山東省動物源沙門氏菌MLST和血清分型與分布研究

趙 翠，張 慶，郭樹源，李璐璐，劉玉潔，王永明，常維山，劉玉慶

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2017.09.008

山東省動物源沙門氏菌MLST和血清分型與分布研究

趙 翠1，張 慶2，郭樹源3，李璐璐2，劉玉潔4，王永明5，常維山3，劉玉慶2

目的比較動物源沙門氏菌多位點序列分型(MLST)與血清分型的差別，獲得動物源沙門氏菌在山東省的分布規(guī)律。方法從山東部分地區(qū)分離78株雞源沙門氏菌、56株鴨源沙門氏菌和20株豬源的沙門氏菌，PCR擴增七段沙門氏菌內(nèi)部保守的片段序列進行多位點序列分型，同時用玻片凝集法分析其血清型。結(jié)果血清分析結(jié)果表明，雞源沙門氏菌檢出6種血清型，其中腸炎沙門氏菌占88.5%、印第安納沙門氏菌占5.1%、湯卜遜沙門氏菌占2.6%、鼠傷寒沙門氏菌占1.3%、山夫登堡沙門氏菌占1.3%、阿格瑪沙門氏菌占1.3%；鴨源沙門氏菌檢出2種血清型，其中腸炎沙門氏菌占67.9%、鼠傷寒沙門氏菌占32.1%；豬源沙門氏菌檢出3種血清型，其中鼠傷寒沙門氏菌占65%、德貝兒沙門氏菌占20%、腸炎沙門氏菌占15%。通過MLST分型，雞源檢出7種ST型：ST11、ST19、ST26、ST128、ST14、ST17和New1；鴨源檢出3種ST型：ST11、ST19和New2；豬源檢出3種：ST34、ST40和ST3007。結(jié)論整體來看，分離菌的血清型和ST型數(shù)量比較接近，二者分型能力相近。

沙門氏菌；血清型；MLST；分型

沙門氏菌(Salmonella)是腸桿菌科中的一個大屬，是具有重要公共衛(wèi)生學(xué)意義的人獸共患病原菌，全世界已發(fā)現(xiàn)2500多個血清型[1]，中國已發(fā)現(xiàn)292個血清型[2]。近年來，該菌在畜禽中的帶菌和發(fā)病狀況，以及畜產(chǎn)品中毒的發(fā)生規(guī)律在一些發(fā)達國家受到高度重視，已經(jīng)有詳細的調(diào)查監(jiān)測報告。我國畜禽養(yǎng)殖規(guī)模擴大和感染的病例持續(xù)上升，也應(yīng)當引起養(yǎng)殖場和公共衛(wèi)生的共同重視[3]。

沙門氏菌類別眾多且分類方法也很多，伴隨著沙門氏菌的傳播逐漸由暴發(fā)開始轉(zhuǎn)向多點散發(fā)，僅僅依靠血清學(xué)分型的方法已經(jīng)不能完成病原體的溯源工作，而多位點序列分型(Multilocus sequence typing, MLST)是近幾年通行的一種分子生物學(xué)分型方法[4-6]。它的分型原理是選擇某一種菌的幾段管家基因作為分型的目標基因，分別設(shè)計引物擴增并測序，根據(jù)菌株每個基因的序列信息分配等位基因序號，把該菌株所有基因的等位基因序號合并在一起組成一個等位基因譜，并給這個等位基因譜分配一個唯一的編號作為該分離株的序列型別[7]。該方法克服了PFGE和flaA難以分型及溯源的缺點，具有分辨率高、數(shù)據(jù)可靠、重復(fù)性好、結(jié)果便于不同實驗室進行比較，從而使全球的分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)標準化等優(yōu)點[8-9]。

