貴州省2013-2021年羊種布魯氏菌分離株的多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析

王 月，譚勤琴,2，劉 英，楊幸貴,2，營(yíng) 夏,2，馬 青，韋小瑜，李世軍

布魯氏菌(Brucella)是一類胞內(nèi)寄生的革蘭陰性菌，主要引起人獸共患性布魯氏菌病(Brucellosis，簡(jiǎn)稱布病)[1-2]。FAO/WHO依據(jù)布魯氏菌屬細(xì)菌的生化特性及宿主偏好性將其分為6個(gè)經(jīng)典種，19個(gè)生物型。羊種、牛種和豬種布魯氏菌是人類感染布病的主要病原體[1]，貴州省布病疫情主要由羊種導(dǎo)致[3]。布魯氏菌病原體可通過(guò)體表粘膜、消化道、呼吸道侵入機(jī)體，而人感染布病的途徑通常與職業(yè)、飲食、生活習(xí)慣相關(guān)[1]。自2010年，“千萬(wàn)只肉羊”工程在貴州省啟動(dòng)，及后續(xù)“十二五規(guī)劃”提出的“著力打造一批規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化、產(chǎn)業(yè)化的優(yōu)質(zhì)肉豬、肉羊、肉牛及地方特色畜禽生產(chǎn)基地，努力建設(shè)生態(tài)畜牧業(yè)大省”，使得我省養(yǎng)羊業(yè)獲得長(zhǎng)足發(fā)展[4]。貴州省于2010年首次從貴州省山羊血液分離到羊種布魯氏菌[5]，到2015年，貴州省布病疫情已覆蓋貴陽(yáng)、 黔南、黔東南、銅仁、遵義、黔西南、六盤(pán)水、安順和畢節(jié)9個(gè)市/州及貴安新區(qū)，僅部分縣未報(bào)道過(guò)布病疫情[6]，防控形勢(shì)嚴(yán)峻。

布魯氏菌種間同源性高[7]，表型分析無(wú)法對(duì)其進(jìn)行關(guān)聯(lián)性研究，多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(Multiple locus variable-number tandem repeat analysis，MLVA)技術(shù)可克服這方面的缺陷，其分型數(shù)據(jù)可在MLVA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)共享和分型鑒定，具有分辨率佳、重復(fù)性好、可比性高的特點(diǎn)[8-10]。MLVA分型技術(shù)基于非感染性核酸材料[11]，降低操作人員的感染風(fēng)險(xiǎn)，被廣泛用于分子流行病學(xué)調(diào)查及溯源分析[12-14]。本研究采用MLVA-16方法對(duì)貴州省78株羊種布魯氏菌本地株進(jìn)行分子分型分析，以期發(fā)現(xiàn)貴州省羊種布魯氏菌間的關(guān)聯(lián)性，為貴州省布病疫情的科學(xué)防控提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 貴州省疾病預(yù)防控制中心布病實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定及保存的羊種布魯氏菌菌株(2013-2021年)，總計(jì)78株。

