重組偽狂犬病病毒的研究進(jìn)展

張傳健，劉婭梅，侯繼波，王繼春

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫工程研究所，南京 210014；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014；3.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）屬于皰疹病毒科甲型皰疹病毒亞科水痘病毒屬，能感染豬、牛、羊和犬等多種家畜，引發(fā)偽狂犬病。豬偽狂犬病對我國養(yǎng)豬業(yè)危害極大，可造成母豬發(fā)熱、精神不振、進(jìn)而發(fā)生流產(chǎn)或產(chǎn)木乃伊胎、死胎和弱仔。仔豬高熱、厭食、呼吸困難、神經(jīng)癥狀、并伴隨著腹瀉，癥狀持續(xù)5～10 d，發(fā)病和死亡率可達(dá)100%。成年豬通常為隱性感染。研究者通過基因工程技術(shù)構(gòu)建的gE、gE/gI或TK/gE/gI基因缺失株能夠有效地抵抗強(qiáng)毒的攻擊，是構(gòu)建豬用重組疫苗的理想載體[1-2]。利用PRV基因缺失株為載體構(gòu)建表達(dá)異源抗原基因重組病毒，對宿主安全可靠，既能對偽狂犬病提供保護(hù)，又能產(chǎn)生針對異源保護(hù)性抗原的特異性免疫反應(yīng)，可達(dá)到一針多防的效果。本文從PRV基因組結(jié)構(gòu)與特征、重組PRV構(gòu)建方法、PRV缺失株的構(gòu)建與應(yīng)用以及PRV活載體疫苗的研究進(jìn)展四個(gè)方面進(jìn)行綜述。

1 PRV基因組結(jié)構(gòu)與特征

PRV為雙鏈DNA病毒，屬于甲型皰疹病毒亞科水痘病毒屬，其基因組約為150 kb，GC含量高達(dá)74%，可分為獨(dú)特長區(qū)段（unique long，UL）、內(nèi)部重復(fù)區(qū)段（internal repeat sequence， IRS）、獨(dú)特短區(qū)段（unique short，US）以及末端重復(fù)區(qū)（terminal repeat sequence，TRS）。隨著對PRV的基因組的解析，各基因的定位已基本明確。UL區(qū)被鑒定的基因包括gB、gC、gK、gH、主要衣殼蛋白基因、堿性核酸酶基因、核苷酸還原酶基因、胸腺激酶基因（thymidine kinase，TK）和DNA多聚酶基因等；IRS區(qū)的基因主要有立即早期基因和RSP40基因等；US區(qū)的基因包括gD、gE、gG、gI以及蛋白激酶基因等。PRV基因可編碼結(jié)構(gòu)蛋白、免疫調(diào)節(jié)蛋白、毒力相關(guān)蛋白、病毒的轉(zhuǎn)錄因子、病毒復(fù)制及釋放相關(guān)蛋白等70多種蛋白。其中包括16種囊膜蛋白，分別是11種糖蛋白（gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM和gN）、4種跨膜蛋白（UL20、UL43、US9和可能包括UL24）和II型膜蛋白。囊膜蛋白主要涉及病毒進(jìn)出細(xì)胞以及在細(xì)胞間的傳播，還調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，促進(jìn)合胞體形成。糖蛋白作為病毒粒子和感染細(xì)胞的表面成分，對宿主免疫防御起重要作用。其中，糖蛋白gB、gC和gD是PRV主要的保護(hù)性抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)PRV復(fù)制非必需基因超過一半，這些基因通常是毒力相關(guān)基因，毒力相關(guān)基因的缺失可降低PRV的毒力而不影響病毒的生長，因此，PRV是異源基因插入的理想載體。

