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    枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)涼山分離株18S rRNA基因部分序列測(cè)定與種系發(fā)育分析

    2020-10-17 06:56:46郝桂英何學(xué)謙
    關(guān)鍵詞:吸蟲(chóng)雙腔涼山州

    郝桂英,易 利,鄧 宇,何學(xué)謙

    (西昌學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,西昌 615013)

    枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)(Eurytrema cladorchis)隸屬于吸蟲(chóng)綱(Trematoda)、復(fù)殖目(Digenea)、雙腔科(Dicrocoeliidae)、闊盤(pán)屬(Eurytreama)[1],在牛、羊胰腺胰管內(nèi)均有寄生,但不如胰闊盤(pán)吸蟲(chóng)(E. pancreaticum)、腔闊盤(pán)吸蟲(chóng)(E.coelomaticum)常見(jiàn)[2]。牛、羊感染后可引起消瘦、生長(zhǎng)發(fā)育受阻、生產(chǎn)性能降低等,嚴(yán)重感染時(shí)可引起牛、羊死亡,給養(yǎng)殖業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。

    根據(jù)形態(tài)學(xué)特征可以對(duì)枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)進(jìn)行初步鑒定,但由于受宿主、環(huán)境等多種因素的影響,其準(zhǔn)確性、可靠性受到一定的限制。DNA技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于寄生蟲(chóng)的分類(lèi)學(xué)研究,其中DNA序列分析由于操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、提供的信息豐富,成為研究分類(lèi)學(xué)和種系發(fā)生學(xué)的有力工具之一[3]。

    核糖體DNA(rDNA)基因具有高度保守性,在所有細(xì)胞生物中都存在,進(jìn)化具有良好的時(shí)鐘性質(zhì),其序列中不同位置上變化的速度不同。18S rRNA 基因是真核生物染色體上編碼核糖體小亞基RNA的基因,該基因序列高度保守,常用來(lái)分析物種系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系[4]。目前已廣泛應(yīng)用于寄生蟲(chóng)分子分類(lèi)研究,如雞球蟲(chóng)[5]、兔球蟲(chóng)[6]、馬梨形蟲(chóng)[7]等。用于胰闊盤(pán)吸蟲(chóng)和腔闊盤(pán)吸蟲(chóng)分子分類(lèi)的靶基因主要有18S rRNA[8-10]、ITS2[10],已有胰闊盤(pán)吸蟲(chóng)核糖體DNA全序列的報(bào)道[11]。但關(guān)于枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)分子分類(lèi)的研究?jī)H見(jiàn)孟加拉共和國(guó)瘤牛源枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)18S rRNA和ITS2的報(bào)道[12]。

    鑒于此,本研究對(duì)采自四川省涼山彝族自治州的9個(gè)山羊源枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)樣品的18S rRNA基因部分序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列分析,并構(gòu)建枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)與其他吸蟲(chóng)的種系發(fā)育關(guān)系,從而明確18S rRNA基因能否成為枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)理想的遺傳標(biāo)記,為今后枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)的分子分類(lèi)和種群遺傳結(jié)構(gòu)研究奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 蟲(chóng)體的采集及保存枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)樣品采自四川省涼山彝族自治州自然感染的9只山羊胰管內(nèi),用滅菌生理鹽水清洗干凈,進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定后,分別編號(hào)為L(zhǎng)S01~LS09,于-20℃保存?zhèn)溆?。分離自同一只山羊的枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)為1個(gè)分離株。

    1.2 主要試劑蛋白酶K購(gòu)自Merck公司,2×TaqPCR Master Mix、DL2000 DNA marker、GreenView核酸染料、柱式DNA膠回收試劑盒等均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

    1.3 枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)蟲(chóng)體總DNA提取從冷凍保存的9個(gè)山羊源枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)樣品中分別隨機(jī)取出1條,用剪刀剪碎并研磨,加入SDS(1 μg/μL)裂解液和蛋白酶K(10 μg/μL),放入56℃水浴鍋中消化過(guò)夜,然后將消化好的蟲(chóng)體懸液用酚/氯仿法[13]提取蟲(chóng)體總DNA,保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)18S rRNA基因的擴(kuò)增及序列測(cè)定用Zheng等[9]報(bào)道的引物進(jìn)行枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)18S rRNA基因部分序列的擴(kuò)增。引物序列分別為18SP1:5'-GGCTCATTAAATCAGCTGGTT-3';18SP2:5'-ACGTTTTACTTCCTCT AAAT-3'。引物序列由上海杰李生物技術(shù)有限公司合成。

