感染華支睪吸蟲后小鼠肝臟的病理學(xué)觀察

潘鈺　榮瑋　李致慧　孫秀麗　王丹娜　孫艷宏

【摘要】 目的：了解小鼠感染華支睪吸蟲后肝臟的病理變化，為研究華支睪吸蟲的致病機(jī)制提供參考依據(jù)。方法：胃蛋白酶消化法獲取華支睪吸蟲囊蚴，人工灌胃法感染小鼠，采用病理學(xué)方法取材、固定及染色，觀察小鼠肝臟的病理學(xué)變化。結(jié)果：不同感染時(shí)間的炎癥反應(yīng)程度存在差異，出現(xiàn)纖維組織增生、膽管壁增厚、嗜酸性囊腫等病理學(xué)現(xiàn)象。結(jié)論：小鼠感染華支睪吸蟲后肝臟出現(xiàn)了顯著的病理學(xué)改變，這種現(xiàn)象對(duì)于研究人體內(nèi)華支睪吸蟲的致病作用具有一定的參考價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 華支睪吸蟲； 囊蚴； 病理變化

Pathological Observation of Liver in Mice Infected with Clonorchis Sinensis/PAN Yu，RONG Wei，LI Zhi-hui，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（30）：015-018

【Abstract】 Objective：To investigate the pathological changes of liver in mice infected with clonorchis sinensis，and to provide the scientific basis for the study of pathogenicity of clonorchis sinensis.Method：The pepsin digestion method was used to obtain metacercaria of clonorchis sinensis，the artificial gastric irrigation was used to infect mouse，the liver tissues were taken from the mice after infection for pathological examination，the procedure included the fixed of body，paraffin section and staining，observed the pathologic changes by microscope.Result：There were differences in the degree of inflammatory reaction at different infection times，pathological changes such as fibrous tissue hyperplasia，eosinophilic cyst，the walls of hepatic bile ducts had thickened and so on.Conclusion：After the mice infected with clonorchis sinensis，the liver showed a remarkable pathological change，and this phenomenon have a certain reference value for the study of the pathogenic role of clonorchis sinensis in human body.

【Key words】 Clonorchis sinensis； Metacercaria； Pathological change

First-authors address：Qiqihar Medical University，Qiqihar 161006，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.30.005

華支睪吸蟲?。–lonorchiasis sinensis）俗稱肝吸蟲病，是一種重要的食源性寄生蟲病，可引起多種肝臟及膽管系統(tǒng)并發(fā)癥。WHO國際癌癥研究署明確膽管細(xì)胞癌的致癌物包括華支睪吸蟲，成為了全球被忽視的熱帶病之一，給感染者造成明顯的生命質(zhì)量損失，成為影響食品安全和人民健康的重要因素之一[1-3]。中國作為華支睪吸蟲病負(fù)擔(dān)最為嚴(yán)重的國家和感染的高發(fā)國家之一[4-6]，需要加強(qiáng)相關(guān)研究工作。本研究觀察小鼠感染華支睪吸蟲后肝臟的病理變化，為研究華支睪吸蟲的致病機(jī)制提供參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)小鼠，由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2 囊蚴來源 胃蛋白酶消化法獲取淡水魚（麥穗魚）體內(nèi)囊蚴，鑒定分離后保存于生理鹽水中備用。

