星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化瑞德西韋/羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的制備工藝

劉 洋，閔 婕，顧 念，陸 潔，章曉驊，徐 丹

(南京正大天晴制藥有限公司 制劑所，江蘇 南京 210046)

冠狀病毒是自然界廣泛存在的一大類病毒，屬于套式病毒目冠狀病毒科，某些冠狀病毒會感染人類并引起疾病，如嚴重急性呼吸綜合征、中東呼吸綜合征等。2019冠狀病毒疾病(COVID-19)[1]是目前已知的第7種可感染人的冠狀病毒，全球范圍內(nèi)已引起數(shù)千萬人感染，數(shù)百萬人死亡[2]，成為嚴重威脅人類生命健康的公共衛(wèi)生事件。

瑞德西韋(Remdesivir)可通過競爭性抑制核苷類RNA依賴的RNA聚合酶抑制病毒感染[3]，適應(yīng)性新型冠狀病毒肺炎治療試驗(ACTT-1)證實瑞德西韋是治療2019冠狀病毒疾病的有效藥物之一[4]，但瑞德西韋的水溶性低(水中的溶解度小于0.03 mg/mL)、穩(wěn)定性差等特點，限制了其制劑制備和臨床使用。β-環(huán)糊精包合技術(shù)是難溶性藥物注射給藥增溶技術(shù)之一，通過將藥物分子全部或部分包入環(huán)糊精形成的空穴中，具有提高難溶性藥物溶解度、提高藥物穩(wěn)定性和生物利用度等優(yōu)點[5-6]；羥丙基-β-環(huán)糊精是一種理想的包合物制備輔料，具有較好的溶解度和較低的毒性[7]，已用于多個市售包合物制劑中。

星點設(shè)計是在析因設(shè)計基礎(chǔ)上加上星點及中心點的試驗設(shè)計方法，具有試驗次數(shù)少、試驗精度高等優(yōu)點，在制劑處方或工藝優(yōu)化中應(yīng)用廣泛[8]。星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法通過描繪效應(yīng)對考察因素的效應(yīng)面，并從效應(yīng)面上選擇較佳的效應(yīng)區(qū)，從而得到最佳實驗條件；由于效應(yīng)與因素間的關(guān)系可能是線性或非線性，即效應(yīng)面對應(yīng)為平面或曲面，因此，可通過建立效應(yīng)與因素間的數(shù)學(xué)模型來描繪效應(yīng)面函數(shù)，并通過復(fù)合相關(guān)系數(shù)(r)來評價數(shù)學(xué)模型與效應(yīng)面函數(shù)的近似程度，復(fù)合相關(guān)系數(shù)(r)越高表明預(yù)測值更接近真實值，效應(yīng)面的近似程度和優(yōu)選條件的準確度越高[9]。

本研究采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化瑞德西韋包合物的制備工藝，并對包合物進行鑒別，為我公司后續(xù)產(chǎn)品開發(fā)和生產(chǎn)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

SQP SECURA313-1CN型電子天平，德國賽多利斯公司；RET B S25型磁力攪拌器，德國IKA公司；S210-K型酸度計，瑞士Mettler Toledo公司；HWS26型恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LYO-0.5型冷凍干燥機，上海東富龍科技股份有限公司；e02695型高效液相色譜儀，美國Waters公司。

1.2 主要材料

瑞德西韋(批號：AEMD-200302)，南京正大天晴制藥有限公司；HP-β-CD(批號：47K180519)，匈牙利Cylolab公司；鹽酸、NaOH(分析純)，南京化學(xué)試劑股份有限公司；乙酸(分析純)，美國ROE Scientific Inc.；乙腈(色譜純)，美國TEDIA公司。

1.3 方法

1.3.1 包合物的制備

精密稱取規(guī)定量的瑞德西韋和HP-β-CD，將HP-β-CD溶于50 mL純化水中，采用稀鹽酸(濃度為1 mol/L)調(diào)節(jié)溶液pH至目標值，加入瑞德西韋，在一定溫度下磁力攪拌60 min進行包合，0.22 μm濾膜過濾，0.5 mol/L NaOH調(diào)pH至3.5，定容至50 mL，攪拌混勻后，冷凍干燥即得。