1.2 主要儀器與試劑 主要儀器有PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Thermo)、凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad)等。主要試劑有布魯氏菌瓊脂培養(yǎng)基(美國(guó)BD)、引物及配套PCR試劑(北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司)。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)及DNA提取 將實(shí)驗(yàn)室保存菌株嚴(yán)格按照《2019布魯氏菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS269-2019)》的操作程序接種于布魯氏菌瓊脂平板上，置37 ℃ CO2培養(yǎng)箱，根據(jù)細(xì)菌的生長(zhǎng)情況培養(yǎng)24～48 h。挑取布魯氏菌菌落研磨制成菌懸液，經(jīng)煮沸法提取菌株核酸[3]，同時(shí)提取疫苗株M5、A19、S2的核酸作試驗(yàn)用陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 布魯氏菌的復(fù)判 用布魯氏菌屬特異性基因BCSP-31[15]對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，疫苗株M5、A19及S2 核酸作陽(yáng)性對(duì)照，純水為陰性對(duì)照。依據(jù)文獻(xiàn)[16]使用的B4和B5引物序列及擴(kuò)增參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 布魯氏菌株種型的復(fù)判 采用基于布魯氏菌屬特異性插入序列IS711[17]建立的多重PCR技術(shù)對(duì)78株分離菌進(jìn)行種/型鑒定[18]，疫苗株M5、A19及S2核酸作陽(yáng)性對(duì)照，純水作陰性對(duì)照。依據(jù)文獻(xiàn)[19]使用的引物序列和擴(kuò)增參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6 布魯氏菌株MLVA-16分型 78株布魯氏菌株根據(jù)文獻(xiàn)[20]使用的16個(gè)位點(diǎn)引物及擴(kuò)增參數(shù)擴(kuò)增。MLVA-16包括panel 1、panel 2A和panel 2B，共16個(gè)位點(diǎn)，MLVA-8即panel 1的所有8個(gè)位點(diǎn)，用于布魯氏菌種的分析。Panel 1(06、08、11、12、42、43、45及55 )各位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行瓊脂凝膠電泳，挑取差異序列送北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。對(duì)測(cè)得序列進(jìn)行整理，去除側(cè)翼序列得到該位點(diǎn)的串聯(lián)重復(fù)序列，通過(guò)換算，得到該序列的重復(fù)串聯(lián)數(shù)值。Panel 2包括 panel 2A(18、 19、21)和panel 2B(04、07、09、16、30)，各位點(diǎn)采用FAM基團(tuán)標(biāo)記引物進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物送公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳，結(jié)果參照Panel 2各位點(diǎn)重復(fù)單元長(zhǎng)度及重復(fù)數(shù)目換算表得到重復(fù)數(shù)值。

1.7 MLVA基因型分析 將MLVA基因型數(shù)值輸入MLVAbank(http//mcrobes genotyping.i2bc.paris-saclay.fr/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)確定其MLVA-8的基因型。用 BioNumerics (Version 8.0)軟件對(duì)78株羊種菌分離株MLVA基因型進(jìn)行聚類分析，聚類方式用非加權(quán)組平均法 (UPGMA)，構(gòu)建聚類分析樹(shù)狀圖和最小生成樹(shù)(Minimum spanning tree，MST)。

2 結(jié) 果

2.1 BCSP31-PCR的復(fù)判結(jié)果 除陰性對(duì)照外，78株菌株核酸及疫苗株核酸的的擴(kuò)增產(chǎn)物均產(chǎn)生分子量約為223 bp的條帶，判為布魯氏菌屬細(xì)菌。

2.2 AMOS-PCR對(duì)布魯氏菌種/型的復(fù)判結(jié)果 78株本地分離株和M5的擴(kuò)增產(chǎn)物均出現(xiàn)分子量約為731 bp和178 bp的條帶，鑒定為羊種布魯氏菌，陰性對(duì)照無(wú)特異條帶出現(xiàn)。

2.3 MLVA-8分型結(jié)果 78株羊種布魯氏菌基于MLVA-8分型被分為5種型(即42、43、45、58和1種未分類型)，以42、43型為主，二者占總數(shù)91.03%，見(jiàn)表1。42型在全省7個(gè)市/州均有分布，分布最廣。黔西南地區(qū)分布著4種MLVA-8基因型，多樣性較高，且出現(xiàn)一種新基因型(1-5-3-12-3-1-3-2)，見(jiàn)表2。

表1 78株羊種布魯氏菌的MLVA-8 基因型別及百分比Tab.1 MLVA-8 genotypes and percentages of 78 B. melitensis strains

表2 78株羊種布魯氏菌MLVA-8基因型的地區(qū)分布Tab.2 Regional distribution of MLVA-8 genotypes of the 78 B. melitensis strains

