肝片形吸蟲囊蚴抵抗力觀察

方 文，李天美，李 婷，陳紹榮，劉榆華，羅家軍

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2017.09.011

肝片形吸蟲囊蚴抵抗力觀察

方 文，李天美，李 婷，陳紹榮，劉榆華，羅家軍

目的觀察肝片形吸蟲囊蚴經(jīng)加熱、干燥、食用調(diào)料等處理后的存活情況。方法將肝片形吸蟲囊蚴經(jīng)1)加熱：微波高火30 s、60 s；沸水10、30 s和1、2、3 min。 2)干燥：室溫下自然干燥24、40 h。3)食源調(diào)料：蒜汁、醬油、醋以及3種等量混合液浸泡10、20、30 min；38°白酒及飽和鹽水各浸泡10、20、30 min。 4)4 ℃下保存10個(gè)月。結(jié)果2種加熱方式處理后囊蚴全部死亡；放置于玻片上的囊蚴干燥24 h，死亡4只，附著于葉片上的囊蚴干燥40 h，死亡2只；在蒜汁、醬油、醋中浸泡10、20、30 min，囊蚴全部存活；在3種調(diào)料的等量混合液、飽和鹽水及38°白酒中浸泡10、20、30 min后，均有部分存活，另有一部分囊蚴結(jié)構(gòu)清晰但蟲體不動(dòng)，但也無明顯死囊蚴的特征；在4 ℃下保存10個(gè)月，仍有存活的囊蚴。結(jié)論常用的調(diào)料對(duì)囊蚴不起作用，自然干燥1～2 d不能完全殺滅囊蚴，在低溫潮濕環(huán)境中可較長(zhǎng)時(shí)間保持活力。沸水加熱10 s或微波高火30 s即可殺死囊蚴。

