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    瑞德西韋對(duì)狂犬病病毒的體外抑制作用研究

    2022-12-28 02:53:54遲瑛琳劉錚然劉淑清朱武洋
    關(guān)鍵詞:西韋瑞德滴度

    遲瑛琳,劉錚然,謝 淵,劉淑清,朱武洋

    狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus, RABV)引起的一種動(dòng)物源性傳染病,感染后發(fā)病主要表現(xiàn)為恐風(fēng)、恐水、咽肌痙攣、進(jìn)行性癱瘓等特征。因狂犬病發(fā)病而報(bào)告的死亡人數(shù),一直位于我國(guó)法定傳染病報(bào)告死亡人數(shù)的前列,作為一種可防不可治的烈性傳染病,對(duì)人類(lèi)健康安全有著極大的威脅[1]。隨著抗病毒藥物的不斷創(chuàng)新與精進(jìn),許多病毒性疾病如乙肝、丙肝、艾滋病已得到有效控制,甚至埃博拉病毒的藥物治療也有積極的效果[2]。目前仍沒(méi)有有效治療狂犬病的療法和抗病毒藥物,狂犬病疫苗、免疫球蛋白、密爾沃基療法[3]均不能百分百阻斷病毒的感染,因此找到有效而合理的治療狂犬病的方法成為狂犬病防治的熱點(diǎn)之一。

    瑞德西韋是一種RNA依賴(lài)的RNA聚合酶(RdRp)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,其作為一種有活性的腺苷核苷酸類(lèi)似物,可在體內(nèi)代謝活化為三磷酸腺苷,在病毒RNA合成的過(guò)程中與RNA聚合酶結(jié)合,插入到正在合成的病毒RNA中從而終止病毒RNA的合成,使病毒失去致病毒力[4]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)瑞德西韋對(duì)嚴(yán)重急性呼吸綜合征及中東呼吸綜合征均有顯著的抗病毒活性,對(duì)新型冠狀病毒也具有一定的抗病毒效果[5]。因此,本實(shí)驗(yàn)以不同狂犬病病毒CVS-11及SC16體外感染BHK-21及N2a細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)?zāi)P停ㄟ^(guò)藥物與病毒直接作用、預(yù)防性用藥以及治療性用藥3種給藥方式,分析瑞德西韋對(duì)不同狂犬病病毒是否具有阻斷病毒吸附、抑制病毒復(fù)制或直接殺傷的作用,從而為尋找有效的狂犬病治療藥物提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材 料

    1.1.1 細(xì)胞和病毒 倉(cāng)鼠腎細(xì)胞的克隆細(xì)胞BHK-21,小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞N2a由本實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液:用Dulbecco’s MEM,GIBCO BRL配制,含100 mL/L小牛血清,10 mL/L雙抗。細(xì)胞維持液:用Dulbecco’s MEM,GIBCO BRL配制,含20 mL/L小牛血清。CVS-11 是一株經(jīng)典的狂犬病病毒,為CVS毒株經(jīng)BHK-21 細(xì)胞適應(yīng)后的固定毒株,具有較強(qiáng)的神經(jīng)毒性,在快速熒光灶抑制試驗(yàn)中被用作標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株使用,由本實(shí)驗(yàn)室保存;狂犬病毒街毒株SC16分離于2016年四川1只狂犬病病死犬腦內(nèi),經(jīng)過(guò)鼠腦傳代、適應(yīng)N2a細(xì)胞生長(zhǎng)并獲得較高的滴度,由本實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.1.2 主要試劑和儀器 瑞德西韋購(gòu)買(mǎi)自MCE公司,批號(hào)HY-104077。瑞德西韋儲(chǔ)存液:將瑞德西韋用DMSO(二硝基亞砜)配成100 mmol/L的儲(chǔ)備液,-80 ℃保存?zhèn)溆谩MEM 高糖培養(yǎng)液、胰酶、雙抗、胎牛血清均購(gòu)自GIBCO公司;抗狂犬病病毒核蛋白熒光抗體,購(gòu)自美國(guó)Fujirebio Diagnostics公司;GoTaq probe-1-Step RT-qPCR mix 購(gòu)自promega公司。細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(Counting Kit,CCK8)購(gòu)自東仁化學(xué)科(上海)技有限公司。倒置顯微鏡為日本奧林巴斯CXX4I型;熒光顯微鏡為日本奧林巴斯IX51型,Realtime-PCR 儀器為ABI QuantStudio 5,酶標(biāo)儀為FLUOstar Omega 415-2683,細(xì)胞計(jì)數(shù)儀,購(gòu)自美國(guó)ORFLO Technologies公司。