1.1.3 試劑與儀器 胃蛋白酶Pepsin（活性1∶3000）（上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司），生理鹽水，5%～10%甲醛溶液，HE染液，雙目顯微鏡（日本，OLYMPUS），60、80、100目標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩（上海尚篩機(jī)械制造有限公司），12號(hào)小鼠灌胃針（北京凱輝盛達(dá)科技發(fā)展有限公司），絞肉機(jī)（慈溪市寧匯電器有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 囊蚴的獲取 提取麥穗魚脊背部魚肉（將陽性魚用清水洗滌數(shù)次后，去除魚鰭、魚頭、魚皮及內(nèi)臟，分離魚肉），絞肉機(jī)粉碎后放入配置好的消化液內(nèi)消化（消化時(shí)，須先將消化液預(yù)熱，然后放入37 ℃溫箱中消化，消化過程中需用玻璃棒攪拌消化液數(shù)次），消化后的魚肉經(jīng)過分離篩過濾、生理鹽水洗滌、分離數(shù)次后獲取囊蚴，生理鹽水內(nèi)4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 小鼠分組 按照隨機(jī)分配的原則30只小鼠被分成感染組（25只）和對(duì)照組（5只）。通過灌喂囊蚴30～40個(gè)/只的方式感染小鼠。選擇早晨小鼠空腹時(shí)進(jìn)行灌胃，1 mL的注射器安裝12號(hào)灌胃針頭，用生理鹽水沖洗2～3次；室溫放置保存于生理鹽水中的華支睪吸蟲囊蚴幾分鐘后，用吸管將其吸出，放入玻璃平皿中，然后吹打玻璃平皿內(nèi)的囊蚴，用蒸餾水沖洗幾次后進(jìn)行灌胃[7]。endprint

1.2.3 華支睪吸蟲的鑒別 取肝臟，反復(fù)生理鹽水沖洗后從肝臟近肝門區(qū)剪開肝臟，再用手輕輕擠壓肝臟，一般擠壓方向從肝臟邊緣向中央進(jìn)行，可反復(fù)擠壓幾次，這時(shí)從擠出的膽汁中可發(fā)現(xiàn)蟲體。用毛筆柔軟的細(xì)毛輕輕挑起蟲體至生理鹽水中，或直接用吸管吸起蟲體放入生理鹽水中，但需要生理鹽水反復(fù)沖洗幾次蟲體，以去除表面的膽汁，然后蒸餾水清洗，使蟲體表面潔凈，最后平整放在載玻片中央，鏡下觀察，進(jìn)行華支睪吸蟲的形態(tài)鑒別

1.2.4 肝膽組織病理標(biāo)本的采集 感染后第10、20、30天頸椎脫位處死所有小鼠（包括感染組和對(duì)照組），無菌條件下，快速獲取兩組小鼠的肝膽系統(tǒng)標(biāo)本。

1.2.5 病理學(xué)觀察 常規(guī)方法進(jìn)行病理學(xué)檢測，標(biāo)本均采用5%的甲醛溶液固定；然后進(jìn)行石蠟切片；最后通過常規(guī)HE染色后，鏡下觀察兩組小鼠肝膽系統(tǒng)的病理學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 小鼠形態(tài)觀察 （1）灌喂前觀察：兩組小鼠的體態(tài)、食欲及活動(dòng)情況均無差別。（2）感染后觀察：感染組小鼠灌喂囊蚴后，在短暫的適應(yīng)期后，體態(tài)、食欲及活動(dòng)情況無特別顯著變化，但在1周后，尤其在感染囊蚴10 d左右時(shí)變化明顯，出現(xiàn)生長緩慢，精神萎靡，食欲減退，活動(dòng)減慢等現(xiàn)象；而對(duì)照組小鼠灌喂生理鹽水后，體態(tài)、食欲及活動(dòng)情況均無明顯變化。

2.2 肝臟表面觀察 對(duì)照組小鼠肝臟表面光滑，飽滿紅潤，膽管乳白色且粗細(xì)均勻，膽汁清亮，見圖1。感染組小鼠肝臟腫大，表面密布白色結(jié)節(jié)，手感粗糙，顏色深淺不一，肝外膽管直徑明顯增粗，剪破膽管發(fā)現(xiàn)管壁明顯增厚，管壁內(nèi)的黏稠物呈現(xiàn)褐色、血色或黃綠色，向破口方向擠壓肝膽管，大量華支睪吸蟲成蟲隨之流出，見圖2。

