較差。同時(shí)，從隨濃度變化的趨勢來看，清除羥自由基的活性從大到小為Vc、裂褶寡糖、小核寡糖、熱凝膠寡糖。因此，2種支鏈β-1,3-寡糖有比較好的抗氧化活性。

圖6 寡糖抗氧化活性分析Fig.6 Antioxidant activity analyses of oligosaccharides

與其他自由基相比，超氧陰離子自由基具有更低的反應(yīng)活性和更長的存在時(shí)間，使得可以參與進(jìn)一步的反應(yīng)，并導(dǎo)致更多活性氧的生成，從而損傷機(jī)體[26]。β-1,3-葡寡糖對超氧陰離子自由基的清除效果如圖6(c)所示。由圖6(c)可知：3種β-1,3-葡寡糖均未表現(xiàn)出清除超氧陰離子自由基的活性。因此，該類結(jié)構(gòu)的β-1,3-葡寡糖以及連接β-1,6支鏈的葡寡糖均不具有清除超氧陰離子自由基的能力。另外，對β-1,3-葡寡糖的還原力進(jìn)行測定，結(jié)果如圖6(d)所示。由圖6(d)可知：當(dāng)β-1,3-葡寡糖質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，裂褶寡糖的OD700為1.029，小核寡糖的OD700為0.312，熱凝膠寡糖的OD700為0.126。因此，裂褶寡糖還原力大于小核寡糖，而熱凝膠寡糖還原力較差。

綜合以上4種抗氧化活性的評價(jià)方法，驗(yàn)證了支化的小核寡糖和裂褶寡糖具有較好的抗氧化活性，其中裂褶寡糖優(yōu)于小核寡糖，而采用化學(xué)法制備的線性熱凝膠寡糖效果很差，也證明支鏈寡糖比熱凝膠寡糖有更好的活性，更具有研究價(jià)值。此外，同時(shí)采用大分子量的小核多糖和裂褶多糖在相同濃度下進(jìn)行了4種抗氧化活性研究，均無效果，進(jìn)一步證明該種結(jié)構(gòu)的寡糖相比多糖具有更好的活性。

微生物之間的相互作用關(guān)系非常復(fù)雜，利用好這些相互作用關(guān)系能夠提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，或者產(chǎn)生新的物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)室近年來一直研究通過建立混合培養(yǎng)體系，利用內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶水解β-1,3-葡聚糖以制得β-1,3-葡寡糖。前期我們將土壤桿菌與哈茨木霉混合培養(yǎng)，成功制得DP為19～25的β-1,3-葡寡糖，產(chǎn)量最高達(dá)到17.31 g/L，并證明具有一定的抗腫瘤活性[16]。另外，李菲菲等[27]進(jìn)一步建立土壤桿菌與畢赤酵母混合培養(yǎng)體系，也成功制得β-1,3-葡寡糖，DP為17～22，最高產(chǎn)量為4.3 g/L。該類大分子量葡聚糖水溶性差，直接酶解效率低下，且聚合度分布范圍較廣。在混合培養(yǎng)體系中，葡聚糖和水解酶同時(shí)生成，邊產(chǎn)糖邊酶解，因此具有成本低廉、操作簡單、水解效率高、產(chǎn)物聚合度均一的優(yōu)點(diǎn)。

3 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了齊整小核菌-哈茨木霉和裂褶菌-哈茨木霉混合發(fā)酵體系以制備支化β-1,3-葡寡糖，分別命名為小核寡糖和裂褶寡糖，其DP分別為5～12和5～15。2種寡糖具有良好水溶性，結(jié)構(gòu)表征證明2種寡糖均由葡萄糖構(gòu)成?？寡趸钚詼y定表明，相比多糖與直鏈β-1,3-葡寡糖，支鏈β-1,3-葡寡糖具有更好的抗氧化活性，其中裂褶寡糖抗氧化活性優(yōu)于小核寡糖。本文建立的新的混合培養(yǎng)體系為制備支化β-1,3-葡寡糖提供了新的方案，也為混合發(fā)酵法拓展了新的領(lǐng)域。后續(xù)實(shí)驗(yàn)還需對寡糖的抗腫瘤活性等進(jìn)行研究，以拓展支化β-1,3-葡寡糖的應(yīng)用領(lǐng)域。