青蒿琥酯和雙氫青蒿素對華支睪吸蟲所致小鼠肝纖維化的治療作用研究

湯憲時(shí)，梁幼生，許永良，吳瀟瀟，季文翔，仝德勝

華支睪吸蟲成蟲多寄生于宿主肝膽管內(nèi)，蟲體的機(jī)械性刺激和排泄分泌產(chǎn)物可導(dǎo)致宿主肝臟長期慢性損傷，引起肝內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤，激活肝星狀細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，引發(fā)宿主肝纖維化病變[7]。已有研究在各種華支睪吸蟲感染的動(dòng)物模型上觀察到華支睪吸蟲感染致肝纖維化和肝星狀細(xì)胞的激活[8-9]。華支睪吸蟲感染晚期可導(dǎo)致肝功能衰竭和門脈高壓，很可能與肝癌和膽管癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增高相關(guān)[10-12]。因此早期有效地抑制和逆轉(zhuǎn)肝纖維化對華支睪吸蟲病臨床治療有重要意義。

青蒿琥酯(artesunate，ART)和雙氫青蒿素(dihydroartemisinin，DHA)是具有倍半萜結(jié)構(gòu)的青蒿素的衍生物，不僅是高效抗瘧藥[13]，而且具有抗纖維化作用。研究表明，青蒿琥酯能抑制肝星狀細(xì)胞增殖，對四氯化碳致大鼠肝纖維化、大鼠免疫性肝纖維化以及日本血吸蟲誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化具有拮抗作用[14-16]。雙氫青蒿素能夠改善膽管結(jié)扎導(dǎo)致的大鼠和小鼠肝纖維化病理改變[17-18],也能夠緩解四氯化碳導(dǎo)致的纖維化肝臟門脈高壓[19]。本研究在小鼠華支睪吸蟲病模型基礎(chǔ)上，觀察、評估兩種青蒿素衍生物對華支睪吸蟲所致肝纖維化的治療作用，為探索華支睪吸蟲病藥物治療方法和拓展青蒿素臨床應(yīng)用提供思路。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及麥穗魚 SPF級BALB/c小鼠(6周齡)購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于江蘇省血吸蟲病防治研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物的飼養(yǎng)及取材均遵守《江蘇省寄生蟲病研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》。含華支睪吸蟲囊蚴的麥穗魚捕撈于江蘇省徐州市睢寧縣野外淡水環(huán)境。