2.3 病理學(xué)觀察 對(duì)照組小鼠肝臟病理標(biāo)本的肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，中央靜脈位于肝小葉的中央位置，其周圍的肝板呈放射狀排列，肝血竇位于肝板之間，門管區(qū)也清晰可見，此外。還可觀察到整齊分布的膽管上皮細(xì)胞，見圖3、4。觀察感染第10天的小鼠肝臟病理標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，大量的炎細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，膽管增生明顯，膽管上皮細(xì)胞也出現(xiàn)了部分壞死脫落現(xiàn)象，在其周圍的纖維組織出現(xiàn)了輕度的增生，炎性細(xì)胞浸潤中以嗜酸性粒細(xì)胞為主，見圖5。觀察感染第20天的小鼠肝臟病理標(biāo)本：肝吸蟲蟲體的切面及葵花籽狀的肝吸蟲蟲卵在膽管內(nèi)清晰可見。由于有大量蟲體及蟲卵在膽管內(nèi)的寄生，導(dǎo)致了膽管向周圍明顯的擴(kuò)張，加上蟲體及蟲卵對(duì)膽管上皮細(xì)胞的刺激作用，使其出現(xiàn)了不同程度的增生，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)管腔邊緣參差不齊，突出呈乳頭狀。此外，由于蟲體的寄生導(dǎo)致了部分肝小葉的結(jié)構(gòu)遭到破壞，部分膽管上皮細(xì)胞出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的壞死脫落現(xiàn)象，在其周圍的纖維組織出現(xiàn)了中度的增生，炎性細(xì)胞浸潤中仍然以嗜酸性粒細(xì)胞為主，而且局部形成了嗜酸性膿腫，見圖6。觀察感染第30天的小鼠肝臟病理標(biāo)本：膽管上皮細(xì)胞脫落更為嚴(yán)重，膽管呈囊性擴(kuò)張，嚴(yán)重?cái)U(kuò)張的膽管附近出現(xiàn)了肝細(xì)胞萎縮現(xiàn)象，大量上皮細(xì)胞開始變性、壞死、崩解、脫落。鏡下觀察膽管結(jié)構(gòu)，部分區(qū)域不清晰，炎性細(xì)胞浸潤更為明顯，部分肝細(xì)胞已經(jīng)壞死，見圖7。

3 討論

華支睪吸蟲病是一種重要的食源性寄生蟲病，關(guān)乎國計(jì)民生，是我國“十二五”規(guī)劃重點(diǎn)防治的重點(diǎn)寄生蟲病之一[8]，其主要寄生于人和保蟲宿主的肝膽管內(nèi)，引起肝臟損傷、膽道病變、肝硬化、甚至誘發(fā)肝癌，尤其是膽管細(xì)胞癌[9-10]。感染華支睪吸蟲后可致宿主腸道菌群失調(diào)，破壞腸道的生理屏障[11]，本實(shí)驗(yàn)中小鼠感染華支睪吸蟲后，出現(xiàn)了食欲逐漸減退，活躍度降低等現(xiàn)象。

華支睪吸蟲引起病變的主要原因是由于大量蟲體的機(jī)械性刺激、壓迫及其分泌物和代謝產(chǎn)物引起膽管上皮脫落、增生，導(dǎo)致管壁增厚、管腔狹窄，引起膽汁流通不暢，易合并細(xì)菌感染，出現(xiàn)膽道炎癥，嚴(yán)重時(shí)可引起癌變。成蟲長時(shí)間寄生于肝膽管內(nèi)，刺激膽管內(nèi)膜及膽管周圍組織，引起了不同程度的炎性反應(yīng)及過敏反應(yīng)。而且死亡蟲體碎片、蟲卵、膽管上皮脫落細(xì)胞可引起膽管結(jié)石，出現(xiàn)膽石癥[12]。當(dāng)大量蟲體長時(shí)間寄生蟲后，感染會(huì)更加嚴(yán)重，肝細(xì)胞的萎縮和變性現(xiàn)象及其周圍纖維組織的增生均可出現(xiàn)在門脈區(qū)周圍，甚至出現(xiàn)膽汁性肝硬化。

