瑞德西韋聚合物納米膠束的制備及表征

武海軍，李玉鳳，鐘強，張廣桃，馬春雷，謝紀珍

(1.山東省食品藥品審評查驗中心，山東 濟南 250013；2.青島市市立醫(yī)院，山東 青島 266033;3.山東華鉑凱盛生物科技有限公司，山東 濟南 250098)

瑞德西韋(Remdesivir，GS-5734)，又名倫地西韋，結構式見圖1，這是一種具有廣譜抗病毒活性的核苷類似物。瑞德西韋作為一種前體藥物，其進入宿主細胞后會代謝為具有藥理活性的三磷酸核苷(nucleoside triphos phate，NTP)[1],隨后被RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)識別，滲入病毒基因組的合成，使得磷酸二酯鍵無法形成，進而終止 RNA 鏈的合成，抑制病毒復制。瑞德西韋阻斷病毒復制、發(fā)揮抑制病毒作用的方法有兩種，其一是與三磷腺苷(ATP)競爭 RdRp，其二為阻止校正作用的核糖核酸外切酶發(fā)揮正常功能[2-4]。作為單磷酸前藥，瑞德西韋結構中的苯酚和氨基酸酯可以掩蓋單磷酸基團的負電荷，使其很容易地被動滲透到細胞中。在將單磷酸輸送到細胞中時，可以有效繞過限速第一磷酸化步驟，從而顯著提高母體核苷的效力。隨后，胞內酯酶(如羧基酯酶-1和組織蛋白酶A)將酯分解為羧基結構，然后繼續(xù)分解為單磷酸核苷，最后被磷酸化為三磷酸核苷發(fā)揮抗病毒效果[4]。瑞德西韋在體外實驗中顯示出對多種病毒的抑制作用，例如冠狀病毒、丙肝病毒、人類免疫缺陷病毒和埃博拉病毒等[2,5]。目前，瑞德西韋用于埃博拉病毒感染治療的Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗已完成，未發(fā)現其有明顯不良反應[4]；在 CN103052631B 和 CN105443098B 中瑞德西韋可以治療呼吸道合胞病毒感染和副流感病毒感染[6-7]；在 CN107073005A 中瑞德西韋可以治療絲狀病毒科病毒感染[8]；在 CN108348526A 中瑞德西韋可以治療拉沙病毒和胡寧病毒感染[9]；在 HAE 細胞中，瑞德西韋對 SARS-CoV 和 MERS-CoV 的EC50值為 74 nmol·L-1，在延遲腦腫瘤細胞中，對鼠肝炎病毒的 EC50值為30 nmol·L-1[3]。在 Vero E6細胞中，瑞德西韋可有效抑制 SARS-CoV-2 的感染，EC50為 0.77 μmol·L-1，選擇指數(selection index，SI)>129[10]，這說明瑞德西韋在細胞水平上能對冠狀病毒感染起到抑制效果。

圖1 瑞德西韋分子結構

然而，瑞德西韋溶解性較差，它在水中溶解度大約 0.03 mg·mL-1，且化學不穩(wěn)定，在pH約4～5之間的溶液最穩(wěn)定，在pH為4或以下時，溶解度增加，這在美國專利 US20190083525 中也有確證[11]。除此之外，瑞德西韋溶解在含有有機溶媒的水溶液中，會隨混合溶液中有機溶劑或增溶劑比例的下降而急劇下降，稀釋過程中極容易析出，從而帶來安全性問題。根據 US20190083525 描述及我們研究顯示，采用吐溫80或PEG300溶解瑞德西韋需要大量的吐溫80或PEG300，且組成黏度大；采用無菌生產工藝樣品難以過濾，而采用終端滅菌工藝會導致樣品出現不穩(wěn)定的問題，且臨床應用時如果稀釋10倍或者100倍，會導致瑞德西韋結晶析出、長期放置不穩(wěn)定，同時會在體內造成溶血、超敏反應等問題[11]，這也是吉利德公司的沒有選擇吐溫80作為增溶劑，而是選擇了磺丁基倍他環(huán)糊精的原因。