當前，有關(guān)山東省沙門氏菌多位點序列分型的數(shù)據(jù)資料比較少，因此本實驗從山東省不同地區(qū)的養(yǎng)殖場收集雞源、鴨源和豬源三種不同動物源沙門氏菌進行分離鑒定，并選取沙門氏菌7對保守管家基因aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA、thrA，對沙門氏菌進行多位點基因序列分型，初步建立山東地區(qū)沙門氏菌MLST分型數(shù)據(jù)庫。同時檢測了分離菌株的血清型，并比較兩種方法的特點，從而分析山東地區(qū)的沙門氏菌的溯源和流行情況，為沙門氏菌病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 從山東省不同地區(qū)養(yǎng)殖場不同動物源收集動物的肛拭子、腦、心、肝、糞水和雞胚樣品，樣品來源如表1。取樣時每個養(yǎng)殖場舍取5份樣品分析。

表1 樣品來源
Tab.1 Samples sources

來源Origin濰坊菏澤煙臺德州泰安青島日照濱州臨沂濟南濟寧聊城雞源chicken205401015100103020000鴨源duck205040101000602555豬源swine501010000000000

1.2 細菌的分離鑒定和保存 將得到的樣品進行增菌培養(yǎng)，然后用無菌的接種環(huán)蘸取增菌液，劃線接種于沙門氏菌的科瑪嘉顯色培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng) 12～24 h。挑取疑似菌落，在SS培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上進行第二次劃線分離，37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h，進行再次鑒定，然后在LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)單菌落，接種LB液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床過夜培養(yǎng)。吸取700 μL培養(yǎng)的菌液加入到300 μL的滅菌的無菌甘油中振蕩混勻，放入-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 沙門氏菌血清分型的鑒定與分析 將沙門氏菌接種到固體瓊脂和軟瓊脂平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。參照沙門氏菌檢驗標準GB/T 4789.4-2010，利用沙門氏菌屬診斷血清試劑盒(寧波天潤，批號20170101)進行試驗。

挑取固體瓊脂平板上的菌落進行O相血清凝集：先在潔凈的玻片上滴加1～2滴診斷血清，然后用潔凈的槍頭挑取固體瓊脂平板上的菌落與滴加的血清混勻，輕輕搖動玻片，1 min之內(nèi)肉眼判斷結(jié)果是否為O抗原型。如果O抗原不凝集，將菌株接種在瓊脂含量較高的(如2%～3%)培養(yǎng)基上再檢查，如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O抗原凝集反應(yīng)時，可挑取菌落在1 mL生理鹽水中做成濃菌液，在酒精燈火焰上煮沸后檢查。之后再挑取軟瓊脂周邊擴散菌苔進行H相血清診斷，確定鞭毛抗原。

根據(jù)O相與H相的凝集結(jié)果，查閱沙門氏菌的血清分型表，確定沙門氏菌的抗原式和血清型。

1.4 沙門氏菌多位點序列分型(MLST)

1.4.1 MLST擴增引物的設(shè)計 根據(jù)PubMLST數(shù)據(jù)庫以及NCBI上公布的基因片段設(shè)計7個管家基因hisD、purE、sucA、aroC、thrA、dnaN、hemD的引物序列，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列如下表2所示：

表2 沙門氏菌7個管家基因的引物序列
Tab.2 Primer sequences of Salmonella seven housekeeping genes

基因Gene引物Primer基因大小LengthofgenethrAF5'-GTCACGGTGATCGATC-CGGT-3'852bpR5'-CACGATATTGATATT-AGCCCG-3'aroCF5'-CCTGGCACCTCGCGC-TATAC-3'826bpR5'-CCACACACGGATCGTG-GCG-3'dnaNF5'-ATGAAATTTACCGTT-GAACGTGA-3'833bpR5'-AATTTCTCATTCGAGAG-GATTGC-3'sucAF5'-AGCAC-CGAAGAGAAACGCTG-3'643bpR5'-GGTTGTTGATAACGAT-ACGTAC-3'hisDF5'-TCGCGTCTGTCGGTCTG-TAT-3'755bpR5'-GGCGCAGTATAGCCAT-AGGT-3'hemDF5'-ATGAGTATTCTGATCAC-CCG-3'666bpR5'-ATCAGCGACCTTA-ATATCTTGCCA-3'purEF5'-GACACCTCAAAAG-CAGCG-3'510bpR5'-CGAGAACGCAAACTT-GCTTC-3'