2 重組PRV構(gòu)建方法

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，針對皰疹病毒進(jìn)行DNA修飾（點(diǎn)突變、基因敲除和基因插入）的技術(shù)手段已十分成熟。構(gòu)建重組PRV的關(guān)鍵是PRV基因修飾后能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)包裝出具有感染性的重組PRV粒子。目前用于構(gòu)建PRV重組病毒技術(shù)方法包括傳統(tǒng)同源重組技術(shù)、細(xì)菌人工染色體（bacterial artificial chromosome，BAC）技術(shù)和CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)。傳統(tǒng)同源重組方法重組效率較低，重組病毒純化過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力。BAC技術(shù)是研究皰疹病毒有力的工具。PRV感染性克隆可在大腸桿菌中以單拷貝或極低拷貝質(zhì)粒的形式進(jìn)行復(fù)制，不易發(fā)生變異，還能通過Red重組對BAC DNA進(jìn)行遺傳操作，效率高，成本低，操作精度高，將BAC DNA轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞可成功拯救出重組病毒。利用BAC技術(shù)構(gòu)建的重組病毒不需要在宿主細(xì)胞傳代和篩選，簡化了重組病毒的構(gòu)建。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)是近些年研究的熱點(diǎn)，結(jié)合同源重組和非同源重組對PRV進(jìn)行基因的插入、缺失和替換。CRISPR/Cas9技術(shù)的應(yīng)用使重組PRV構(gòu)建的速度更快、效率更高，此外可以對PRV基因組多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行修飾，應(yīng)用前景廣闊。

3 PRV基因缺失株的構(gòu)建與應(yīng)用

豬偽狂犬病對部分養(yǎng)豬大國危害極大，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，病豬和帶毒豬是最重要的傳染源，PRV可以在豬體形成潛伏感染，對豬群造成持續(xù)威脅，是控制該病的難點(diǎn)，基因缺失疫苗配合鑒別診斷技術(shù)推動(dòng)了該病在很多國家家養(yǎng)豬群中的凈化。PRV基因缺失疫苗優(yōu)點(diǎn)在于毒力減弱，返強(qiáng)可能性極低，保持較好的免疫原性。大多數(shù)缺失株不能侵入神經(jīng)系統(tǒng)，難以建立潛伏感染。第一代基因工程PRV缺失株為TK單基因缺失株。1984年，Kit等[3]以PRV BUK為親本株構(gòu)建了TK單基因缺失株P(guān)RV BUK-dl3株，試驗(yàn)表明，PRV BUK-dl3株對豬只安全，攻毒保護(hù)率較高。該毒株是世界上首個(gè)獲得批準(zhǔn)使用的基因工程疫苗，1986年在美國上市。我國研究者陳煥春等[4]和王琴等[5]分別構(gòu)建了PRV Ea和Ra TK基因缺失株，研究表明兩株缺失株體外生長特性穩(wěn)定。第二代基因工程PRV缺失株不僅缺失TK基因，還缺失復(fù)制非必需的糖蛋白基因（TK/gE缺失株、TK/gG缺失株、TK/gC缺失株）或者添加報(bào)告基因，主要用于疫苗毒株和野生毒株的鑒別診斷[6-8]。Bartha-K61株是一種gI/gE雙基因缺失弱毒疫苗，缺失部分包括整個(gè)gE基因以及部分gI基因，毒力基因的缺失大大提高該疫苗的安全性，并且能夠有效地保護(hù)免疫動(dòng)物。Bartha-K61株的推廣應(yīng)用對很多國家家養(yǎng)豬群PRV的凈化發(fā)揮了重大作用[9]。1970年，Bartha-K61株被引入我國并廣泛使用，使我國豬偽狂犬病得到較好的控制。2000年之后，許多豬場建立了PRV gE抗體陰性豬群，不少豬場基本實(shí)現(xiàn)PRV的凈化。然而，2011年以來，一種PRV變異株在我國暴發(fā)流行，變異株不僅造成仔豬發(fā)病死亡，母豬流產(chǎn)，同時(shí)對生長豬和育肥豬致病力較強(qiáng)，甚至引起死亡[10-11]。Bartha-K61株不能提供完全的保護(hù)力（阻止排毒的效力嚴(yán)重不足）[12-14]。目前，國內(nèi)多個(gè)團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)變異株缺失株（gE/gI、gE/TK或者TK/gE/gI）能夠有效地抵抗變異株攻擊，如表1所示。本課題組在2012年分離鑒定了PRV變異株AH02LA株，研究發(fā)現(xiàn)該變異株引起4～5周齡仔豬和9～10周齡生長豬100%發(fā)病或死亡，感染后2～3 d，4～5周齡仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、呼吸癥狀、腹瀉，9～10周齡生長豬出現(xiàn)明顯的呼吸癥狀，表明該變異株毒力增強(qiáng)[15]。之后本課題組通過細(xì)菌人工染色體技術(shù)構(gòu)建了AH02LA株gE和TK雙基因缺失株，研究發(fā)現(xiàn)該缺失株接種PRV陰性斷奶仔豬后對變異株AH02LA株攻擊產(chǎn)生完全的保護(hù)[13]。