根據美國專利 US20190083525 及相關文獻報道，瑞德西韋凍干制劑除活性成分外，還包含以下非活性成分：注射用水，磺丁基-β-環(huán)糊精鈉(SBECD),使用鹽酸和/或氫氧化鈉將制劑的pH調節(jié)至3.0至4.0，而后凍干[11]。瑞德西韋臨床給藥方式為：首日靜脈給藥200 mg，之后每天一次100 mg，30 min內完成，根據病毒載荷持續(xù)給藥9～13 d[12]，這樣的給藥方式和瑞德西韋的藥物代謝方式有關。在靜脈給藥后，瑞德西韋會進入細胞代謝成活性的GS-443902(見圖2)。外周血單核細胞(PBMC)中研究表明，GS-443902的半衰期長達35 h以上[13]。根據WHO的報告[14]，瑞德西韋在3～225 mg范圍內單次靜脈注射給藥2 h的情況下，其體內濃度具有線性的劑量相關性。早期研究顯示在30 min內靜脈內給予瑞德西韋75 mg提供與2 h內相同劑量相似的母體暴露水平，但GS-443902的PBMC暴露高于2 h內靜脈給予瑞德西韋150 mg。該數據支持在30 min的較短時間間隔內給藥，這是使活性代謝物GS-443902的細胞內水平最大化的更有效給藥方式。外周血單核細胞(PBMC)中的GS-443902觀察到細胞內半衰期超過35 h，這支持了每天一次的瑞德西韋給藥。此外，細胞內代謝產物的累積比為2.7～3.5倍，首劑量瑞德西韋200 mg，每天重復瑞德西韋100 mg 維持劑量，保證了隨后的GS-443902穩(wěn)態(tài)PBMC水平的實現，對急性感染患者的治療至關重要[15-16]。

圖2 GS-443902化學結構式

截至目前，除了吉利德所報道的瑞德西韋環(huán)糊精凍干制劑，再無其他劑型報道，雖然現有劑型解決了瑞德西韋水溶性問題，并用于臨床，但現有瑞德西韋劑型仍存在如下問題：①磺丁基-β-環(huán)糊精鈉主要通過腎小球濾過作用在腎臟中排泄，總體上體內安全，但在肌酐清除率<50 mL·min-1或長期多劑量給藥的情況下會出現腎小管空泡化的組織病理學改變，甚至出現肺泡沫細胞灶，肝壞死和腎小管堵塞[17]；②瑞德西韋療效有劑量依賴性，應提高單核細胞對其吞噬效率、速率，以更好提高GS-443902穩(wěn)態(tài)PBMC水平[13]；③COVID-19 病理特征CT影像顯示大部分COVID-19 患者肺部出現病變，病灶部位多不規(guī)則。輕癥患者肺部病變以磨玻璃密度影為主；重癥患者肺部病變以磨玻璃密度影合并彌漫性實變影為主[18],多伴條索狀陰影，部分為雙肺病變，少數呈“白肺”狀。經肺部活檢，患者肺部均發(fā)生病理變化，包括：①肺部存在蛋白質滲出物；②氣腔內存在大量免疫細胞；③肺部可見纖維蛋白；④肺泡上皮細胞增生，COVID-19對肺部損傷很重；此外COVID-19對肝、脾、腎都有影響。然而由于血漿中存在大量的水解酶，瑞德西韋在血漿中很不穩(wěn)定。實驗表明，瑞德西韋靜脈注射后，在小鼠體內的血漿半衰期小于 5 min，恒河猴體內的血漿半衰期僅為 0.39 h[1,3]，在人體血漿中的半衰期為 1 h[19]。基于瑞德西韋的物理化學性質及其在組織血漿中的不穩(wěn)定性，可以預計靜脈注射后瑞德西韋在肺部組織中的分布和滲透率較低。在多項動物模型中，肺部均未檢測到瑞德西韋，其活性代謝物的濃度也較低。因此應盡可能提高其病灶部位濃度，從而提高療效。