1.1.2 主要儀器及試劑 ND-2L型球磨機(jī)(南京南大天尊電子有限公司)；JC301攪拌器(浙江蘇泊爾股份有限公司)；80目標(biāo)準(zhǔn)篩(河北海吉金屬絲網(wǎng)制造有限公司)；組織切片機(jī)(北京軒泰儀公司)；切片刀(德國Leica公司)；Nanodrop 2000 熒光分光光度計(jì)(美國Thermo Fisher Scientific公司)；PCR儀(德國Eppendorf公司)；LightCycler480熒光定量PCR儀(美國BD公司)；SpectraMax i3x多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)；恒溫箱(北京樂普納科技有限公司)；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；AU680全自動(dòng)生化分析儀(美國Beckman公司)。青蒿琥酯(桂林南藥股份有限公司)；雙氫青蒿素(重慶華立武陵山制藥有限公司)；聚氧乙烯蓖麻油(美國Sigma公司)；吡喹酮(美國Sigma公司)；氯化鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；胃蛋白酶(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；鹽酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；多聚甲醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；石蠟(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司)；無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；二甲苯(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；正丁醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；HE染色試劑盒(索萊寶科技有限公司)；Masson染色試劑盒(索萊寶科技有限公司)；Trizol試劑(南京諾唯贊生物科技有限公司)；HiScript○R兩步法qRT-PCR試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)；AceQ○R通用型高特異性染料法定量PCR檢測試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)；RT-PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)；BCA試劑盒(碧云天生物科技有限公司)；脫脂奶粉(碧云天生物科技有限公司)；Tris(碧云天生物科技有限公司)；甘氨酸(碧云天生物科技有限公司)；SDS(碧云天生物科技有限公司)；SDS-PAGE預(yù)制膠(碧云天生物科技有限公司)；α-SMA一抗(英國Abcam公司)；Collagen Ⅰ一抗(美國Affinity Biosciences公司)；Collagen Ⅲ一抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；GAPDH一抗(武漢愛博泰克生物科技有限公司)；HRP 羊抗兔二抗(碧云天生物科技有限公司)；HRP羊抗鼠二抗(碧云天生物科技有限公司)；HRP化學(xué)發(fā)光液(美國Affinity Biosciences公司)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒(上海復(fù)星診斷科技有限公司)；堿性磷酸酶測定試劑盒(上海復(fù)星診斷科技有限公司)；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒(上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 華支睪吸蟲囊蚴收集 清洗數(shù)條麥穗魚，刮鱗，取肌肉組織，用攪拌器打碎，置于2 000 mL燒瓶中。配制胃蛋白酶消化液(NaCl 12 g，胃蛋白酶10 g，加入單蒸水溶解定容至1 000 mL，用鹽酸調(diào)pH值至 2.0)。向燒瓶中加入胃蛋白酶消化液1 000 mL，攪拌均勻，37 ℃恒溫箱中消化5 h，利用磁力攪拌器幫助消化。消化處理后，通過80目篩網(wǎng)過濾至1 000 mL量杯中，加生理鹽水至滿，靜置1 h，去上清，重復(fù)上述步驟3次，達(dá)到純化效果，收集沉淀物。顯微鏡下觀察、挑取、計(jì)數(shù)華支睪吸蟲囊蚴，保存于4 ℃生理鹽水中，當(dāng)天使用。

1.2.2 華支睪吸蟲病小鼠模型建立 BALB/c小鼠10只，雄性，6周齡，體重(20±0.5) g。小鼠飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組5只。實(shí)驗(yàn)組小鼠每只經(jīng)口灌胃感染約30個(gè)華支睪吸蟲囊蚴，對照組小鼠以生理鹽水灌胃。飼養(yǎng)30 d后，鏡下查感染囊蚴小鼠的糞便蟲卵,將蟲卵陽性的小鼠麻醉處死，留取肝組織，一部分置于-80 ℃冰箱保存，用于提取小鼠肝臟總蛋白質(zhì)和Western blot檢測，一部分置于4%多聚甲醛固定，用于HE和Masson染色，評估實(shí)驗(yàn)組小鼠肝纖維化程度以及模型是否成功。

1.2.3 藥物治療實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 6周齡雄性BALB/c小鼠35只，每只經(jīng)口灌胃感染約30個(gè)華支睪吸蟲囊蚴，飼養(yǎng)30 d后，鏡下查小鼠糞便蟲卵，將蟲卵陽性的小鼠隨機(jī)分為7組，分別為青蒿琥酯組(ART組)、氯化鈉組(NaCl組)、吡喹酮組(PZQ組)、(吡喹酮+青蒿琥酯)組[(PZQ+ART)組]、雙氫青蒿素組(DHA組)、聚氧乙烯蓖麻油組(EL組)、(吡喹酮+雙氫青蒿素)組[(PZQ+DHA)組]，每組5只,見表1。各組小鼠于室溫20～25 ℃下飼養(yǎng)，相對濕度約60%，光照每12 h明暗交替，小鼠自由飲食。給藥結(jié)束后，各組小鼠麻醉后眼球采血處死，無菌留取肝組織，置于-80 ℃冰箱保存，用于提取小鼠肝臟的總RNA和蛋白質(zhì)。

表1 藥物治療動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組Tab.1 Animal groupings according to different drug treatments