肝片形吸蟲囊蚴；溫度；調(diào)料；抵抗力

片形吸蟲病是一種人獸共患寄生蟲病，以往認(rèn)為主要是牛、羊等家畜的疾病，只可偶爾感染人體[1-2]。但2011年11月至2012年2月，云南賓川暴發(fā)26例大片形吸蟲感染[3-4]，此事件警醒人們：片形吸蟲病是與人們的飲食衛(wèi)生習(xí)慣密切相關(guān)的、危害嚴(yán)重的食源性(植物源性)寄生蟲病。由于食源性寄生蟲病的傳播和流行是與人們不良的行為方式有關(guān)，因此，預(yù)防感染的關(guān)鍵是開展健康教育活動(dòng)，向人們宣傳、普及衛(wèi)生知識(shí)，改變不利于健康的生活方式和飲食、衛(wèi)生習(xí)慣，從而提高人們的防病意識(shí)和自我保護(hù)能力[5-6]。肝片形吸蟲病是因食入含有活的肝片形吸蟲囊蚴的水生植物等而感染，引起的損害主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：一是童蟲經(jīng)小腸、腹腔進(jìn)入并在肝內(nèi)移行時(shí)造成機(jī)械性損傷和化學(xué)性刺激，引起肝組織的炎癥反應(yīng)及肝膿瘍，出現(xiàn)急性癥狀如高熱、腹痛、蕁麻疹、肝腫大及血中嗜酸性粒細(xì)胞增多等；二是成蟲進(jìn)入膽管后引起膽管炎癥、膽管上皮增生及膽管周圍的纖維化[7]。但是，有關(guān)片形吸蟲囊蚴對(duì)我們?nèi)粘Ｉ钪谐Ｒ姷奈锢砗突瘜W(xué)因素的抵抗力的實(shí)驗(yàn)研究較少，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)肝片形吸蟲囊蚴經(jīng)加熱、干燥以及食用調(diào)料等處理后，觀察其存活情況，以指導(dǎo)人們采取正確的烹飪方式，預(yù)防該病的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 肝片形吸蟲囊蚴的培養(yǎng) 肝片形吸蟲蟲卵的收集、孵化等參照本室的方法[8]進(jìn)行，中間宿主為本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的二代小土蝸。蟲卵孵育至第15天已有大量毛蚴孵出，用吸管將毛蚴吸出于燒杯中，直接倒入養(yǎng)螺盆，進(jìn)行隨機(jī)感染，連續(xù)6 d，每次感染的毛蚴數(shù)量約600～800條。小土蝸喂食干饅頭(饅頭掰碎、曬干，酌情加入)，每d用去氯水更換養(yǎng)螺水，記錄水溫。感染40 d后，在養(yǎng)螺盆水面放置魚腥草葉片和保鮮膜片(裁成大小為2.5×2 cm)，用來收集囊蚴。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)各取10～20只附著于葉片或保鮮膜上的囊蚴：1)經(jīng)微波高火30 s、1 min后，立即將葉片或膜投入冷水中，以免受高溫持續(xù)影響；2) 將盛水的燒杯置于電爐上燒開(當(dāng)?shù)睾０? 976 km，水的沸點(diǎn)為95 ℃左右)，用鑷子夾住葉片浸入沸水中，分別經(jīng)10 s、30 s、1 min、2 min、3 min后取出，隨即放入冷水中；3) 室內(nèi)自然干燥：將囊蚴從保鮮膜上取下置于玻片上，待玻片上的水分蒸發(fā)后開始計(jì)時(shí)24 h；取附著有囊蚴的葉片，待葉片表面上的水分蒸發(fā)后開始計(jì)時(shí)，40 h后置于蒸餾水中，24 h內(nèi)在鏡下反復(fù)觀察；4) 將囊蚴浸泡于飽和鹽水(水溫24 ℃，濃度約33%)、38°白酒、食用醋、醬油(含鹽量15%～20%)、蒜汁及3種調(diào)料的等量混合液中，浸泡時(shí)間分別為10 min、20 min、30 min，作用時(shí)間到后立即取出葉片或膜，用蒸餾水反復(fù)清洗，直至清洗液無色、無味，再放入蒸餾水中，24 h內(nèi)鏡下反復(fù)觀察。5) 將囊蚴置于4 ℃下保存10個(gè)月，觀察囊蚴的存活情況。

1.3 囊蚴死活判定 實(shí)驗(yàn)終止后，均將最外層囊壁即第一層囊壁去掉，主要觀察第二、三層囊壁及其內(nèi)幼蟲(即后尾蚴)的變化。死囊蚴：囊蚴變黑；結(jié)構(gòu)不清晰；囊蚴呈圓形或不呈正圓形、幼蟲與囊壁間出現(xiàn)明顯空隙、幼蟲腸盲管結(jié)構(gòu)模糊不清、排泄囊變黑，并在24 h內(nèi)多次觀察其內(nèi)的幼蟲仍收縮不動(dòng)等，均判定囊蚴死亡。實(shí)驗(yàn)終止后，24 h內(nèi)反復(fù)觀察，囊蚴內(nèi)幼蟲的腸盲管和排泄囊形態(tài)清晰，可活動(dòng)，即判定為活囊蚴。

2 結(jié) 果

感染期間水溫為23～27 ℃，平均25 ℃，感染后第44 d檢獲囊蚴。4只小土蝸感染成功，持續(xù)24 d逸出尾蚴并結(jié)成囊蚴。

2.1 溫度對(duì)囊蚴的作用

2.1.1 微波高火30 s和1 min 兩組實(shí)驗(yàn)各做了2次，每次各10只囊蚴。結(jié)果囊蚴(圖2)的變化一致，即囊蚴顏色變淺、第二層囊壁變薄，后尾蚴收縮并與囊壁間空隙加大，呈月牙形，最寬處約有10 μm，幼蟲的腸盲管模糊不清，排泄囊變成黑色一團(tuán)，其上有數(shù)十顆如葡萄串樣的屈光顆粒，左右對(duì)稱。隨后將觀察過的囊蚴放入蒸餾水中保存，24 h內(nèi)4～6次吸出反復(fù)觀察均未發(fā)現(xiàn)幼蟲活動(dòng)，形態(tài)與初次觀察的結(jié)果一致，未發(fā)生改變。