基于上述問題，我們制備瑞德西韋(Remdesivir，GS-5734)聚合物納米膠束粉針形態(tài)，在不需要磺丁基-β-環(huán)糊精鈉(SBECD)及任何酸堿調節(jié)劑的情況下，就解決了瑞德西韋水溶性、物理、化學穩(wěn)定性問題，重要的是所制備的瑞德西韋聚合物納米膠束粉針劑復溶后，可自組裝成 8～100 nm大小的粒子，有利于藥物被動聚集在肺部，提高瑞德西韋的最大耐受劑量。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 瑞德西韋原料(山東華鉑凱盛生物科技有限公司，批號:200413，含量：99.0%)；瑞德西韋普通注射劑(山東華鉑凱盛生物科技有限公司，批號:200501，100 mg/瓶)；瑞德西韋對照品(山東華鉑凱盛生物科技有限公司，批號:200319，含量：99.0%)；mPEG-b-PDLLA(山東華鉑凱盛生物科技有限公司，批號:191208)；無水乙醇(天津市富宇精細化工有限公司，分析純)。

1.2 儀器 試驗所用儀器有旋轉蒸發(fā)儀(杭州庚雨儀器有限公司，N-1100)；冷凍干燥機(上海億倍實業(yè)有限公司，YB-FD-20D)；透射電子顯微鏡(日本電子株式會社，JEM-1200EX)；馬爾文粒度測定儀(英國馬爾文儀器有限公司，Nano S90)；X 射線衍射儀(德國布魯克公司，D8 ADVANCE)；液相色譜儀(安捷倫1200)；電子天平(上海精密電子天平，FA1204B)；高速離心機(上海安亭科學儀器廠，TGL-16G)；水浴恒溫振蕩器(國華企業(yè)，SHA-B)。

1.3 瑞德西韋聚合物膠束的制備及表征

1.3.1 瑞德西韋聚合物膠束制備 采用固體分散法制備瑞德西韋聚合物膠束[20]，先將瑞德西韋與mPEG-b-PDLLA按1∶9比例共溶于無水乙醇中，60 ℃水浴條件下減壓蒸餾至溶劑全部蒸出，得到分散均勻聚合物基質，加入60 ℃預熱的注射用水溶解基質即得瑞德西韋聚合物膠束溶液。將溶液用0.22 μm的微孔濾膜過濾，續(xù)濾液分裝后凍干，置于4 ℃長期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 形態(tài)粒徑表征 瑞德西韋膠束凍干粉用水分散后，滴于Formvar膜，室溫下自然晾干后，用1%磷鎢酸負染，室溫晾干后，用透射電子顯微鏡(JEM-1200EX，JEOL)，于50 k倍下觀察形態(tài)。瑞德西韋膠束凍干粉用水分散后，用馬爾文激光粒度測定儀(Nano S90，Malvern)進行粒徑測試，平行3次。

1.3.3 XRD單晶衍射測試 室溫下，分別取200 mg空白mPEG-b-PDLLA聚合物載體材料、瑞德西韋、瑞德西韋膠束凍干粉、瑞德西韋與材料物理混合粉(1∶9)，置于瑪瑙研缽適度研磨，取適量研磨細粉置于測試槽，并用干凈載玻片涂抹均勻，用XRD單晶衍射儀(D8 ADVANCE)進行測試分析。射線為經鎳濾過處理銅Kα輻射(λ =0.154 nm)，掃描范圍為5o～50o，記錄圖譜并分析。