1.4.2 DNA的提取和PCR擴增 用細菌基因組DNA提取試劑盒(購自北京天根生物科技有限公司)，提取細菌DNA。多位點序列分型的PCR的反應(yīng)體系：10×Buffer(Mg2+)2.5 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 2 μL，上游引物(25 mnol/L) 0.5 μL，下游引物(25 mnol/L) 0.5μL，模板DNA 1 μL，EasyTaq DNA polymerse 0.5 μL，ddH2O 18 μL，總共25 μL的體系。PCR 擴增程序:94 ℃預(yù)變性 10 min，94 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，32個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.4.3 測序及測序結(jié)果分析 PCR結(jié)束之后進行凝膠電泳，并將膠回收產(chǎn)物交上海生物工程技術(shù)有限公司進行雙向測序。

將測序結(jié)果用DNA Star軟件根據(jù)Pub MLST的相關(guān)要求進行修正，使7個管家基因均符合國際上關(guān)于沙門氏菌多位點序列分型的序列大小要求，將修正好的7個管家基因序列與MLST數(shù)據(jù)庫中序列進行比對分析，分別獲取七個管家基因位點的等位基因數(shù)值，并形成相應(yīng)的等位基因譜，判斷其序列型。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株 總共分離鑒定得到154株沙門氏菌，動物來源和地理分布見表3。

從分離結(jié)果來看，不同地區(qū)的分離率有差異，這應(yīng)該與當?shù)氐酿B(yǎng)殖環(huán)境有關(guān)。另外，個別地區(qū)分離得到的菌株較少，這是由于取樣數(shù)量較少造成的。

2.2 血清型分型結(jié)果 154株動物源沙門氏菌中腸炎沙門氏菌數(shù)量最多，共有110株，占總的菌株數(shù)71.4%(110/154)；其次是鼠傷寒沙門氏菌32株、印第安納沙門氏菌4株、德貝兒沙門氏菌4株、湯卜遜沙門氏菌2株、山夫登堡沙門氏菌1株、阿格瑪沙門氏菌1株?？傮w來看腸炎型的沙門氏菌占據(jù)多數(shù)，其次為鼠傷寒沙門氏菌，其他的血清型呈現(xiàn)零星分布。具體分布如表4。

雞源總共檢測出6種血清型，其中腸炎沙門氏菌共有68株，占菌株的88.5%(68/78)；其次印第安納沙門氏菌4株、湯卜遜沙門氏菌2株、鼠傷寒沙門氏菌1株、山夫登堡沙門氏菌1株、阿格瑪沙門氏菌1株。

鴨源只檢測出2種血清型：腸炎沙門氏菌38株，占菌株的67.9%(38/56)；鼠傷寒沙門氏菌18株，占菌株的32.1%(18/56)。鼠傷寒沙門氏菌比例明顯高于雞源沙門氏菌。

豬源總共檢測出3種血清型，其中鼠傷寒沙門氏菌的共有13株，占能分型菌株的65%(13/20)；德貝兒沙門氏菌4株、腸炎沙門氏菌3株。

豬源鼠傷寒沙門氏菌比例最多，而腸炎沙門氏菌的數(shù)量則較少，這與雞源和鴨源分離情況不同。針對不同來源的血清型進行統(tǒng)計分析結(jié)果顯示存在統(tǒng)計學(xué)差異性(P=0.048)。

表3 各地區(qū)分離情況統(tǒng)計
Tab.3 Strains separated from different regions

來源Origin濰坊菏澤煙臺德州泰安青島日照濱州臨沂濟南濟寧聊城合計雞源chicken5011234237500078鴨源duck14101211001691156豬源swine172100000000020

表4 不同動物源沙門氏菌血清型鑒定結(jié)果
Tab.4 Serotype identification result of different animal origin Salmonella