1.2.4 蘇木素-伊紅(HE)和Masson三色染色 小鼠解剖時(shí)快速將形態(tài)完好的肝組織放入4 %多聚甲醛固定液中4 ℃固定，1周后進(jìn)行肝臟組織脫水透明、石蠟包埋切片，分別按照HE和Masson染色試劑盒說明書進(jìn)行染色操作，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肝組織病理變化和膠原增生情況。

3.合理的收入是影響員工幸福感的基本因子。有實(shí)驗(yàn)研究表明，一個(gè)國家中最富有的階層不一定是最幸福的階層。也就是說，收入水平與幸福感之間并不是直線關(guān)系，而是曲線關(guān)系。通常來說，當(dāng)一個(gè)人對最基本的溫飽問題都得不到滿足的時(shí)候，那么他不可能感到幸福。因此，一個(gè)人在基本需求得到滿足之前，會(huì)因?yàn)槭杖氲闹鸩教岣?，其幸福感也?huì)相對得到相應(yīng)的提升。相反，當(dāng)一個(gè)人的基本需求得到滿足，收入的提高卻并沒有給他帶來更大的幸福感，有成衰減的態(tài)勢，并且工資薪水越高，越明顯，有時(shí)甚至可以忽略不計(jì)。

1.2.5 肝組織α-SMA、TGF-β、Col I、Col III mRNA表達(dá)檢測 取100 mg小鼠肝臟組織，按試劑說明書以Trizol法提取肝臟總RNA，用Nanodrop 2000 紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度，去除其中基因組DNA后，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。運(yùn)用Oligo6軟件設(shè)計(jì)通過熒光定量PCR反應(yīng)擴(kuò)增目標(biāo)基因CollagenⅠ(ColI)、CollagenIII(ColIII)、TGF-β、α-SMA和管家基因β-actin的引物(表2)。反應(yīng)體系(20 μL)為： cDNA 1 μL， 2×預(yù)混液10 μL，上、下游引物濃度10 μmol/L, 各0.4 μL，去RNA酶水8.2 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。以ΔΔCT法相對定量各基因mRNA表達(dá)，并進(jìn)行相對量的計(jì)算和分析。

1.2.6 肝組織α-SMA、Col I、Col III蛋白表達(dá)檢測 取20～40 mg解凍的小鼠肝臟組織，放入4 ℃ RIPA裂解液中研磨，冰上裂解2 h，離心取上清，為可溶性肝臟蛋白，以BCA法測定蛋白濃度。按照Western Blot操作步驟依次進(jìn)行蛋白變性、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，4 ℃管家基因GAPDH和目標(biāo)蛋白α-SMA、Col I、Col III抗體孵育12 h、二抗孵育、化學(xué)發(fā)光、曝光拍照。使用Image J軟件標(biāo)示各蛋白條帶灰度值，計(jì)算各基因蛋白表達(dá)量。以GAPDH蛋白表達(dá)量為基準(zhǔn)，比較各組小鼠肝臟各目標(biāo)基因的相對蛋白表達(dá)。

表2 基因表達(dá)檢測引物序列Tab.2 Sequences of primers for gene expression detection

1.2.6 肝功能檢測 采集各組小鼠眼球靜脈血1 mL，37 ℃恒溫箱中靜置1 h，分離血清。分別選擇丙氨酸底物法、天門冬氨酸底物法和NPP底物-AMP緩沖液法檢測小鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和堿性磷酸酶(ALP)含量，嚴(yán)格遵循各試劑盒說明書開展上機(jī)檢測。

2 結(jié) 果

2.1 華支睪吸蟲感染小鼠肝纖維化模型建立

2.1.1 染色結(jié)果 HE染色(圖1a)顯示，未感染華支睪吸蟲小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，輪廓清晰，肝細(xì)胞大小均一，染色均勻，呈輻射狀排列在中央靜脈周圍，無變性壞死，匯管區(qū)無異常。感染組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)遭到破壞，紊亂，肝索結(jié)構(gòu)消失，中央靜脈充血明顯，周圍的肝細(xì)胞出現(xiàn)變性壞死，大量炎性細(xì)胞浸潤，匯管區(qū)周圍出現(xiàn)大量膠原纖維，內(nèi)部可見蟲卵(圖1b、c)，Masson染色(圖1d)顯示匯管區(qū)肝組織中纖維化明顯，圍繞蟲卵沉積排列。