    PCR擴(kuò)增體系為50 μL:2×TaqPCR Master Mix 25 μL,引物18SP1、18SP2(10 pmol/L)各2 μL,模板DNA 2 μL,ddH2O 19 μL。同時(shí),以ddH2O作空白對(duì)照。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性40 s,55℃復(fù)性45 s,72℃延伸110 s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸6 min。反應(yīng)結(jié)束后分別取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)目的條帶的大小。各PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化后送上海杰李生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

    1.5 序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化分析檢索GenBank收錄的部分吸蟲(chóng)18S rRNA基因序列并下載(表1),然后用Clustal X 1.81軟件進(jìn)行序列比對(duì),MEGA 5.0軟件分析堿基組成、轉(zhuǎn)換/顛換比率,基于K2P模型計(jì)算遺傳距離。用DNAStar 中的MegAlign程序進(jìn)行序列同源性分析。用DnaSP 4.0軟件計(jì)算單倍型數(shù)(haplotypes,H)、核苷酸多樣性(Nucleotide diversity,Pi)、單倍型多樣性(Haplotypes diversity,Hd)和平均核苷酸差異(average number of nucleotide differences,K)。

    以豬帶絳蟲(chóng)(Taenia solium,DQ157224)作為系統(tǒng)發(fā)育分析的外群,采用K2P模型,用MEGA 5.0軟件構(gòu)建NJ樹(shù),并進(jìn)行重復(fù)1000次的自舉檢驗(yàn)(bootstrap test)。

    表1 部分吸蟲(chóng)18S rRNA基因序列信息Table 1 Sequences information of 18S rRNA gene of different flukes

    2 結(jié)果與討論

    2.1 枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)18S rRNA基因的序列特征和同源性比較經(jīng)比對(duì)校正剔除多余序列后,本研究測(cè)得的9個(gè)枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)涼山州分離株的18S rRNA基因部分序列長(zhǎng)度均為1758 bp,A+T堿基的平均含量為47.8%,低于肉牛源胰闊盤(pán)吸蟲(chóng)齊齊哈爾分離株18S rRNA基因全序列(1996 bp)A+T堿基的平均含量(49%~49.1%)[11],也與斜睪亞目吸蟲(chóng)18S rRNA基因序列A+T堿基的平均含量(48.18%~49.23%[17])的結(jié)果不一致,這可能與序列長(zhǎng)度、宿主、地理位置等有關(guān)。9個(gè)測(cè)序序列均不存在堿基插入/缺失,其中保守位點(diǎn)1753個(gè),變異位點(diǎn)5個(gè)(簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)1個(gè)、單變異位點(diǎn)4個(gè))。核苷酸變異位點(diǎn)發(fā)生在密碼子的第三位(占60%)和第一位(占40%)。序列中顛換多于轉(zhuǎn)換,轉(zhuǎn)換/顛換(R)平均值為1.064,3個(gè)顛換(2個(gè)G-C、1個(gè)T-G)和2個(gè)轉(zhuǎn)換(C-T)。

    9個(gè)枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)涼山州分離株測(cè)序序列的核苷酸同源性為99.9%~100%,堿基變異率為0~0.1%。9個(gè)測(cè)序序列與已知枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)的同源性最高(99.7%~100%),與鹿前后盤(pán)吸蟲(chóng)的同源性最低(92.6%~92.7%),與胰闊盤(pán)吸蟲(chóng)的同源性為99.4%,與腔闊盤(pán)吸蟲(chóng)的同源性為99.1%~99.2%,與矛形雙腔吸蟲(chóng)的同源性為97.9%~98.0%,與東方雙腔吸蟲(chóng)、分葉短腺吸蟲(chóng)的同源性均為98.0%~98.1%,與愁體吸蟲(chóng)的同源性為98.5%~98.6%,與華支睪吸蟲(chóng)的同源性為93.9%~94.0%,與肝片吸蟲(chóng)、大片吸蟲(chóng)的同源性為92.9%~93.0%。9個(gè)測(cè)序序列與枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)、胰闊盤(pán)吸蟲(chóng)、腔闊盤(pán)吸蟲(chóng)的堿基差異分別為0~0.3%、0.6%、0.8%~0.9%,與愁體吸蟲(chóng)、分葉短腺吸蟲(chóng)、矛形雙腔吸蟲(chóng)、東方雙腔吸蟲(chóng)的差異分別為1.4%~1.5%、2.0%、2.0%~2.1%和2.0%,與其他學(xué)者的報(bào)道稍有差異。鄭亞?wèn)|等[8]報(bào)道腔闊盤(pán)吸蟲(chóng)18S rRNA基因部分序列與愁體吸蟲(chóng)、矛形雙腔吸蟲(chóng)的差異分別為1.75%、2.42%。安徽省和福建省腔闊盤(pán)吸蟲(chóng)和胰闊盤(pán)吸蟲(chóng)的18S rRNA基因序列分別有3個(gè)和4個(gè)堿基的差異[18]。巴西牛源的3個(gè)腔闊盤(pán)吸蟲(chóng)18S rRNA基因片段(528 bp)核苷酸同源性為100%,與腔闊盤(pán)吸蟲(chóng)中國(guó)分離株、胰闊盤(pán)吸蟲(chóng)中國(guó)分離株的同源性分別為99.8%和99.4%[19];5個(gè)肉牛源胰闊盤(pán)吸蟲(chóng)齊齊哈爾分離株的18S rRNA基因全序列(1996 bp)的堿基變異為0~0.2%[11]。因此,18S rRNA基因可以作為闊盤(pán)屬吸蟲(chóng)分子分類(lèi)理想的遺傳標(biāo)記基因。