表1 不同PRV變異株缺失株對仔豬免疫效力的研究Table 1 Study on protection efficacy induced by gene deleted PRV variants in piglets

gB、gC和gD是PRV的主要保護(hù)性抗原，Yu等[22]以Bartha-K61株為載體，利用CRISPR/Cas9技術(shù)將Bartha-K61株的gB基因替換為變異株JS-2012株的gB基因，制備的滅活疫苗接種小鼠可對變異株提供80%的保護(hù)。本研究團(tuán)隊(duì)以Bartha-K61株為載體，利用BAC系統(tǒng)將Bartha-K61株的gC基因和gD替換為變異株AH02LA株的gC基因和gD基因，制備活疫苗接種斷奶仔豬可對變異株AH02LA株攻擊產(chǎn)生完全的臨床保護(hù)，降低排毒率或減少排毒量、縮短排毒時(shí)間，非常適用于我國豬場中PRV變異株的凈化[14]。PRV變異株缺失株的構(gòu)建與應(yīng)用，為PRV變異株活載體疫苗的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

4 PRV活載體疫苗的研究進(jìn)展

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基因工程病毒活載體疫苗成為新一代獸用疫苗研究的熱點(diǎn)。皰疹病毒基因組大，含多個(gè)復(fù)制非必需基因和非編碼區(qū)，對外源基因的承載力強(qiáng)，適合用于載體疫苗的構(gòu)建。研究發(fā)現(xiàn)以皰疹病毒為載體構(gòu)建的重組病毒能有效地表達(dá)外源基因，快速產(chǎn)生高效的體液免疫和細(xì)胞免疫，應(yīng)用效果顯著。此外，活載體病毒的生產(chǎn)工藝簡單，成本低廉，使用方便。

PRV屬于皰疹病毒，其基因缺失活疫苗被廣泛用于豬偽狂犬病的預(yù)防，因此以PRV缺失株為載體，插入豬病病原的保護(hù)性抗原構(gòu)建活載體疫苗有預(yù)防多病的潛力。國內(nèi)外在這方面進(jìn)行了諸多探索。

4.1 豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）/PRV重組病毒Qiu等[23]將PRRSV GP5基因插入到Bartha-K61株TK基因的等位位點(diǎn)，構(gòu)建了表達(dá)GP5基因的重組病毒rPRV-GP5，免疫仔豬沒有檢測到PRRSV抗體，PRRSV CH-1a強(qiáng)毒株攻擊后，免疫仔豬出現(xiàn)溫和的體溫反應(yīng)，輕微的肺臟和腎臟病理變化以及短期的病毒血癥。為了提高rPRV-GP5的保護(hù)效率，江云波[24]等將改造過的PRRSV GP5m+基因插入PRV Ea基因缺失疫苗TK-/gE-/LacZ+基因組中，構(gòu)建重組病毒rPRV-GP5m，免疫小鼠產(chǎn)生PRRSV中和抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)水平優(yōu)于rPRV-GP5。之后該團(tuán)隊(duì)將GP5m基因和膜蛋白M基因插入PRV TK-/gE-/LacZ+基因組中，構(gòu)建重組病毒rPRV-GP5m-M，免疫小鼠誘發(fā)抗PRV特異性抗體，并能抵抗PRV致死性的攻擊，同時(shí)產(chǎn)生高水平PRRSV特定的中和抗體和淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。免疫仔豬后，與PRRSV滅活苗相比，rPRV-GP5m-M誘導(dǎo)更高水平的PRRSV特定中和抗體和淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。PRRSV強(qiáng)毒攻擊后，rPRV-GP5m-M接種仔豬組織內(nèi)病毒載量降低，病毒血癥時(shí)間縮短[25]，該重組病毒的構(gòu)建為PRRSV/PRV活載體疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