來源Origin腸炎S.enteritidis鼠傷寒S.typhimurium德貝兒S.deby印第安納S.indiana湯卜遜S.thompson山夫登堡S.senftenberg阿格瑪S.agama雞源Chicken(78株)69(88.5%)1(1.3%)04(5.1%)2(2.6%)1(1.3%)1(1.3%)鴨源Duck(56株)38(67.9%)18(32.1%)00000豬源Swine(20株)3(15%)13(65%)4(20%)0000總計All(154株)1103244211

2.3 多位點序列分型結(jié)果 利用凝膠成像系統(tǒng)觀察，可見沙門氏菌的7個管家基因都能擴增到相應(yīng)的目的片段(如圖1所示)。目的的片段大小符合表1的預(yù)期值。

1.thrA; 2.sucA; 3.purE; 4.hemD; 5.hisD; 6.dnaN; 7.aroC; M.DNA Marker Trans 2K圖1 管家基因的PCR 擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of housekeeping gene

2.4 管家基因的測序結(jié)果和血清型結(jié)果 如表5和表6所示，雞源沙門氏菌分為6個血清型和7個ST型，其中以ST11為主，鴨源沙門氏菌分為2個血清型和3個ST型，其中以ST11為主，豬源沙門氏菌分為3個血清型和3個ST型，其中以ST34為主。總體來看，血清型的分型數(shù)目和ST型數(shù)目基本相當，這說明MLST與血清學(xué)分型的分型能力相近，兩者有著緊密的聯(lián)系。但是，MLST分型的分型更加詳細。

從表3-8中我們可以發(fā)現(xiàn)，雞源的沙門氏菌無論是血清型還是ST型，其在總數(shù)上都是分布范圍最廣的。此外，將分離菌的分型結(jié)果和其分離地區(qū)聯(lián)系起來，發(fā)現(xiàn)同一地區(qū)和同一養(yǎng)殖場所采樣品的分離菌株的血清型和ST型基本一致。同時，實驗還發(fā)現(xiàn)了兩種新的ST型，分別命名為New1和New2(表7)。

表5 不同動物源的菌株ST型和血清型數(shù)量的對比
Tab.5 Comparison between ST type and number of serotype

型別Type雞源chicken鴨源duck豬源swine血清型serotype623ST型STtype733

表6 不同動物源的菌株ST型和血清型數(shù)量的對比
Tab.6 Comparison between ST type and number of serotype

血清型serotypeST型STtypearoCdnaNhemDhisDpurEsucAthrA來源origin數(shù)量amount腸炎S.enteritidis1152376611雞chicken68New1521376611雞chicken11152376611鴨duck383007621559496765617281636豬swine3鼠傷寒S.typhimurium19107129592雞chicken119107129592鴨duck17New210712230592鴨duck1341019129592豬swine13湯卜遜S.thompson261413181214181雞chicken2阿格瑪S.agama1281071295552雞chicken1山夫登堡S.senftenberg14768879013雞chicken1印第安納S.indiana1788111151115雞chicken4德貝兒S.deby40192032052222豬swine4

表7 各地區(qū)ST型分布
Tab.7 ST type of different regions

來源Origin濰坊菏澤煙臺德州泰安青島日照濱州臨沂濟南濟寧聊城雞源chickenST11ST17New1ST11ST26ST128ST11ST11ST14ST11ST17ST11ST11ST19鴨源duckST19ST19ST11ST11ST11ST11ST19New2ST11ST19ST11豬源swineST34ST40ST3007ST3007ST34

3 討論與分析

3.1 流行病學(xué)特點 目前全球報道的沙門氏菌血清型達2 500種以上，我國已報道了 292種不同的血清型，分屬于35個O群[10]。而不同區(qū)域養(yǎng)殖的模式不同，沙門氏菌的分型特點也存在差異。