1.3.2 HPLC法測定包合物中瑞德西韋

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm,3.5 μm)，流動相為0.1%乙酸水溶液-乙腈(體積比為55∶ 45)。精密稱取瑞德西韋10 mg，乙腈溶解并定容至20 mL，搖勻。20%乙腈稀釋成的藥物質(zhì)量濃度分別為28、32、36、40、44和48 μg/mL系列標準溶液。取標準溶液10 μL注入高效液相色譜儀，柱溫為35 ℃，檢測波長為243 nm，流速為1.0 mL/min。理論塔板數(shù)(按瑞德西韋計算)不低于2 000，分離度大于1.5。記錄峰面積A，以瑞德西韋的質(zhì)量濃度ρ為橫坐標，峰面積A為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.3 考察指標

包合率(Y1)是包合物的重要指標，精密稱取瑞德西韋/HP-β-CD包合物100 mg于50 mL量瓶中，乙腈溶解定容后，精密量取1 mL溶解后的溶液于50 mL容量瓶中，20%乙腈定容，得解包合后的瑞德西韋/HP-β-CD供試液，進樣10 μL，記錄色譜圖及峰面積，代入標準曲線，計算得包合瑞德西韋質(zhì)量(W包)。按式(1)計算瑞德西韋/HP-β-CD包合物的包合率，而包合工藝篩選的重要指標的收率(Y2)的計算見式(2)。

Y1=W包/W總×100%

(1)

Y2=m(干燥包合物)/(m(HP-β-CD)+
m(瑞德西韋) )

(2)

本研究中，Y1和Y2均取值越大越好，因此采用Hassan[6]方法。dn=(Ymax-Yn)/(Ymax-Ymin)將各指標轉(zhuǎn)換成“歸一值”，并計算幾何平均數(shù)，得總評“歸一值OD”，OD=(d1d2···dn)1/n，其中n為指標數(shù)，d為各指標“歸一值”[7]。

1.3.4 星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化工藝

1)因素水平的確定。影響Y1、Y2和OD的主要因素包括HP-β-CD/瑞德西韋摩爾比、包合溫度、溶液pH和包合時間等。通過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)包合時間超過5 min時，其波動大小導(dǎo)致考察指標的變化基本保持在±5%以內(nèi)，因此，包合時間不納入本研究參數(shù)考量范圍，僅從HP-β-CD/瑞德西韋摩爾比、包合溫度、溶液pH這3個因素進行優(yōu)化。采用單因素試驗，固定其中2個因素，考察第3個因素對Y1、Y2和OD的影響，以確定各因素的取值水平。

2)星點設(shè)計方案。以單因素試驗結(jié)果為依據(jù)，采用星點設(shè)計優(yōu)化包合工藝[8-9]。根據(jù)星點設(shè)計原理，每個因素設(shè)5個水平，分別用代碼值-α、-1、0、1、α表示(三因素星點設(shè)計α=1.682)。

3)模型擬合和方差分析。以包合率(Y1)、收率(Y2)和幾何總評“歸一值OD”作為因變量，HP-β-CD/瑞德西韋摩爾比(X1)、包合溫度(X2)和溶液pH(X3)為自變量，應(yīng)用Design Expert 8.0軟件進行多元線性回歸和多項式方程擬合，采用復(fù)相關(guān)系數(shù)(r)對模型好壞進行評價。采用ANOVA分析效應(yīng)面的回歸參數(shù)。

4)效應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計。采用Design Expert 8.0軟件分析，繪制幾何總評“歸一值OD”與影響顯著的2個自變量的三維效應(yīng)面和二維等高圖(另外1個自變量設(shè)為中心點值)，預(yù)測最佳包合條件。

1.3.5 最優(yōu)處方工藝驗證

按最佳包合條件重復(fù)試驗3次，預(yù)測值與實測值的偏差的計算見式(3)。

偏差=(預(yù)測值-實測值)/預(yù)測值×100%

(3)

2 結(jié)果與討論

2.1 標準曲線

通過試驗繪制瑞德西韋線性回歸曲線，回歸方程為A=33 817ρ-27 018(r2=0.999 7)，表明在28～48 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 因素水平的確定