4.2 豬圓環(huán)病毒II型（Porcine circovirus type 2，PCV2）/PRV重組病毒Ju[26]等將PCV2融合蛋白ORF1和ORF2基因插入PRV Ea株gE和gI基因的等位位點(diǎn)，構(gòu)建了共表達(dá)ORF1和ORF2基因的重組病毒rPRV-PCV2，免疫小鼠和豬后，誘導(dǎo)PRV和PCV2特定抗體以及PCV2淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。之后該研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了表達(dá)ORF2基因的重組病毒PRV Tk-/gE-/ORF2+，免疫4周齡仔豬誘發(fā)抗PRV和PCV2體液免疫反應(yīng)，免疫后3周仍能檢測到PCV2特定淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。Zheng等[27]構(gòu)建了共表達(dá)ORF2和IL-18基因的PRV重組病毒PRV-ORF2-IL18，免疫小鼠誘導(dǎo)高水平的抗PRV和PCV2抗體以及PCV2特定淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)（CD3+，CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量增加），且能有效地抵抗PRV強(qiáng)毒株的攻擊，減少PCV2強(qiáng)毒株攻擊后組織的病毒載量，以上研究結(jié)果表明該重組毒具有預(yù)防PCV2和PRV的巨大潛力。

4.3 口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）/PRV重組病毒Ding等[28]構(gòu)建了表達(dá)FMDV VP1基因的PRV重組病毒rPRV-VP1。免疫豬抗FMDV抗體水平低于FMDV商品疫苗，減輕FMDV強(qiáng)毒攻擊后的臨床癥狀。為了提高重組病毒的免疫效率，將含有FMDV VP1和SV40 polyA基因的表達(dá)盒插入PRV弱毒株gG基因的等位基因，構(gòu)建重組病毒PRV-P1，免疫豬后，重組病毒組產(chǎn)生高水平抗PRV和FMDV抗體，激活抗FMDV細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，F(xiàn)MDV強(qiáng)毒株攻擊后，仔豬存活率為3/5[29]。之后Zhang等[30]將FMDV的衣殼前體多肽P12A和非結(jié)構(gòu)蛋白3C基因插入到PRV弱毒株gI和gE基因的等位基因，構(gòu)建了重組病毒PRV-P12A3C，免疫6周齡仔豬誘發(fā)了高水平抗FMDV中和抗體和特定淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，F(xiàn)MDV強(qiáng)毒株攻擊后，F(xiàn)MDV滅活苗產(chǎn)生100%的保護(hù)，PRV-P12A3C誘導(dǎo)60%的保護(hù)。由于目前FMDV/PRV重組病毒效果不佳以及FMDV血清型眾多，F(xiàn)MDV/PRV重組疫苗尚需進(jìn)一步研究。

4.4 豬流感病毒（Swine influenza virus，SIV）/PRV重組病毒Tian等[31]構(gòu)建了表達(dá)H3N2 HA基因的PRV基因重組病毒rPRV-HA，免疫小鼠三周后誘發(fā)血凝抑制抗體。H3N2強(qiáng)毒攻擊后，免疫小鼠沒有檢測到H3N2強(qiáng)毒，肺部發(fā)生溫和病變。Walter Fuchs等將H1N1密碼子優(yōu)化的HA或NA基因插入到PRV Bartha-K61株gG基因的等位基因，構(gòu)建重組病毒PrV-BaMI-synH1和PrV-BaMI-synN1。PrV-BaMI-synH1和PrV-BaMI-synN1分別或者混合免疫7周齡生長豬后，誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖反應(yīng)和H1N1特定抗體，H1N1強(qiáng)毒攻擊后，PrV-BaMI-synH1或PrV-BaMI-synN1免疫豬無臨床癥狀，排毒量顯著減少。此外，研究結(jié)果表明PrV-BaMI-synH1保護(hù)效率優(yōu)于PrV-BaMI-synN1。滴鼻接種PrV-BaMI-synH1兩次能夠阻止H1N1強(qiáng)毒株的接觸性感染[32-33]。