圖1 正常囊蚴 圖2 微波30 s 圖3 沸水10 s Fig.1 MetacercariaFig.2 Microwave for 30 sFig.3 Boiling water for 10 s

2.1.2 沸水10、30 s和1、2、3 min 5組實(shí)驗(yàn)各做了2次，每次各取10只囊蚴，試驗(yàn)結(jié)果相似(圖3)：囊蚴外形變化不大，顏色呈黑褐色，第二層囊壁變薄，幼蟲收縮與囊壁間出現(xiàn)空隙呈月牙形，在口吸盤對(duì)端出現(xiàn)明顯的凹陷，如大腦溝回樣。腸管結(jié)構(gòu)消失或呈絮狀，左右兩側(cè)的排泄囊呈黑褐色，其上有數(shù)十顆如葡萄串樣的屈光顆粒。在隨后的24 h 內(nèi)4～6次反復(fù)觀察：囊蚴形態(tài)均未發(fā)生改變，也未發(fā)現(xiàn)幼蟲運(yùn)動(dòng)。另外，還觀察到一個(gè)現(xiàn)象，即實(shí)驗(yàn)所用的囊蚴均是附著在折耳根葉子上，浸泡于沸水中經(jīng)不同時(shí)間后取出，所有囊蚴仍附著在葉上，無一脫落在沸水里。

2.1.3 室內(nèi)自然干燥 實(shí)驗(yàn)期間室溫在22～24 ℃之間，自然干燥、避免陽(yáng)光直曬。干燥24 h的結(jié)果(圖4)：共有10只囊蚴，其中4只發(fā)黑，蟲體結(jié)構(gòu)不清晰；6只形態(tài)、顏色、結(jié)構(gòu)與正常囊蚴基本一致，第二層囊壁略呈波浪狀，未發(fā)現(xiàn)蟲體運(yùn)動(dòng)；保持囊蚴濕潤(rùn)2 h、5 h后再觀察，結(jié)果如前；但17 h后觀察形態(tài)未發(fā)生改變中的4只可見蟲體運(yùn)動(dòng)。

葉片上干燥40 h，此時(shí)葉片尚未完全干枯、略軟，取下囊蚴置玻片上觀察，2只變黑，蟲體結(jié)構(gòu)不清；8只形態(tài)正常，但未見蟲體運(yùn)動(dòng)；保持囊蚴濕潤(rùn)，5 h后再觀察，可見形態(tài)正常中的5只，其內(nèi)的蟲體可動(dòng)。隨后，將形態(tài)正常的8只囊蚴依次放入人工消化液(38 ℃， 3.5 h)及75%牛膽汁(38 ℃，1.5 h)中，孵出1條后尾蚴(圖5)。

圖4 干燥24 h 圖5 后尾蚴 Fig.4 Drying for 24 h Fig.5 Excited metacercariae

2.1.4 各種調(diào)料作用后囊蚴的變化情況 使用日常生活中常用的調(diào)料：醋、醬油、蒜汁及3種的等量混合液，以及38°白酒和飽和鹽水，作用時(shí)間各為10、20和30 min。結(jié)果詳見表1。

表1 調(diào)料對(duì)肝片形吸蟲囊蚴的影響
Tab.1 Effect of seasonings on F. hepatica metacercariae