    1.2 方 法

    1.2.1 藥物對(duì)細(xì)胞活力的毒性測(cè)定 在BHK-21和N2a細(xì)胞上加入終濃度為0(DMSO對(duì)照組)、100 μmol/L、200 μmol/L、500 μmol/L、1 000 μmol/L、2 000 μmol/L的瑞德西韋處理細(xì)胞4 h,同時(shí)設(shè)置CCK-8的對(duì)照,按照 CCK-8檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值即為OD值,通過(guò)運(yùn)用OD值計(jì)算細(xì)胞存活率從而表示藥物對(duì)細(xì)胞活力的影響,公式為:[(實(shí)驗(yàn)孔-空白孔)/(對(duì)照孔-空白孔)]×100%。

    1.2.2 病毒滴度測(cè)定 將BHK-21或N2a細(xì)胞按細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所得的按一定比例鋪在96孔板中在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長(zhǎng)滿(mǎn)單層細(xì)胞。依次將待測(cè)病毒液CVS-11及SC16分別進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)瑥?0-1到10-12,將稀釋好的病毒液依次加入鋪好細(xì)胞的96孔板內(nèi),每孔100 μL病毒液,每個(gè)稀釋度設(shè)8個(gè)重復(fù)孔。將病毒液與細(xì)胞均勻混合后放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱,培養(yǎng)48 h后采用直接免疫熒光法進(jìn)行熒光灶讀數(shù)[6],最后用Reed-Muench方法計(jì)算病毒滴度[7]。

    1.2.3 TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)RABV滴度的測(cè)定 使用不同劑量的瑞德西韋按照上述要求處理不同狂犬病病毒感染的N2a細(xì)胞,收集病毒感染48 h的細(xì)胞,按照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit試劑盒要求提取總RNA,測(cè)定RNA 濃度。根據(jù)GenBank上公布RV的N蛋白基因序列,利用Premiers 5.0設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物和TaqMan探針,引物和探針由擎科生物科技有限公司合成,引物探針序列標(biāo)準(zhǔn)品制備方法等見(jiàn)參考文獻(xiàn)[8]。參照GoTaq○RProbe 1-Step RT-qPCR System試劑盒說(shuō)明書(shū)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,利用狂犬病病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)N2a細(xì)胞中狂犬病病毒 mRNA水平。