本文通過大范圍采樣檢測，表明山東省腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌占采樣的98%，雞鴨源腸炎沙門氏菌是主要流行菌株，豬源鼠傷寒沙門氏菌比例最多，而腸炎沙門氏菌的數(shù)量則較少，種屬特點很明顯。雞源沙門氏菌血清型和ST型遠多于鴨，鼠傷寒沙門氏菌、印第安納沙門氏菌、湯卜遜沙門氏菌、阿格瑪沙門氏菌和山谷登堡沙門氏菌均是少量存在，說明雞源沙門氏菌變異較大。湯卜遜沙門氏菌是在死亡雞胚中分離出的，而在1994年就有研究人員[11]從死亡的雞胚中分離出來了湯卜遜沙門氏菌。

王貴升等[12]在山東地區(qū)調(diào)查小規(guī)模養(yǎng)雞場沙門氏菌的流行分布，發(fā)現(xiàn)沙門氏菌70%為副傷寒沙門氏菌，同時也存在雞白痢沙門氏菌。陳培榮等人[13]在皖北地區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)肉種雞和蛋雞養(yǎng)殖場分離沙門氏菌的血清型主要是雞白痢沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌，其中雞白痢沙門氏菌占 57.6%，腸炎沙門氏菌占36.0%。這可能與種雞、商品雞以及流行階段的特點有關(guān)。

鴨源的沙門氏菌中以腸炎和鼠傷寒沙門氏菌為主要流行菌株，文獻中關(guān)于山東地區(qū)鴨源沙門氏菌的分型報告比較少，鐘傳德[14]等人對從中國各地區(qū)分離的鴨源沙門氏菌進行血清分型，發(fā)現(xiàn)腸炎型沙門氏菌61.8%，鼠傷寒沙門氏菌占31.9%；余曉龍等[15]從四川7個地區(qū)規(guī)?；唸龇蛛x鑒定到的48株沙門氏菌，其中鼠傷寒沙門氏菌占37.5%和腸炎型沙門氏菌占14.6%。皆與本文結(jié)果相似。

豬源沙門氏菌則以鼠傷寒沙門氏菌為主要流行菌株，德貝兒和腸炎沙門氏菌也存在少量的分布。這與劉鮮鮮等[16]在山東地區(qū)調(diào)查豬屠宰場屠宰環(huán)節(jié)沙門氏菌污染狀況時，發(fā)現(xiàn)德爾卑沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和湯卜遜沙門氏菌為主要的血清型也有相同之處，此外M Denis[17]等人從種豬和育肥豬場分離的沙門氏菌的血清型主要是德爾卑沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌，這說明不僅山東地區(qū)或國內(nèi)，乃至國外的豬源沙門氏菌血清型分布都有相似性。

上述比較說明沙門氏菌存在種屬和區(qū)域的流行大趨勢，也因為當?shù)氐臍夂蚝宛B(yǎng)殖環(huán)境存在明顯的差異，是指導(dǎo)區(qū)域性防治的重要依據(jù)。

3.2 MLST與血清分型的比較 多位點序列分型(MLST)作為一種常用的適合流行病學(xué)調(diào)查研究的方式，除了具備傳統(tǒng)方法的優(yōu)點，還可以更確切地進行種群的結(jié)構(gòu)以及生物進化方面的研究[18]。如表5，雞源沙門氏菌分為6個血清型和7個ST型，鴨源沙門氏菌分為2個血清型和3個ST型，豬源沙門氏菌分為3個血清型和3個ST型，存在密切的對應(yīng)關(guān)系：比如雞鴨ST11對應(yīng)的血清型是腸炎沙門氏菌，ST19為鼠傷寒沙門氏菌，ST14為山夫登堡沙門氏菌；豬ST40則為德貝兒沙門氏菌等。依據(jù)細菌的基因組特征和表型特征的不同來進行的分型有著高度的相關(guān)性。

如果僅從兩種分型的數(shù)量上看，兩種分型方式并沒有特別大的差距，但是通過Simpson指數(shù)(D值)可以評價兩種分型方法的能力，其中血清學(xué)分型方法D值為0.93，MLST分型方法D值為0.94，兩者結(jié)合在一起D值則為0.95。