注：a為未感染組(HE，100×)；b為感染組(HE，100×)；c為感染組(HE，400×)；d為感染組(Masson，400×)。圖1 感染華支睪吸蟲小鼠肝組織病理學(xué)改變和膠原增生情況Fig.1 Pathological changes and collagen hyperplasia of liver tissue in mice infected with Clonorchis sinensis

2.1.2 Western Blot結(jié)果 感染組小鼠肝臟Col III表達(dá)量(1.26±0.01)高于未感染組(0.75±0.14)(t=2.01,P<0.05)，而感染組的Col I(0.54±0.17)和α-SMA(0.49±0.007)表達(dá)量與未感染組(0.59±0.18、0.78±0.2)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

注：與未感染組比較，*P<0.05圖2 感染和未感染華支睪吸蟲小鼠肝組織Col I、Col III、α-SMA蛋白表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of Col I, Col III and α-SMA in liver tissues in mice with or without Clonorchis sinensis infection

2.2 小鼠肝組織ColI、α-SMA、TGF-β、ColIII基因mRNA表達(dá)水平 熒光定量PCR結(jié)果(圖3)顯示，接受ART治療的小鼠，各組間(NaCl組、ART組、PZQ組、PZQ+ART組)ColI(1.23±0.84、9.4±11.17、0.84±0.41、0.59±0.41)、α-SMA(3.17±2.33、4.68±2.93、1.84±1.55、0.91±0.37)、TGF-β(3.09±3.27、18.89±19.63、8.39±13.81、1.82±0.74)、ColIII(1.09±0.53、4.89±4.45、0.67±0.31、0.65±0.28)基因mRNA表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(ColI(tNaClvsART=-4.32,tNaClvsPZQ=0.20,tNaClvsPZQ+ART=0.33,tARTvsPZQ=0.38,tARTvsPZQ+ART=0.39,tPZQvsPZQ+ART=0.30)、α-SMA(tNaClvsART=-0.28,tNaClvsPZQ=0.25,tNaClvsPZQ+ART=0.43,tARTvsPZQ=0.48,tARTvsPZQ+ART=0.64,tPZQvsPZQ+ART=0.29)、TGF-β(tNaClvsART=-2.15,tNaClvsPZQ=-0.72,tNaClvsPZQ+ART=0.17,tARTvsPZQ=0.26,tARTvsPZQ+ART=0.43,tPZQvsPZQ+ART=0.23)、ColIII(tNaClvsART=-3.16,tNaClvsPZQ=0.35,tNaClvsPZQ+ART=0.37,tARTvsPZQ=0.47,tARTvsPZQ+ART=0.47,tPZQvsPZQ+ART=0.03))。接受DHA治療的小鼠，PZQ+DHA組TGF-β基因mRNA表達(dá)水平低于DHA組(t=0.48,P<0.05)，PZQ+DHA組Col III基因mRNA表達(dá)水平高于PZQ組(t=-3.36,P<0.05)，除此之外，各組間(EL組、DHA組、PZQ組、PZQ+DHA組)ColI(1.85±2.49、5.1±4.35、0.84±0.41、3.12±1.97)、α-SMA(2.46±2.97、11.06±16.39、1.84±1.55、3.57±2.57)、TGF-β(4.59±5.57、9.57±6.23、8.39±13.81、2.81±1.8)、ColIII(1.61±1.8、3.72±2.84、0.67±0.31、2.81±1.43)基因mRNA表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(ColI(tELvsDHA=-0.58,tELvsPZQ=0.18,tELvsPZQ+DHA=-0.22,tDHAvsPZQ=0.43,tDHAvsPZQ+DHA=0.20,tPZQvsPZQ+DHA=-2.73)、α-SMA(tELvsDHA=-1.29,tELvsPZQ=0.09,tELvsPZQ+DHA=-0.16,tDHAvsPZQ=0.25,tDHAvsPZQ+DHA=0.20,tPZQvsPZQ+DHA=-0.55)、TGF-β(tELvsDHA=-0.39,tELvsPZQ=-0.30,tELvsPZQ+DHA=0.14,tDHAvsPZQ=0.08,tDHAvsPZQ+DHA=0.48,tPZQvsPZQ+DHA=0.20)、ColIII(tELvsDHA=-0.52,tELvsPZQ=0.23,tELvsPZQ+DHA=-0.29,tDHAvsPZQ=0.47,tDHAvsPZQ+DHA=0.14,tPZQvsPZQ+DHA=-3.36))。