    1.2.4 瑞德西韋對(duì)狂犬病病毒吸附的阻斷作用 將N2a細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞按照 5×105/孔密度接種于 12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,Agostini ML等人研究發(fā)現(xiàn)瑞德西韋在非典型肺炎病毒和中東呼吸綜合癥病毒感染前及感染后2 h之間有最佳抑制病毒效果[9],故在N2a細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞中分別加入終濃度為100 μmol/L、200 μmol/L、500 μmol/L、1 000 μmol/L瑞德西韋預(yù)孵育細(xì)胞2 h,加入MOI(Multiplicity of Infection)=5的CVS-11在細(xì)胞上吸附1 h,去除未吸附的病毒和藥物,加入培養(yǎng)液,37 ℃培養(yǎng)48 h。采用直接免疫熒光法進(jìn)行熒光灶讀數(shù),確定瑞德西韋的有效抑制濃度。由于之前已有文獻(xiàn)報(bào)道法匹拉韋有一定的抗狂犬病病毒的效果[10],因此本實(shí)驗(yàn)中加入相應(yīng)濃度的法匹拉韋做為陽(yáng)性對(duì)照藥物,并設(shè)病毒單獨(dú)感染的DMSO對(duì)照組,每組3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。為探索瑞德西韋阻斷狂犬病病毒吸附的效果,將N2a細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞按照5×105/孔密度接種于 12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,使用最佳抑制濃度的瑞德西韋分別預(yù)孵育N2a細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞2、4、6 h,加入MOI=5的CVS-11在細(xì)胞上吸附1 h,去除未吸附的病毒和藥物,加入培養(yǎng)液,37 ℃培養(yǎng)48 h。采用直接免疫熒光法進(jìn)行熒光灶讀數(shù),確定瑞德西韋阻斷狂犬病病毒吸附的最佳時(shí)間,每組3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。為探索瑞德西韋對(duì)不同狂犬病病毒的預(yù)防性作用,本實(shí)驗(yàn)使用最佳抑制濃度的瑞德西韋采用最佳時(shí)間預(yù)孵育N2a細(xì)胞,加入MOI=5的街毒株SC16感染N2a細(xì)胞上吸附1 h,去除未吸附的病毒和藥物,加入培養(yǎng)液,37 ℃培養(yǎng)48 h。采用直接免疫熒光法進(jìn)行熒光灶讀數(shù)。設(shè)病毒單獨(dú)感染的DMSO對(duì)照組;同時(shí)采用TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)瑞德西韋對(duì)CVS-11及SC16 mRNA 水平的影響,確定瑞德西韋對(duì)不同狂犬病病毒的預(yù)防性作用,每組3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2.5 瑞德西韋對(duì)狂犬病毒復(fù)制的抑制作用 將N2a細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞按照 5×105/孔密度接種于 12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,以MOI=5的CVS-11分別吸附N2a細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞1 h后,棄去上清用DMEM洗滌3次,分別加入終濃度為100 μmol/L、200 μmol/L、500 μmol/L、1 000 μmol/L瑞德西韋處理細(xì)胞48 h后,采用直接免疫熒光法進(jìn)行熒光灶讀數(shù),確定瑞德西韋的有效抑制濃度。并加入相應(yīng)濃度的法匹拉韋做陽(yáng)性對(duì)照藥物,并設(shè)病毒單獨(dú)感染的DMSO對(duì)照組,每組3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)。為探索瑞德西韋對(duì)狂犬病毒抑制的有效時(shí)間,分別在CVS-11感染N2a細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞1、2、3、4、6 h后,加入最適抑制濃度的瑞德西韋培養(yǎng)48 h后,采用直接免疫熒光法進(jìn)行熒光灶讀數(shù),每組3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。為探索瑞德西韋對(duì)不同狂犬病病毒的抑制作用,將街毒株SC16感染N2a細(xì)胞,加入相應(yīng)濃度的瑞德西韋培養(yǎng)48 h后,采用直接免疫熒光法進(jìn)行熒光灶讀數(shù);同時(shí)采用TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)瑞德西韋對(duì)CVS-11及SC16 mRNA 水平的影響,確定瑞德西韋對(duì)不同狂犬病病毒的抑制作用,每組3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2.6 瑞德西韋對(duì)病毒的直接殺傷作用 將N2a細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞按照 5×105/孔密度接種于 12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,將500 μmol/L的瑞德西韋與MOI=5的CVS-11和SC16毒株混合孵育1 h[9],將藥物與病毒的混合液分別處理N2a和BHK-21細(xì)胞1 h,去除未吸附的病毒和藥物,加入培養(yǎng)液,37 ℃培養(yǎng)48 h后,采用直接免疫熒光法進(jìn)行熒光灶讀數(shù),確定瑞德西韋直接殺滅狂犬病病毒的濃度。

    2 結(jié) 果

    2.1 瑞德西韋對(duì)BHK-21及N2a細(xì)胞的毒性作用 根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞存活率計(jì)算公式所得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1)表明,瑞德西韋在100 μmol/L、200 μmol/L、500 μmol/L內(nèi)未見(jiàn)明顯的細(xì)胞毒性作用,但在1 000 μmol/L和2 000 μmol/L的作用后,細(xì)胞折光性變差,細(xì)胞變圓,脫落,有顯著的細(xì)胞毒性作用。藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用在500 μmol/L之后隨著藥物濃度的增加,細(xì)胞存活率降低。故本實(shí)驗(yàn)選擇的安全作用濃度為500 μmol/L。

    注:*為1 000 μmol/L瑞德西韋與0 μmol/L瑞德西韋相比,對(duì)N2a細(xì)胞(A)或BHK-21細(xì)胞(B)存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),**為2 000 μmol/L瑞德西韋與0 μmol/L瑞德西韋相比,對(duì)N2a細(xì)胞(A)或BHK-21細(xì)胞(B)存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。圖1 不同濃度瑞德西韋對(duì)N2a細(xì)胞(A)BHK-21細(xì)胞(B)存活率的影響Fig.1 Effects of different concentrations of remdesivir on cell viability in N2a(A)and BHK-21(B)