1.3.4 瑞德西韋含量測定 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑C18(4.6 mm ×150 mm,5 μm)，以磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鉀2.72 g，加水1 000 mL，攪拌溶解，用磷酸調節(jié)pH值至4.0)為流動相A，乙腈為流動相B，按表1進行線性洗脫；流速為每分鐘1.0 mL；柱溫為30 ℃；檢測波長為240 nm；進樣體積20 μL。精密稱定相當于瑞德西韋10 mg的聚合物樣品，置10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，作為供試品溶液。取20 μL注入液相色譜儀中，記錄色譜圖。另精密稱定瑞德西韋對照品10 mg，置10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，作為對照品溶液，同法測定。

表1 洗脫梯度

1.3.5 載藥量與包封的測定 精密稱取相當于含瑞德西韋10 mg的聚合物納米膠束凍干粉置于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，超聲溶解，12 000 r·min-1離心5 min，取上清液照色譜條件進樣，重復3次，按外標法計算。通過公式(1)、(2)計算瑞德西韋的載藥量和包封率。

(1)

(2)

1.3.6 體外釋放曲線測定 分別取含瑞德西韋濃度為0.5 mg·mL-1膠束水溶液以及瑞德西韋普通注射液各5 mL，置于透析袋中進行體外釋放，平行3組。釋放介質為0.1% CTAB水溶液35 mL ，置于37 ℃，100 r·min-1水浴恒溫振蕩器振搖。分別于0.5、1、2、4、6、8、12、24 h取釋放介質1 mL，同時補入新鮮介質 l mL，照“1.3.4”項下色譜條件進樣，采用外標法計算瑞德西韋累計釋放度，繪制體外釋放曲線。

2 結果

2.1 瑞德西韋聚合物膠束制備結果與形態(tài)表征 采用固體分散方法制備的瑞德西韋聚合物納米膠束包封率、收率均很理想，復溶前及復溶后水溶液有明顯藍色乳光，符合丁達爾現象。圖1A為瑞德西韋聚合物納米膠束的凍干粉針劑形態(tài)，復溶共聚物后形成的膠束溶液澄清且具有淺藍色乳光(見圖1B)。圖2馬爾文激光粒度儀測定瑞德西韋聚合物納米膠束復溶后的粒徑，平均結果為(12.97±1.33)nm(見圖2A)，多分散指數為(0.062±0.023)。經染色后的瑞德西韋膠束在透射電鏡下粒子形態(tài)圓整，分散均勻，粒徑在10～100 nm (見圖2B)。但采用磺丁基-β-環(huán)糊精鈉包裹的瑞德西韋普通制劑，其水溶液通過馬爾文激光粒度儀測定，其粒徑非常不均勻(見圖3)。

A.瑞德西韋聚合物納米膠束的凍干粉針劑;B.瑞德西韋聚合物納米膠束水溶液圖1 瑞德西韋聚合物納米膠束

A.瑞德西韋聚合物納米膠束水溶液馬爾文測定粒徑;B.瑞德西韋聚合物納米膠束透射電鏡圖2 馬爾文激光粒度儀測定瑞德西韋聚合物納米膠束復溶后的粒徑

圖3 瑞德西韋普通注射劑(SBECD裝載)水溶液馬爾文測定粒徑

2.2 XRD單晶衍射測試結果 XRD單晶衍射圖譜如圖4所示，MPEG-b-PDLLA空白材料在19 °及23 °有明顯特征峰(見圖4A)，瑞德西韋聚合物納米膠束凍干粉(見圖4B)與瑞德西韋和載體材料的物理混合粉(見圖4C)在相同位置均存在明顯的載體輔料特征峰，而純瑞德西韋原料(見圖4D)此處并無吸收，由此表明19°及23°位置峰為材料特征峰。同理，瑞德西韋原料在8～18°及22.5°存在峰高不等的峰(見圖4D)，此為瑞德西韋特征峰，并且在瑞德西韋和載體材料的物理混合粉樣品圖中也有這些特征峰，相反，瑞德西韋聚合物納米膠束凍干粉卻沒有瑞德西韋特征峰，說明瑞德西韋完全包裹在載體的內部，而不是吸附在外面，而采用物理混合的粉末(見圖4C)有明顯瑞德西韋特征峰(8～18°及22.5°)，這也驗證瑞德西韋聚合物納米膠束中的瑞德西韋是包裹在納米膠束載體中。