4.5 豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）/PRV重組病毒Ben等[34]構(gòu)建了表達(dá)E2基因的PRV gD和gE缺失的重組病毒，免疫豬有效地抵抗PRV強(qiáng)毒株和CSFV的攻擊。Wang等[35]將CSFV E2基因插入PRV TJ株gE和gI基因的等位位點(diǎn)，構(gòu)建重組病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2，PRV變異株和CSFV強(qiáng)毒株攻擊豬后，rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫組快速誘導(dǎo)高水平抗PRV和SCFV中和抗體，產(chǎn)生100%的保護(hù)[35]。Lei等[36]將CSFV E2 基因插入PRV TJ基因缺失病毒PRV TJ-delgE/gI/TK內(nèi)，構(gòu)建重組病毒rPRVTJ-delgE/gI/TK-E2，免疫豬沒有發(fā)生臨床癥狀和排毒，誘導(dǎo)高水平抗PRV和SCFV中和抗體，且能有效地抵抗PRV TJ株和CSFA Shimen株的攻擊，為CSFV/PRV雙價(jià)疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

4.6 日本乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）/PRV重組病毒Xu等[37]構(gòu)建了表達(dá)JEV NS1基因的PRV重組病毒rPRV-NS1。105PFU重組毒接種小鼠和仔豬后誘導(dǎo)JEV特定的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，有效地抵抗PRV強(qiáng)毒Ea株的攻擊。Qian等[38]將JEV I型prM和E基因插入PRV弱毒疫苗株P(guān)RV TK-/gE-/lacZ+內(nèi)，構(gòu)建重組病毒PRV TK-/gE-/PrM-E+。免疫小鼠產(chǎn)生抗PRV和JEV ELISA抗體。JEV SX09S-01強(qiáng)毒株攻擊后，免疫組死亡時(shí)間延長，死亡率降低。

4.7 豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）/PRV重組病毒Chen等[39]將PPV VP2基因插入到PRV SA215株 gI和gE基因的等位基因，構(gòu)建重組病毒PRV SA215/VP2，免疫仔豬后，重組病毒組誘導(dǎo)抗PRV和PPV體液免疫反應(yīng)，完全抵抗PRV強(qiáng)毒的攻擊。免疫母豬后，誘導(dǎo)PPV特定抗體并且顯著減少PPV強(qiáng)毒株攻擊的流產(chǎn)率。

普遍認(rèn)為活載體疫苗比其他新型疫苗更有發(fā)展?jié)摿?，但獲得能夠商品化的重組活載體疫苗并非易事，目前PRV活載體疫苗沒有一個(gè)進(jìn)入生產(chǎn)應(yīng)用中。啟動(dòng)子和插入位點(diǎn)的選擇是制約PRV活載體疫苗發(fā)展的重要因素。合適的插入位點(diǎn)不僅可以使異源基因穩(wěn)定表達(dá)，還不影響病毒的生長特性。如表2所示，目前報(bào)道的重組PRV的插入位點(diǎn)主要包括gG等位位點(diǎn)、PK和gG之間、gI等位位點(diǎn)、gI和gE的等位位點(diǎn)和TK的等位位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)外源基因插入以上幾個(gè)位點(diǎn)能夠成功穩(wěn)定的表達(dá)，然而一些研究并未提供重組病毒的體外生長動(dòng)力學(xué)的數(shù)據(jù)，外源基因插入以上幾個(gè)位點(diǎn)是否影響病毒的復(fù)制尚需鑒定。合適的插入位點(diǎn)選擇將是今后的研究重點(diǎn)。報(bào)道中表達(dá)外源基因的啟動(dòng)子主要選用gG、HCMV、MCMV和CAG（包括HCMV增強(qiáng)子和雞β-actin啟動(dòng)子）。Alexandra等[40]使用3種不同的啟動(dòng)子（HCMV、MCMV和CAG），構(gòu)建了3種表達(dá)ASFV pE199L基因重組PRV病毒，發(fā)現(xiàn)CAG作為啟動(dòng)子pE199L表達(dá)水平最高。相對于單一的啟動(dòng)子，復(fù)合啟動(dòng)子的使用可能會增加外源基因的表達(dá)量。