    2.2 病毒的滴度測(cè)定 按Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)感染量(TCID50),經(jīng)Reed-Muench方法計(jì)算,在BHK-21細(xì)胞系感染中CVS-11的TCID50為106.56/0.1 mL,SC16的TCID50為104.19/0.1 mL,在N2a細(xì)胞系感染中CVS-11的TCID50為105.87/0.1 mL,SC16的TCID50為105.69/0.1 mL 并用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定細(xì)胞數(shù)量根據(jù)MOI=病毒滴度/細(xì)胞數(shù)量計(jì)算。本實(shí)驗(yàn)確立CVS-11及SC16感染兩種細(xì)胞系的MOI值為5。

    2.3 瑞德西韋抑制狂犬病病毒的吸附作用 通過(guò)不同濃度100 μmol/L、200 μmol/L、500 μmol/L、1 000 μmol/L的瑞德西韋預(yù)處理N2a細(xì)胞后,與CVS-11病毒感染組相比,500 μmol/L和1 000 μmol/L的瑞德西韋處理組N2a細(xì)胞綠色熒光標(biāo)記的病毒粒子減少(t500=43.30,t1000=60.98,均P<0.01),表明500 μmol/L及以上濃度瑞德西韋能夠抑制CVS-11的感染;與相應(yīng)濃度的T705陽(yáng)性對(duì)照組相比,瑞德西韋處理N2a細(xì)胞中CVS-11病毒粒子的熒光強(qiáng)度降低(t=41.86,P<0.01)(圖2);不同濃度100 μmol/L、200 μmol/L、500 μmol/L、1 000 μmol/L的瑞德西韋預(yù)處理BHK-21細(xì)胞后與上述結(jié)果基本趨于一致(圖3)。介于1 000 μmol/L的瑞德西韋有明顯的細(xì)胞毒性,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用500 μmol/L為最適藥物濃度。

    注:A. DMSO(CVS-11單獨(dú)感染)組, B. 500 μmol/L瑞德西韋處理組,C. 1 000 μmol/L T705處理組,D為不同濃度瑞德西韋預(yù)處理N2a細(xì)胞對(duì)CVS-11病毒滴度的影響,500 μmol/L瑞德西韋與DMSO組相比,對(duì)CVS-11病毒感染N2a細(xì)胞的滴度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,*P<0.05;1 000 μmol/L瑞德西韋與DMSO組相比,對(duì)CVS-11病毒感染N2a細(xì)胞的水平極差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,**P<0.01。A、B、C放大倍數(shù):100×圖2 不同濃度瑞德西韋預(yù)處理N2a細(xì)胞對(duì)CVS-11病毒吸附的影響Fig.2 Effects of remdesivir at different concentrations on CVS-11 in N2a cells

    注:A. DMSO(CVS-11單獨(dú)感染)組, B. 500 μmol/L瑞德西韋處理組,C. 1 000 μmol/L T705處理組,D為不同濃度瑞德西韋預(yù)處理BHK-21細(xì)胞對(duì)CVS-11病毒滴度的影響,500 μmol/L瑞德西韋與DMSO組相比,對(duì)CVS-11病毒感染BHK-21細(xì)胞的滴度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,*P<0.05;1 000 μmol/L瑞德西韋與DMSO組相比,對(duì)CVS-11病毒感染BHK-21細(xì)胞的水平極差異,**P<0.01。A、B、C放大倍數(shù):100×圖3 不同濃度瑞德西韋預(yù)處理BHK-21細(xì)胞對(duì)CVS-11病毒滴度的影響Fig.3 Effects of pretreatment with remdesivir at different concentrations on CVS-11 titer in BHK-21 cells

    通過(guò)500 μmol/L瑞德西韋在不同時(shí)間2、4、6 h預(yù)處理N2a細(xì)胞后,與CVS-11病毒感染組相比,瑞德西韋預(yù)孵育N2a細(xì)胞2 h后綠色熒光標(biāo)記的CVS-11病毒粒子減少(t=96.38,P<0.01),隨著預(yù)加藥時(shí)間的延長(zhǎng),4 h和6 h預(yù)處理組相較之2 h預(yù)處理組對(duì)病毒滴度抑制作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t4 h=1.08,t6 h=7.62,均P>0.05)(圖4),瑞德西韋在不同時(shí)間預(yù)處理BHK-21細(xì)胞后與上述結(jié)果基本趨于一致(圖5),因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)預(yù)處理N2a細(xì)胞選擇最短預(yù)處理時(shí)間2 h。