考察HP-β-CD /瑞德西韋的摩爾比、包合溫度和溶液pH等單因素預(yù)實驗，結(jié)果見表1～表3。由表1～3可知：當(dāng)HP-β-CD/瑞德西韋的摩爾比為8∶1時，Y1和Y2值最大，此后隨著摩爾比增大，Y1和Y2值基本趨于穩(wěn)定，因此選定HP-β-CD/瑞德西韋摩爾比為8∶1作為中心點。當(dāng)包合溫度為27.5 ℃時，Y1和Y2值最大，此后隨著包合溫度升高，Y1和Y2值基本趨于穩(wěn)定，因此選定27.5 ℃作為中心點。當(dāng)溶液pH為1.8時，Y1和Y2值最大，此后隨著pH降低，Y1和Y2值趨于穩(wěn)定，因此選定pH 1.8作為中心點。

表1 HP-β-CD/瑞德西韋摩爾比對包合效果的影響

表2 包合溫度對包合效果的影響

表3 溶液pH對包合效果的影響

2.3 星點設(shè)計試驗結(jié)果

在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)，設(shè)計包合物工藝優(yōu)化星點設(shè)計的試驗，具體設(shè)計及結(jié)果見表4，并進行模型擬合及方差分析，結(jié)果見表5。

根據(jù)表4的結(jié)果，分別采用多元線性回歸、二次多項式、三次多項式對試驗結(jié)果進行擬合，具體擬合的結(jié)果見式(1)～(3)。

表4 瑞德西韋/HP-β-CD包合物工藝優(yōu)化星點設(shè)計及結(jié)果

表5 擬合方程方差分析結(jié)果

多元線性回歸方程：Y1=85.73+5.70X1+3.99X2+1.42X3(r=0.759，P=0.000 7)；Y2=88.00+11.54X1+1.22X2+1.91X3(r=0.763，P=0.000 6)；OD=0.71+0.25X1+0.11X2+0.047X3(r=0.772，P=0.000 5)。

(1)

(2)

(3)

由式(1)～(3)可知：二項式擬合方程的復(fù)合相關(guān)系數(shù)(r)最大且接近1，表明二項式擬合較多元線性回歸擬合度高、預(yù)測性好，故選擇二項式擬合為最佳模型。

2.4 效應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

在星點設(shè)計試驗的基礎(chǔ)上，進行效應(yīng)面優(yōu)化，各自變量間的三維效應(yīng)曲面圖見圖2～4。由圖2～4可知：預(yù)測得瑞德西韋/HP-β-CD包合物制備的最佳包合條件：HP-β-CD/瑞德西韋的摩爾比為8.0，包合溫度為27.5 ℃，溶液pH為1.8。預(yù)測的包合率和收率分別為94.27%、96.23%。

圖2 HP-β-CD/瑞德西韋的摩爾比值與包合溫度對OD值的影響Fig.2 Effects of HP-β-CD/Remdesivir molar ratio and inclusion temperature on the OD value

圖3 HP-β-CD/瑞德西韋的摩爾比值與溶液pH對OD的影響Fig.3 Effects of HP-β-CD/Remdesivir molar ratio and solution pH on OD value

圖4 包合溫度與溶液pH對OD的影響Fig.4 Effects of inclusion temperature and solution pH on OD value

2.6 最優(yōu)處方工藝驗證結(jié)果

基于以上的優(yōu)化試驗結(jié)果，按最佳包合條件進行平行3組包合驗證試驗，結(jié)果見表6。由表6可知：包合率的預(yù)測值與實測值之間偏差為2.11%，收率的預(yù)測值與實測值之間偏差為2.33%，偏差均很小，表明擬合方程可以較好地描述各因素與評價指標的關(guān)系。

表6 包合驗證試驗結(jié)果

3 結(jié)論

選用羥丙基-β-環(huán)糊精作為包合物材料，采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化瑞德西韋/HP-β-CD包合物處方工藝，與線性回歸方程和三項式擬合方程相比，二項式擬合方程的擬合度更好，通過描繪三維效應(yīng)面和二維等高圖，確定了較優(yōu)的制備工藝是HP-β-CD/瑞德西韋的摩爾比值為8.0、包合溫度為27.5 ℃、溶液pH為1.8，按照預(yù)測的最優(yōu)工藝制備的包合物的包封率和收率與預(yù)測值偏差均<5%，表明二項式擬合方程能較好地描述各因素與評價指標的關(guān)系。

綜上，采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化得到的瑞德西韋/HP-β-CD包合物最優(yōu)處方工藝可靠且重現(xiàn)性好，為后續(xù)包合物品種的開發(fā)及工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。