究其原因，沙門氏菌在適應(yīng)動物內(nèi)環(huán)境和外環(huán)境的過程中，ST管家基因的點突變，導(dǎo)致ST型變化，如鼠傷寒沙門氏菌的ST19在雞鴨一致，而在hisD序號變化，則出現(xiàn)New2，但是鴨宿主特異性依然沒有改變；而在管家基因dnaN這一個管家基因的序號不同，導(dǎo)致豬和禽宿主差異性ST34；而當各個管家基因都不同時，才形成新的血清型，如雞的小比例血清型。腸炎沙門氏菌也存在同樣的規(guī)律，但是不同宿主ST的管家基因變化已經(jīng)面目全非了。另外，從地域看(表6)，不同地域之間的ST型的分布也有很大差距，說明在傳播過程中，沙門氏菌也在進行著進化變異。

兩種分型的結(jié)合能夠提供沙門氏菌流行感染的溯源和進化依據(jù)，揭示變異本質(zhì)。

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Distributionandtypingofanimal-derivedSalmonellawithMLSTandserotype

ZHAO Cui1, ZHANG Qing2, GUO Shu-yuan3, LI Lu-lu2, LIU Yu-jie4, WANG Yong-ming5, CHANG Wei-shan3, LIU Yu-qing2

(1.Tai’anCityAnimalHealthSupervisionCenterinShandongProvince,Tai’an271000,China;2.AnimalHusbandryandVeterinaryInstitute,ShandongAcademyofAgriculturalScience,Jinan250100,China; 3.AnimalScienceAcademyofShandongAgriculturalUniversity,Tai’an271018,China;4.AnimalEpidemicPreventionandControlCenterinRizhaoCity,Rizhao276800,China; 5.ShandongHuaHongBiologicalProductsCo.,Ltd.,Binzhou256600,China)

To compare the discriminatory ability of multilocus sequence typing and serotype of animal-derivedSalmonellaand find its distribution in Shandong Province, 78 chicken-origin, 56 duck-origin and 20 swine-originSalmonellawere separated from some regions of Shandong Province. Seven conserve sequences ofSalmonellawere PCR-amplified for MLST and slide agglutination test for serotyping. Results showed that by serotyping, 6 serotypes were identified from chicken-originSalmonella, including 88.5%S.enteritidis, 5.1%S.indiana, 2.6%S.thompson, 1.3%S.typhimurium, 1.3%S.senftenberg, 1.3%S.agama. Two serotypes were identified from duck-originSalmonella, including 67.9%S.enteritidis, 32.1%S.typhimurium. Three serotypes were identified from swine-originSalmonella, including 65%S.typhimurium, 20%S.derby, and 15%S.enteritidis. By MLST typing, seven ST types were identified from chicken-originSalmonella: ST11, ST19, ST26, ST128, ST14, ST17 and New1. Three ST types were identified form duck-originSalmonella: ST11, ST19 and New2.

Three ST types were identified from swine-originSalmonella: ST34, ST40 and ST3007. Overall, the types identified with two methods were closed, so MLST and serotype have similar discriminatory ability.

Salmonella; serotype; MLST; typing Supported by the Shandong Provincial Major Projects of Independent Innovation, Shandong Dhicken Public Health Model Establishment and Demonstration, Shandong Academy of Agricultural Science and Technology Innovation Project (No. CXGC2016A10)

Liu Yu-qing, Email: liuiuqing@163.com

1.山東省泰安市動物衛(wèi)生監(jiān)督所,泰安 271000； 2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，泰安 250100； 3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)院，濟南 271018； 4.山東省日照市動物疫病預(yù)防控制中心，日照 276800； 5.山東華宏生物工程有限公司，濟南 256600

R183.1

：A

：1002-2694(2017)09-0793-07

2017-03-13編輯：劉岱偉

山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(CXGC2016A10)，山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項目(SDAIT-11-09)

通迅作者：劉玉慶，Email: liuiuqing@163.com