調(diào)料Seasonings作用時(shí)間Time(min)觀察數(shù)量(只)Observedquantity結(jié)構(gòu)不清、變黑(只)Unclearstructure結(jié)構(gòu)清晰但不動(dòng)(只)Clearstructurebutnotmoving結(jié)構(gòu)清晰可運(yùn)動(dòng)(只)Clearstructuremovement醋vinegar10100010201000103010046醬油soysauce101000102010001030100010蒜汁garlicjuice101000102010001030100010混合液mixedliquor109045201105630901838°白酒38°liquor10900920100463010055飽和鹽水saturatedbrine1010064208071309072

2.1.5 冷藏保存 因醋、醬油和蒜汁作用過的囊蚴，除了經(jīng)醋30 min浸泡過的有4只未發(fā)現(xiàn)幼蟲運(yùn)動(dòng)外，其余全部能活動(dòng)，因此各收集于小燒杯中加蒸餾水，保存于4 ℃下，10個(gè)月后取出觀察，共觀察27只囊蚴：所有囊蚴囊壁結(jié)構(gòu)清晰，而幼蟲結(jié)構(gòu)模糊不清的有8只(如圖6)，幼蟲結(jié)構(gòu)清晰的有13只，其中1只仍可運(yùn)動(dòng)(圖7)；另有6只囊蚴因燒杯中水分干涸了約2～3周，加入蒸餾水1 h后觀察，6只的外形正常，內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰和不清晰各有3只，結(jié)構(gòu)清晰的未發(fā)現(xiàn)蟲體運(yùn)動(dòng)。

圖6 4 ℃下保存10個(gè)月，結(jié)構(gòu)不清 圖7 4 ℃下保存10個(gè)月，幼蟲可運(yùn)動(dòng)Fig.6 Storing for 10 months at 4 ℃, Fig.7 Storing for 10 months at 4 ℃,unclear structure larval movement

3 討 論

本次所完成的肝片形吸蟲囊蚴抵抗力實(shí)驗(yàn)，是模擬大理地區(qū)人們?nèi)粘Ｉ钪薪?jīng)常使用的烹調(diào)方法和生活衛(wèi)生習(xí)慣。由于人體感染肝片形吸蟲是食入含活的囊蚴的水生植物等蔬菜而致，這類蔬菜常用來做成涼拌菜，調(diào)料主要是醋、醬油、蒜等，一般是將佐料調(diào)配好后澆在洗凈切好的菜上，現(xiàn)拌現(xiàn)吃。本實(shí)驗(yàn)采取用上述調(diào)料分別浸泡10、20、30 min ，結(jié)果表明這些調(diào)料單一和混合都起不到殺滅囊蚴的作用。另外，人們認(rèn)為鹽水和酒可以殺滅寄生蟲卵等微生物，即將蔬菜清洗干凈后，用鹽水浸泡，或者是在進(jìn)食時(shí)以酒佐餐。本次實(shí)驗(yàn)采用濃鹽水(33%氯化鈉溶液)、15%～20%氯化鈉溶液(即為醬油)和38°白酒分別浸泡10、20、30 min ，結(jié)果顯示鹽水和白酒也不能完全殺滅囊蚴。雖然在飽和鹽水中浸泡20和30 min后，可觀察到能活動(dòng)的囊蚴較少，但其內(nèi)的幼蟲結(jié)構(gòu)并未破壞，由于未做動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)，因此這樣的囊蚴是否具有感染性尚不得而知。據(jù)吳德孚報(bào)道[9]，將囊蚴浸泡于6%氯化鈉溶液中6 h，對(duì)囊蚴的平均殺滅率為72.1%，但是一般用鹽水浸泡蔬果的時(shí)間不會(huì)超過20 min。因此，無論是低、中、高濃度的鹽水均不能殺滅囊蚴。