    圖4 瑞德西韋預(yù)處理N2a細(xì)胞不同處理時(shí)間對(duì)CVS-11病毒滴度的影響Fig.4 Effects of remdesivir with different treatment times on CVS-11 in N2a cells

    通過(guò)與CVS-11和街毒株SC16病毒感染組相比,500 μmol/L瑞德西韋預(yù)處理N2a細(xì)胞2 h后病毒滴度降低(tcos-11=75.48,tsc16=47.83,均P<0.01)(圖6);通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:與CVS-11病毒感染組或SC16病毒感染組相比,500 μmol/L瑞德西韋預(yù)處理N2a細(xì)胞2 h后病毒mRNA拷貝數(shù)均降低(tcvs-11=183.82,tsc16=82.60,均P<0.01)(圖7),提示瑞德西韋可以在體外有效抑制狂犬病病毒mRNA水平的表達(dá)。

    圖5 瑞德西韋預(yù)處理BHK-21細(xì)胞不同處理時(shí)間對(duì)CVS-11病毒滴度的影響Fig.5 Effects of remdesivir with different times on CVS-11 in BHK-21 cells

    圖6 瑞德西韋預(yù)處理N2a細(xì)胞對(duì)CVS-11/SC16毒株的影響Fig.6 Effects of remdesivir on CVS-11 or SC16 in N2a cells

    圖7 瑞德西韋預(yù)加藥對(duì)不同毒株mRNA水平的影響Fig.7 Effects of remdesivir on CVS-11/SC16 mRNA levels in N2a cells

    2.4 瑞德西韋體外抑制狂犬病病毒的復(fù)制 與CVS-11病毒感染組相比,不同濃度100 μmol/L、200 μmol/L、500 μmol/L、1 000 μmol/L的瑞德西韋處理N2a細(xì)胞后,500 μmol/L和1 000 μmol/L的瑞德西韋處理組病毒滴度降低(t500=85.11,t1000=100.52,均P<0.01),與相應(yīng)濃度的T705陽(yáng)性對(duì)照組相比,瑞德西韋處理N2a細(xì)胞中CVS-11病毒粒子的熒光強(qiáng)度也降低(t=61.15,P<0.01)(圖8),表明500 μmol/L及以上濃度瑞德西韋能夠有效抑制CVS-11的復(fù)制;不同濃度100 μmol/L、200 μmol/L、500 μmol/L、1 000 μmol/L的瑞德西韋處理BHK-21細(xì)胞后與上述結(jié)果基本一致(圖9)。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用500 μmol/L為最適藥物濃度。

    注:A. DMSO(CVS-11單獨(dú)感染)組, B. 500 μmol/L瑞德西韋處理組,C. 1000 μmol/L T705處理組,D為CVS-11感染后不同濃度瑞德西韋處理N2a細(xì)胞對(duì)病毒滴度的影響。*P<0.05,**P<0.01。A、B、C放大倍數(shù):100×圖8 CVS-11感染后不同濃度瑞德西韋處理N2a細(xì)胞對(duì)病毒滴度的影響Fig.8 Effects of remdesivir at different concentrations in N2a cells after CVS-11 infection

    注:A. DMSO(CVS-11單獨(dú)感染)組, B. 500 μmol/L瑞德西韋處理組,C. 1 000 μmol/L T705處理組,D為CVS-11感染后不同濃度瑞德西韋處理N2a細(xì)胞對(duì)病毒滴度的影響。500 μmol/L瑞德西韋與DMSO組相比,對(duì)CVS-11病毒感染BHK-21細(xì)胞的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,*P<0.05;1 000 μmol/L瑞德西韋與DMSO組相比,對(duì)CVS-11病毒感染BHK-21細(xì)胞的影響極差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,**P<0.01。A、B、C放大倍數(shù):100×圖9 CVS-11感染后不同濃度瑞德西韋處理BHK-21細(xì)胞對(duì)病毒滴度的影響Fig.9 Effects of remdesivir at different concentrations in BHK-21 cells after CVS-11 infection