注：與DHA組比較，*P<0.05(TGF-β);與PZQ組比較，*P<0.05(Col III)。圖3 感染華支睪吸蟲小鼠藥物治療后肝組織Col I、α-SMA、TGF-β、Col III基因mRNA表達(dá)水平Fig.3 mRNA expression levels of Col I, α-SMA, TGF-β and Col III genes in liver tissues in mice infected with Clonorchis sinensis after drug treatment

2.3 小鼠肝組織α-SMA、ColI、ColIII基因蛋白表達(dá)水平 Western Blot結(jié)果(圖4,5)顯示，接受ART治療的小鼠，ART組(0.32±0.04、0.81±0.09)和PZQ+ART組(0.16±0.01、1.02±0.18)的ColI、ColIII蛋白表達(dá)水平都低于NaCl組(1.54±0.38、2.24±0.35)(ColI(tNaClvsART=1.83,P<0.01；tNaClvsPZQ+ART=2.07,P<0.05)、ColIII(tNaClvsART=2.29,P<0.01；tNaClvsPZQ+ART=1.97,P<0.05)，PZQ+ART組的ColI表達(dá)水平低于ART組(t=1.98,P<0.05)。接受DHA治療的小鼠, DHA組(1.00±0.63、0.78±0.43)、PZQ+DHA組(0.66±0.22、1.13±0.26)α-SMA、Col I蛋白表達(dá)水平與EL組(0.62±0.19、1.22±0.18)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(α-SMA(tELvsDHA=-0.98,tELvsPZQ+DHA=-0.1)、Col I(tELvsDHA=1.19,tELvsPZQ+DHA=0.23)。

注：與NaCl組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖4 感染華支睪吸蟲小鼠ART治療后肝組織Col I、Col III蛋白表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of Col I and Col III proteins in liver tissue in mice infected with Clonorchis sinensis after ART treatment

圖5 感染華支睪吸蟲小鼠DHA治療后肝組織α-SMA、Col I蛋白表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of α-SMA and Col I proteins in liver tissue in mice infected with Clonorchis sinensis after DHA treatment

2.4 小鼠肝功能檢測 如圖6A所示，接受ART治療的小鼠，各組血清ALP(62.5±12.92、132±143.41、66.33±13.05、86.66±68.64 U/L)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(tNaClvsART=-2.68,tNaClvsPZQ=-0.14,tNaClvsPZQ+ART=-0.93,tARTvsPZQ=0.22,tARTvsPZQ+ART=0.15,tPZQvsPZQ+ART=-0.89)；PZQ組(58±8.71 U/L)血清ALT水平高于NaCl組(33.5±8.1 U/L)(tNaClvsPZQ=-1.51,P<0.05)，與ART組(74±39.94 U/L)和PZQ+ART組(43.66±11.01 U/L)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，NaCl組、ART組、PZQ+ART組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(tNaClvsART=-2.49,tNaClvsPZQ=-1.51,tNaClvsPZQ+ART=-0.62,tARTvsPZQ=0.2,tARTvsPZQ+ART=0.37,tPZQvsPZQ+ART=0.94)；ART組(197.75±8.84 U/L)和PZQ+ART組(234.66±42.54 U/L)血清AST水平與NaCl組(150±20.29 U/L)比較明顯升高(tNaClvsART=-1.17,P<0.01;tNaClvsPZQ+ART=-2.08,P<0.05)，PZQ組(195±31.22 U/L)與NaCl組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ART組和PZQ+ART組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(tNaClvsART=-1.17,tNaClvsPZQ=-1.1,tNaClvsPZQ+ART=-2.08,tARTvsPZQ=0.15,tARTvsPZQ+ART=-2.08,tPZQvsPZQ+ART=-0.73)。