5 PRV重組病毒的應(yīng)用前景

針對我國出現(xiàn)的PRV變異株，國內(nèi)多個(gè)團(tuán)隊(duì)通過基因工程技術(shù)構(gòu)建多株P(guān)RV變異株基因缺失活疫苗，盡管活疫苗在安全性上可能存在少許不足，但合理地使用這些疫苗可產(chǎn)生良好的效果，為我國PRV的凈化奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。此外，國內(nèi)外很多團(tuán)隊(duì)構(gòu)建多種表達(dá)異源病毒抗原基因的PRV重組病毒免疫動(dòng)物可誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，但報(bào)道的免疫效力有高有低，差別很大，目前相關(guān)疫苗的應(yīng)用較少。分析效果的影響因素主要包括外源保護(hù)性基因的選擇、目的抗原基因插入位點(diǎn)和表達(dá)、載體免疫與目的抗原免疫的競爭等。PRV基因組龐大，有很多可供選擇的復(fù)制非必須區(qū)，如果選擇合適的位點(diǎn)插入豬病的保護(hù)性抗原基因可以達(dá)到接種一種疫苗預(yù)防多種疾病的效果，既節(jié)省成本提高效率，又減少免疫次數(shù)，減少應(yīng)激，提高經(jīng)濟(jì)效益，插入位點(diǎn)選擇的基本要求是外源基因插入后不影響載體病毒增殖能力和免疫原性，且外源基因插入后能保持穩(wěn)定，不發(fā)生丟失，大多報(bào)道的研究選擇非必需基因進(jìn)行替換插入外源基因表達(dá)盒，雖然替換的是非必需基因，但可能對病毒的復(fù)制和穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，因此，選擇基因開放閱讀框下游的非編碼區(qū)作為插入位點(diǎn)，以避免對上下游基因的影響，應(yīng)是PRV重組活載體的研究內(nèi)容之一。此外，啟動(dòng)子選擇的好壞制約外源基因的表達(dá)水平，選擇合適的啟動(dòng)子可增加目的抗原基因的表達(dá)水平，進(jìn)而提高重組病毒的免疫效力，報(bào)道中一般選擇MCMV IE、SV40和Beta-actin等強(qiáng)啟動(dòng)子來增強(qiáng)外源基因的表達(dá)，在接下來的研究中可以將這些啟動(dòng)子進(jìn)行復(fù)合或者引入甲病毒復(fù)制子以進(jìn)一步提高外源抗原的表達(dá)量。由于豬群廣泛接種PRV疫苗，PRV母源抗體的干擾也是PRV載體活疫苗在臨床上應(yīng)用的重大障礙，因此，如何克服PRV母源抗體的干擾也是PRV載體活疫苗在生產(chǎn)中能得到廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵之一，通過礦化方法或殼聚糖等對載體病毒進(jìn)行包裹有望一定程度克服母源抗體干擾，還有通過滴鼻、噴鼻或霧化等途徑進(jìn)行呼吸道接種也能一定程度避免母源抗體的干擾作用，是提高PRV載體活疫苗臨床應(yīng)用價(jià)值的方法，值得進(jìn)一步研究。另外，由于PRV的宿主譜非常廣，在其他宿主上沒有母源抗體干擾的問題，通過構(gòu)建PRV必需基因缺失株載體與配套表達(dá)細(xì)胞系生產(chǎn)復(fù)制缺陷型的載體疫苗株也是對除豬以外的家畜開發(fā)以PRV為載體的新型疫苗的思路之一。綜上所述，為開發(fā)出能在生產(chǎn)中應(yīng)用的PRV活載體疫苗，以上因素都是我們今后研究的重點(diǎn)。

表2 重組PRV的基本信息Table 2 General information of recombinant PRVs