    CVS-11病毒感染后分別在1、2、3、4、6 h加入瑞德西韋處理N2a細(xì)胞,與CVS-11病毒感染組相比,瑞德西韋在感染1、2、3、4 h后病毒滴度均下降(t1 h=44.89,t2 h=90.66,t3 h=68.07,t4 h=69.88,均P<0.01),CVS-11感染6h后加入瑞德西韋后病毒滴度有一定程度回升(t=5.09,P<0.05)(圖10),CVS-11病毒感染后分別在1~4 h加入瑞德西韋處理BHK-21細(xì)胞后與上述結(jié)果趨于一致(圖11)。提示CVS-11感染1~4 h內(nèi)加入瑞德西韋即有較好的抑制病毒復(fù)制的效果,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇狂犬病毒感染1 h后加入瑞德西韋處理細(xì)胞。

    圖10 CVS-11感染后不同時(shí)間瑞德西韋處理N2a細(xì)胞對(duì)病毒滴度的影響Fig.10 Effects of remdesivir treatment for different times in N2a cells after CVS-11 infection

    圖11 CVS-11感染后不同時(shí)間瑞德西韋處理BHK-21細(xì)胞對(duì)病毒滴度的影響Fig.11 Effects of remdesivir treatment for different times in BHK-21 cells after CVS-11 infection

    通過(guò)與CVS-11和街毒株SC16病毒感染組相比,500 μmol/L瑞德西韋處理N2a細(xì)胞后病毒滴度降低(tcvs-11=76.16,tsc16=90.12,均P<0.01)(圖12);通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:與CVS-11病毒感染組或SC16病毒感染組相比,500 μmol/L瑞德西韋處理N2a細(xì)胞后病毒mRNA拷貝數(shù)均降低(tcvs-11=32.55,tsc16=45.30,均P<0.01)(圖13)提示瑞德西韋可以在體外有效抑制狂犬病病毒mRNA水平的復(fù)制。

    圖12 CVS-11/SC16感染后瑞德西韋處理N2a細(xì)胞對(duì)病毒滴度的影響Fig.12 Effects of remdesivir in N2a cells after SC16 or CVS-11 infection

    圖13 不同毒株感染后瑞德西韋處理細(xì)胞對(duì)RABV mRNA水平的影響Fig.13 Effects of remdesivir on RABV mRNA levels in N2a cells after CVS-11/SC16 infection

    2.5 瑞德西韋體外直接殺傷狂犬病病毒的作用 通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)瑞德西韋對(duì)狂犬病病毒毒株CVS-11和SC16的影響,結(jié)果顯示:與CVS-11單獨(dú)感染組和SC16單獨(dú)感染組相比, 500 μmol/L瑞德西韋處理N2a細(xì)胞后CVS-11或SC16病毒含量均無(wú)明顯降低作用(圖14),表明瑞德西韋對(duì)不同狂犬病病毒均無(wú)直接殺傷作用。

    圖14 瑞德西韋和不同毒株直接作用后對(duì)病毒滴度的影響Fig.14 Direct killing effect of remdesivir on CVS-11/SC16

    3 討 論

    目前狂犬病在全球廣泛分布,除南極洲外,所有大陸均有人間狂犬病報(bào)告。進(jìn)入21世紀(jì)以后,每年約造成59 000人死亡[12],是致死人數(shù)最多的動(dòng)物源性傳染病。我國(guó)也是世界范圍內(nèi)疫情最為嚴(yán)重的疫區(qū)之一。由于抗病毒藥物的研制起步較晚,臨床上能有效地治療病毒性疾病的藥物十分匱乏,長(zhǎng)期以來(lái),無(wú)特異性的狂犬病病毒感染的治療方案。廣譜抗病毒藥物利巴韋林是一種鳥(niǎo)嘌呤核苷酸類(lèi)似物,在體外實(shí)驗(yàn)中利巴韋林濃度在6.3~50 μmol/L時(shí)有良好的抑制狂犬病病毒復(fù)制的效果[13]。但臨床研究表明,長(zhǎng)期服用利巴韋林會(huì)使白細(xì)胞水平降低,產(chǎn)生骨髓抑制等不良反應(yīng)[14]。法匹拉韋(T705)也是一種核苷類(lèi)似物的廣譜抗病毒藥物,它經(jīng)口服后會(huì)形成嘌呤類(lèi)似物會(huì)競(jìng)爭(zhēng)病毒的RNA聚合酶。T705的核苷三磷酸化合物還會(huì)插入病毒的RNA鏈中導(dǎo)致病毒的突變,從而發(fā)揮抑制病毒的效果[15]。但是T705用量較大,毒副作用較大,在臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)肝功能障礙的患者會(huì)出現(xiàn)血藥濃度增加和尿酸升高的情況[10],因此篩選高效低毒的抗病毒藥物是今后抗病毒研究熱點(diǎn)之一。