華支睪吸蟲病的主要危害性在于肝臟受損。文獻(xiàn)[13-14]中報(bào)道，長爪沙鼠感染華支睪吸蟲后，出血、淤血和間質(zhì)性炎癥反應(yīng)現(xiàn)象在感染的后第2天就在肝臟被發(fā)現(xiàn)；小膽管和成纖維細(xì)胞的增生出現(xiàn)在感染的第10天；感染第15天匯管區(qū)出現(xiàn)了大量的膽汁堵塞淤積現(xiàn)象。另據(jù)報(bào)道，豚鼠感染華支睪吸蟲后，病理觀察發(fā)現(xiàn)，在感染第19天～2個(gè)月后的豚鼠出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)混亂的肝小葉，小膽管與結(jié)締組織出現(xiàn)了增生[15]。研究顯示，宿主的肝膽管內(nèi)是華支睪吸蟲成蟲的主要寄生部位，其致病機(jī)制主要包括蟲體運(yùn)動(dòng)時(shí)的機(jī)械刺激，蟲體分泌物及代謝產(chǎn)物引起的免疫反應(yīng)，造成了肝組織的免疫損傷，由此引起肝臟組織發(fā)生相應(yīng)的病理變化，導(dǎo)致膽管炎、膽囊炎及其他炎癥性病變。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，感染華支睪吸蟲后，小鼠肝臟受損嚴(yán)重，病理形態(tài)學(xué)變化明顯。感染后肝臟及肝膽管的病理變化與感染程度及感染時(shí)間呈正相關(guān)：感染早期程度相對(duì)較輕，大體解剖見病變輕度，但呈廣泛彌漫性改變。盡管膽管增生明顯，出現(xiàn)了部分膽管上皮細(xì)胞的壞死脫落現(xiàn)象，但周圍纖維組織的增生程度較輕，以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤為主。感染20 d左右時(shí)，解剖見肝內(nèi)膽管壁增厚，膽管擴(kuò)張明顯，膽管上皮均有不同程度的增生，主要原因在于成蟲寄生時(shí)的粘附以及分泌物和排泄物的刺激導(dǎo)致。膽管內(nèi)可見華支睪吸蟲蟲體及蟲卵，部分膽管上皮細(xì)胞壞死脫落，周圍有中度纖維組織增生，肝臟淤血嚴(yán)重，膽管上皮細(xì)胞排列不規(guī)則出現(xiàn)水腫、壞死現(xiàn)象，局部形成嗜酸性膿腫。感染30 d后，大體解剖見大量的結(jié)節(jié)狀凸起出現(xiàn)在了肝臟表面，病理組織標(biāo)本觀察發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)出現(xiàn)廣泛病變且明顯，膽管呈現(xiàn)高度擴(kuò)張，肝細(xì)胞萎縮現(xiàn)象出現(xiàn)在膽管周圍，大量蟲體聚集在肝膽管內(nèi)，導(dǎo)致了管道的阻塞和膽汁的滯留，如若合并細(xì)菌感染，膽管炎、膽管肝炎等炎癥反應(yīng)將隨之出現(xiàn)。鏡下還可發(fā)現(xiàn)膽管已經(jīng)呈現(xiàn)囊性擴(kuò)張，大量上皮細(xì)胞出現(xiàn)變性、壞死、崩解、脫落現(xiàn)象，甚至部分區(qū)域的膽管結(jié)構(gòu)鏡下不清晰。endprint

綜上所述，小鼠感染華支睪吸蟲囊蚴后，無論是小鼠的體態(tài)、食欲及活動(dòng)情況等肉眼所見，還是從病理學(xué)角度觀察感染不同時(shí)間的小鼠肝臟及肝膽管，均出現(xiàn)了明顯的變化，對(duì)于研究在人體感染華支睪吸蟲后肝膽管出現(xiàn)的病理變化具有一定的借鑒意義和參考價(jià)值。

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（收稿日期：2017-05-23） （本文編輯：董悅）endprint