如圖6B所示，接受DHA治療的小鼠，各組血清ALP(57±7.83、102.5±57、66.33±13.05、65±17.56 U/L)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(tELvsDHA=-2.9,tELvsPZQ=-0.59,tELvsPZQ+DHA=-0.51,tDHAvsPZQ=0.31,tDHAvsPZQ+DHA=0.32,tPZQvsPZQ+DHA=0.05)。PZQ+DHA組(29±12.98 U/L)血清ALT水平與EL組(107.25±54.26 U/L)和PZQ組(58±8.71 U/L)比較明顯降低(tELvsPZQ+DHA=0.72,tPZQvsPZQ+DHA=1.92,P均<0.05)，EL組、DHA組(53.5±36.2 U/L)和PZQ組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，PZQ+DHA組與DHA組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(tELvsDHA=0.49,tELvsPZQ=0.45,tELvsPZQ+DHA=0.72,tDHAvsPZQ=-0.06,tDHAvsPZQ+DHA=0.33,tPZQvsPZQ+DHA=1.92)。PZQ+DHA組(143±27.43 U/L)血清AST水平與EL組(207±42.48 U/L)比較顯著降低(tELvsPZQ+DHA=0.75,P<0.05)，與DHA組(165±17.98 U/L)和PZQ組(195±31.22 U/L)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，EL組、DHA組和PZQ組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(tELvsDHA=0.49,tELvsPZQ=0.14,tELvsPZQ+DHA=0.75,tDHAvsPZQ=-0.83,tDHAvsPZQ+DHA=0.61,tPZQvsPZQ+DHA=0.96)。

注：與NaCl或EL組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖6 感染華支睪吸蟲小鼠藥物治療后血清ALP、ALT、AST水平Fig.6 Serum ALP, ALT and AST levels in mice infected with Clonorchis sinensis after drug treatment

3 討 論

本研究選擇從野生麥穗魚肌肉獲取華支睪吸蟲囊蚴，因?yàn)樾⌒鸵吧~類如麥穗魚感染率高，感染程度重，囊蚴幾乎遍布魚體全身，但以肌肉內(nèi)為最多[20]。華支睪吸蟲囊蚴在終宿主消化道內(nèi)經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶作用，囊壁軟化，十二指腸內(nèi)的膽汁進(jìn)入囊內(nèi)，引發(fā)幼蟲破囊壁而出，童蟲經(jīng)總膽管進(jìn)入肝膽管發(fā)育為成蟲，成蟲蟲卵隨宿主膽汁進(jìn)入小腸，隨糞便排出體外[20]。本研究以30個(gè)囊蚴灌胃小鼠后約30 d在小鼠糞便中發(fā)現(xiàn)蟲卵。發(fā)現(xiàn)蟲卵后30 d，肝臟病理切片顯示肝內(nèi)膽管及周邊組織發(fā)生明顯病變，Masson染色顯示大量膠原纖維藍(lán)染，Western blot結(jié)果顯示Col III顯著增高，確認(rèn)肝臟病變部位周圍出現(xiàn)纖維組織增生，證明華支睪吸蟲所致肝纖維化小鼠模型建立成功，該模型的建立是后續(xù)青蒿素藥物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。