    瑞德西韋(remdesivir,GS-5734)是Gilead Sciences公司正在研發(fā)中的一個(gè)廣譜抗病毒藥物[16],作為核苷類(lèi)RNA 依賴(lài)的RNA 聚合酶(RdRp)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑[17-18],瑞德西韋在細(xì)胞水平上能有效抑制新型冠狀病毒[17-18]、冠狀病毒、丙肝病毒、人類(lèi)免疫缺陷病毒和埃博拉病毒等[13,16]。2020年Wit RD等人,也建立了恒河猴動(dòng)物模型進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)瑞德西韋能有效抑制中東呼吸綜合征冠狀病毒的增殖[19]。可見(jiàn)瑞德西韋在抗病毒的治療中具有極大的潛力,但目前為止,瑞德西韋在體外抑制狂犬病病毒的效果尚未明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用BHK-21和N2a兩種細(xì)胞系研究發(fā)現(xiàn),3種不同的給藥方式(方式一:預(yù)防給藥;方式二:治療給藥;方式三:直接殺傷)下瑞德西韋對(duì)不同狂犬病病毒的抑制作用存在著一定差異,預(yù)防性用藥及治療性用藥方式比藥物與病毒直接作用的方式更好;在這兩種抗病毒細(xì)胞模型中,瑞德西韋的體外抑制效果均優(yōu)于T705,并在使用劑量達(dá)到500 μmol/L的情況下,未發(fā)現(xiàn)明顯細(xì)胞損傷加重的情況。瑞德西韋通過(guò)進(jìn)入宿主細(xì)胞后代謝為具有藥理活性的三磷酸核苷(nucleoside triphosphate,NTP)[10,17],并通過(guò)摻入新生的病毒RNA轉(zhuǎn)錄物中導(dǎo)致其過(guò)早終止,進(jìn)而抑制了RdRp 催化的RNA合成,從而抑制了病毒的復(fù)制過(guò)程,最終實(shí)現(xiàn)抑制病毒的繁殖[5,18],因此我們推測(cè)瑞德西韋可能主要通過(guò)影響病毒吸附細(xì)胞表面或直接殺傷細(xì)胞, 以阻斷病毒的穿入,達(dá)到預(yù)防病毒感染的作用,也可以通過(guò)治療性用藥達(dá)到抑制病毒復(fù)制的效果。后續(xù)為了觀(guān)察瑞德西韋對(duì)不同狂犬病病毒的體外抑制效果,模擬更接近自然感染狀態(tài)下的真實(shí)情況,我們選擇了街毒株SC16在神經(jīng)元細(xì)胞系N2a上進(jìn)行進(jìn)一步的研究,結(jié)果顯示瑞德西韋能夠在街毒株感染時(shí)具有顯著的抑制效果,在一定程度上阻斷病毒吸附,抑制病毒的復(fù)制增殖,保護(hù)細(xì)胞不受病毒侵害;結(jié)果進(jìn)一步表明瑞德西韋應(yīng)用于狂犬病病毒體外抑制時(shí)有較好的預(yù)期效果。與此同時(shí),瑞德西韋的臨床前安全性試驗(yàn)顯示,瑞德西韋對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)很低,而且是非遺傳毒性[20-21]。其安全性高、毒副作用小,值得臨床進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

    狂犬病作為一種可防不可治的烈性傳染病,目前仍沒(méi)有有效的發(fā)病后治療藥物,本研究結(jié)果表明瑞德西韋對(duì)不同毒株的狂犬病病毒均有較為理想的抑制作用,是一種潛在的抗狂犬病病毒的備選藥物,為進(jìn)一步的研究使用抗病毒藥物對(duì)狂犬病病毒的治療研究提供了參考價(jià)值。

    利益沖突:無(wú)

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