A.載體mPEG-PDLLA;B.瑞德西韋聚合物納米膠束凍干粉(RNM);C.瑞德西韋原料(Remdesivir);D.載體mPEG-PDLLA與瑞德西韋原料的物理混合粉(10∶90)的XRD衍射圖譜圖4 XRD單晶衍射圖

2.3 載藥量與包封率測試結果 圖5為瑞德西韋聚合物納米膠束的HPLC圖譜，其主峰保留時間20.25 min，與前后雜質能夠有效分離，同時瑞德西韋聚合物納米膠束載藥量與包封率測試結果見表2，其載藥量平均值為(10.95%±0.33%)，瑞德西韋聚合物納米膠束的包封率為(99.25%±0.86%)，說明我們的制備工藝具有較好的載藥量與包封率。

圖5 瑞德西韋聚合物納米膠束的HPLC圖

表2 載藥量與包封率結果

2.4 體外釋放 通過HPLC檢測瑞德西韋從聚合物納米膠束與普通瑞德西韋注射液(SBECD包裹)在0.5%(W/V)吐溫-80的磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)介質中的釋放行為。如圖6所示，瑞德西韋聚合物納米膠束在24 h藥物只釋放了60%，而普通瑞德西韋注射液在3 h內藥物釋放已達85%以上，表明瑞德西韋聚合物納米膠束具有明顯的緩釋效果。

圖6 (▲)普通瑞德西韋注射液和(■)瑞德西韋聚合物膠束體外釋放曲線(n=3)

3 討論

本文采用生物可降解mPEG-b-PDLLA聚合物材料，利用固體分散法制備瑞德西韋納米聚合物納米膠束，極大提高了瑞德西韋的水中溶解度。其載藥機理是由于系統自由能的降低即疏水作用引起聚合物材料自組裝，形成疏水部分-親水部分的“核-殼”結構，組裝的同時藥物被包載于疏水內核?；嵌』?β-環(huán)糊精鈉主要通過腎小球濾過作用在腎臟中排泄，劑量過大會出現腎小管空泡化的組織病理學改變，而瑞德西韋聚合物納米膠束粒徑8～100 nm且分布均勻，形態(tài)圓整，腎臟的清除閾值為5～6 nm，瑞德西韋聚合物納米膠束可以避免腎臟清除，消除了磺丁基-β-環(huán)糊精鈉在腎臟蓄積問題；同時平均粒徑為(12.97±1.33)nm的粒子在肺部會有大量聚集，這對提高肺部藥物聚集，提高藥效無疑是有意的。

瑞德西韋與載體材料構成穩(wěn)定疏水內核，載藥量高，包封性好，無藥物突釋現象，且通過載體減小藥物透過和擴散系數，使藥物釋放達到緩釋效果。2020 年 10 月 FDA 批準吉利德公司的瑞德瑞德西韋普通注射劑Veklury[21]，盡管在目前的臨床數據中顯示出了益處[22]，其療效仍然是有限的。2020 年 11 月 20 日，世界衛(wèi)生組織(WHO)于英國醫(yī)學雜志 BMJ 更新了關于新冠肺炎治療藥物指南[23]，指出無論病情輕重，指南均不推薦新冠肺炎住院患者使用瑞德西韋，確證瑞德西韋不是新冠肺炎最優(yōu)選藥物，但考慮其存在多種適應證，構建其新的遞送系統，對開發(fā)其新的適應證提高療效仍然會有重要意義。