本研究選擇文獻(xiàn)報(bào)道過的用于小鼠肝纖維化治療的青蒿琥酯(ART)和雙氫青蒿素(DHA)劑量濃度和給藥方法。有研究按照60 mg/kg劑量每天腹腔注射ART，連續(xù)2周，較好地早期干預(yù)了日本血吸蟲感染所致小鼠肝纖維化[21]；有研究報(bào)道20 mg/kg的DHA灌胃，1 次/d，共12次，有效抑制膽總管結(jié)扎引起的小鼠肝纖維化和四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝纖維化[18-19]。由于本研究選擇在肝纖維化形成過程中全程用藥，連續(xù)用藥30 d，所以本研究降低文獻(xiàn)中ART劑量至20 mg/kg，與DHA相同，用于治療華支睪吸蟲所致小鼠肝纖維化。除此之外，本研究治療組中增加吡喹酮300 mg/kg連續(xù)2 d用藥殺滅肝膽管內(nèi)成蟲，去除繼續(xù)刺激肝臟導(dǎo)致肝纖維化的病因，作為輔助治療增強(qiáng)青蒿素抗纖維化的治療效果。

本研究在轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)水平顯示青蒿素抗華支睪吸蟲所致肝纖維化的有效性。雖然在轉(zhuǎn)錄水平與未治療組相比各ART用藥組纖維化相關(guān)分子指標(biāo)表達(dá)量沒有顯著差異，但在蛋白表達(dá)水平上，ART治療組肝臟膠原蛋白(Col I & III)表達(dá)顯著下降，并且經(jīng)PZQ殺蟲后ART治療可使膠原蛋白(Col I)水平進(jìn)一步顯著下降，證明ART在20 mg/kg劑量下對華支睪吸蟲所致肝纖維化有治療作用，合并殺蟲對ART抗纖維化有重要意義。但是各DHA用藥組纖維化分子指標(biāo)無論在轉(zhuǎn)錄還是蛋白表達(dá)水平都與對照組沒有顯著差異，證明DHA在20 mg/kg劑量下抗華支睪吸蟲所致肝纖維化作用有限，同時(shí)證明沒有青蒿素的抗纖維化作用，PZQ殺蟲本身不能對肝纖維化治療起到關(guān)鍵作用。本研究部分治療組q-PCR結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)差較大，提示組內(nèi)存在個(gè)體差異，這可能與灌胃后囊蚴在各小鼠體內(nèi)存活、發(fā)育為成蟲的數(shù)量以及成蟲發(fā)育程度不均一有關(guān)。ART治療組各纖維化分子指標(biāo)mRNA水平和蛋白表達(dá)量不一致的原因可能是各基因以相同水平轉(zhuǎn)錄后，ART藥物作用使蛋白翻譯水平降低，或者翻譯后由于藥物作用蛋白降解增加。

本研究探討ART和DHA連續(xù)用藥對小鼠肝功能的保護(hù)作用。與對照組相比，ART在20 mg/kg劑量下沒有明顯改善小鼠肝功能作用，相反會(huì)引起血清AST的顯著增高。DHA在20 mg/kg劑量下也沒有明顯改善小鼠肝功能，但合并PZQ可以顯著降低血清ALT和AST水平，起到一定程度的保肝作用。PZQ單獨(dú)使用對肝功能保護(hù)作用不明顯。肝功能檢測結(jié)果提示適當(dāng)降低ART劑量或給藥次數(shù)可能既保證其抗纖維化作用又減少其肝毒性，而加大DHA劑量可能會(huì)更好發(fā)揮其抗纖維化和保肝作用。后續(xù)研究將探索ART和DHA在不同劑量下對華支睪吸蟲所致肝纖維化和肝功能的作用，將更全面地了解兩種青蒿素衍生物的功能效用和治療作用，為進(jìn)一步探索青蒿素對肝臟的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

利益沖突：無