    2.2 遺傳多樣性分析9個(gè)山羊源枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)18S rRNA基因序列共檢測(cè)到3個(gè)單倍型,遺傳距離為0~0.003,平均遺傳距離為0.001。與已知枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)參考序列的遺傳距離為0~0.001,與胰闊盤(pán)吸蟲(chóng)的遺傳距離為0.005~0.006,與腔闊盤(pán)吸蟲(chóng)的遺傳距離為0.008,與矛形雙腔吸蟲(chóng)、東方雙腔吸蟲(chóng)、分葉短腺吸蟲(chóng)的遺傳距離為0.019~0.020,與愁體吸蟲(chóng)的遺傳距離為0.014~0.015,與華支睪吸蟲(chóng)、肝片吸蟲(chóng)、大片吸蟲(chóng)、鹿前后盤(pán)吸蟲(chóng)的遺傳距離≥0.062。堿基序列總的單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)分別為0.417和0.00073,平均核苷酸差異(K)為1.278??梢?jiàn)枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)涼山州分離株的變異程度較低。

    2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析基于18S rRNA基因部分序列(1447 bp)構(gòu)建的NJ樹(shù)顯示:9個(gè)山羊源枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)涼山州分離株與瘤牛源枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)孟加拉共和國(guó)分離株親緣關(guān)系最近,聚在同一小支上;然后與牛源胰闊盤(pán)吸蟲(chóng)福建分離株、牛源腔闊盤(pán)吸蟲(chóng)福建分離株聚類(lèi)形成闊盤(pán)屬分支,再與愁體吸蟲(chóng)聚為一支,分葉短腺吸蟲(chóng)與雙腔屬的矛形雙腔吸蟲(chóng)、東方雙腔吸蟲(chóng)聚在另一小支上。從圖1可看出闊盤(pán)屬與愁體吸蟲(chóng)的親緣關(guān)系最近,而分葉短腺吸蟲(chóng)與雙腔屬的親緣關(guān)系更近。與其他學(xué)者報(bào)道的結(jié)果相似,F(xiàn)igueira等[19]基于18S rRNA基因片段(528 bp)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示3個(gè)巴西分離株與腔闊盤(pán)吸蟲(chóng)、胰闊盤(pán)吸蟲(chóng)和愁體吸蟲(chóng)聚在同一支上,且與腔闊盤(pán)吸蟲(chóng)和胰闊盤(pán)吸蟲(chóng)的親緣關(guān)系更近,與矛形雙腔吸蟲(chóng)和東方雙腔吸蟲(chóng)親緣關(guān)系遠(yuǎn),與大片吸蟲(chóng)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。常巧呈等[10]基于18S rRNA基因的部分序列(1200 bp)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)證實(shí)闊盤(pán)屬和雙腔屬的親緣關(guān)系密切。Su等[11]基于18S rRNA基因全序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示胰闊盤(pán)吸蟲(chóng)位于斜睪亞目雙腔科的分支上,與后睪亞目的親緣關(guān)系最近,與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類(lèi)結(jié)果一致。

    本研究對(duì)采集自涼山州山羊源的枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)18S rRNA基因的部分序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)涼山州枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)18S rRNA基因存在一定程度的遺傳變異,但遺傳變異較低。研究結(jié)果進(jìn)一步支持了18S rRNA基因是復(fù)殖目吸蟲(chóng)分類(lèi)鑒定的理想分子標(biāo)記。

    圖1 基于18S rRNA基因部分序列采用NJ法構(gòu)建的枝睪闊盤(pán)吸蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(支持率標(biāo)注在分支上)Fig.1 Phylogenetic tree of E. cladorchis based on partial sequences of 18S rRNA gene by NJ method(Numbers on the branches indicated the supporting value)

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