干燥實(shí)驗(yàn)采用兩種方式，一是將囊蚴吸出于玻片上，室溫(22～24 ℃)下自然干燥24 h；另一種方法是模擬人們常用的蔬菜保存方式，即將蔬菜儲(chǔ)存于室內(nèi)陰涼處1～2 d或更長(zhǎng)時(shí)間后食用，遂將附著有囊蚴的葉片置室溫下自然干燥40 h。前者明確死亡的囊蚴有4只，后者為2只，表明兩種方式也不能完全殺滅囊蚴。據(jù)報(bào)道[10]，在溫度20 ℃和相對(duì)濕度為98、75、52、33%的環(huán)境下，肝片形吸蟲囊蚴保持感染的時(shí)間分別為7、7、4、2個(gè)月。由于葉子對(duì)囊蚴具有保濕作用，這就意味著，在成梱、成堆的蔬菜中，囊蚴存活的時(shí)間會(huì)更長(zhǎng)。

4 ℃水中保存10個(gè)月，囊蚴形態(tài)正常的占59.26%(16/27)，且其中1只囊蚴仍可運(yùn)動(dòng)，表明囊蚴在低溫潮濕的環(huán)境中可較長(zhǎng)時(shí)間保持活力。

但是在高溫下，即微波高火30 s或沸水10 s及以上，囊蚴的形態(tài)即可發(fā)生明顯改變：蟲體收縮、腸管結(jié)構(gòu)消失或呈絮狀，排泄囊呈黑褐色。在作用結(jié)束后24 h內(nèi)反復(fù)觀察，均未發(fā)現(xiàn)蟲體運(yùn)動(dòng)且形態(tài)如初，表明囊蚴不耐高溫。由于本實(shí)驗(yàn)只用單張葉片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察，若在實(shí)際烹飪中，應(yīng)延長(zhǎng)加熱時(shí)間，使所有蔬菜均勻受熱，以防止感染。另外，附著在葉片上的囊蚴浸泡于沸水中不會(huì)脫落在水里，因此盡管沸水10 s即可殺死囊蚴，但是如果是吃火鍋涮菜時(shí)，安全起見還是要延長(zhǎng)加熱時(shí)間。

總之，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肝片形吸蟲囊蚴對(duì)日常生活中使用的調(diào)料：醋、醬油、蒜汁、鹽，甚至是白酒均不敏感；室溫下自然干燥1～2 d也不能完全殺滅；低溫(4 ℃)潮濕下 ，可長(zhǎng)時(shí)間保持活力；但囊蚴對(duì)高溫敏感，微波高火30 s和沸水10 s，即可殺死。

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ResistanceonFasciolahepaticametacercariae

FANG Wen, LI Tian-mei, LI Ting, CHEN Shao-rong, LIU Yu-hua, LUO Jia-jun

(DaliPrefecturalInstituteofResearchandControlonSchistosomiasis,Dali671000,China)

We observed the survival situation after treatments ofFasciolahepaticametacercariae by heating, drying and food seasoning. Results showed that after treating with microwave high fire and boiling water, all the metacercariae died. There were four metacercariae died after putting on the slide and dried them for 24 hours, while two died after attaching on the blade for 40 hours.The metacercariae all survived in the garlic, soy sauce, and vinegar liquid for 10, 20 and 30 min; After 10, 20 and 30 min soaking in the same amount of mixed liquor of the three kinds of condiments, saturated brine and the liquor of 38°, part of the metacercariae were survival. The rest of the metacercariae showed clear structures, but the bodies did not move with no obvious characteristic of death of metacercariae. Storing for 4 ℃ in the next 10 months, there was still the survival of metacercariae. In conclusion, the commonly used seasoning had no effect on metacercariae. Natural drying for 1-2 days could not completely kill the metacercariae. A low temperature for a long time could maintain vitality. Heating via boiling water for 10 sec or microwave high fire for 30 s could kill metacercariae.

Fasciolahepatica; metacercariae; temperature; seasoning; resistance

云南省大理州血吸蟲病防治研究所，大理 671000；

Email：fangwenee@126.com

R373.2

：A

：1002-2694(2017)09-0809-05

2017-03-23編輯：李友松