2.4 MLVA-16分型結(jié)果 78株羊種布魯氏菌基于MLVA-16分型數(shù)據(jù)構(gòu)建聚類分析樹(shù)狀圖，分為4個(gè)群，46種MLVA-16基因型，單基因型分離株32株，余46株構(gòu)成14種MLVA-16基因型(圖1)。 MLVA-16基因型的地區(qū)分布中，遵義市16種，黔東南州11種，該2地為貴州省MLVA-16基因型多樣性主要聚集地(表3)。78株羊種菌基于MLVA-16分型數(shù)據(jù)并以每個(gè)節(jié)點(diǎn)相同位點(diǎn)最大距離為1構(gòu)建MST，78株分離株被分為8個(gè)遺傳復(fù)合體和14個(gè)單體，遵義與黔東南、黔南及畢節(jié)地區(qū)的菌株間均存在共享基因型，同一地區(qū)年份相近的菌株基因型之間的遺傳距離也很近(圖2)。

圖1 貴州省78株羊種布魯氏菌的MLVA-16聚類分析樹(shù)狀圖Fig.1 Dendrogram based on MLVA genotyping analysis (UPGMA method), showing the correlations among 78 B. melitensis strains

表3 78株羊種布魯氏菌MLVA-16基因型的地區(qū)分布Tab.3 Regional distribution of MLVA-16 genotypes of the 78 B. melitensis strains

圖2 貴州省78株羊種布魯氏菌MLVA基因型聚類分析的MST圖Fig.2 Clustering analysis MST (minimum spanning tree) mapping based on MLVA genotype data for 78 B. melitensis strains

3 討 論

貴州省布病疫情的擴(kuò)大蔓延，是由于近年來(lái)貴州省養(yǎng)羊業(yè)迅猛發(fā)展，大量從省外引種[21]，加之養(yǎng)殖模式大多為散養(yǎng)和小規(guī)模養(yǎng)殖，散養(yǎng)戶對(duì)布病的認(rèn)知及防治知識(shí)匱乏，自我保護(hù)技能欠缺，導(dǎo)致疫情形勢(shì)嚴(yán)峻[6]。

羊種布魯氏菌是貴州省布病疫情的主要病原體，本研究對(duì)2013-2021年間貴州省78株羊種菌進(jìn)行MLVA基因分型，基于MLVA-8分型數(shù)據(jù)分為5種基因型(即42、43、45、58和1種未分類型)。42及43型占總數(shù)91.03%，屬省內(nèi)羊種布魯氏菌優(yōu)勢(shì)基因型，國(guó)內(nèi)研究者研究證明該2種基因型也是國(guó)內(nèi)布魯氏菌的優(yōu)勢(shì)基因型[22-28]，證實(shí)貴州省羊種布魯氏菌流行株與國(guó)內(nèi)流行株一致。貴州省羊種布魯氏菌已鑒定的MLVA-8基因型均屬于“東地中海型”，即其地理起源可能相同。黔西南地區(qū)布魯氏菌的分離株存在4種MLVA-8基因型，基因型多樣性較高，鑒于MLVA-16的panel 1模塊位點(diǎn)的變異度較低，提示該地可能存在多個(gè)布魯氏菌傳染源。黔南及黔西南鄰近云南及廣西2省，廣西、云南均鑒定出布魯氏菌58型[26,28]，在山西、青海均有布魯氏菌45型的分布[26-27]，基因型的一致性提示疫情病原菌間存在一定關(guān)聯(lián)性，可能為與鄰省間的畜牧貿(mào)易活動(dòng)相關(guān)，故應(yīng)加強(qiáng)畜牧貿(mào)易活動(dòng)的監(jiān)管，同時(shí)嚴(yán)格執(zhí)行動(dòng)物的檢驗(yàn)檢疫。未明確分類的MLVA-8型(1-5-3-12-3-1-3-2)分離于2016年，此后未再檢出該基因型，提示布魯氏菌可能為適應(yīng)不同的自然地理環(huán)境而改變了其基因型[29]。

基于MLVA-16分型數(shù)據(jù)，78株羊種菌分離株聚為4個(gè)基因群(A-D)，分為46種基因型，親緣關(guān)系較近(≥73.9)，單基因型菌株32株,余46株構(gòu)成14種共享基因型，證實(shí)貴州省羊種布魯氏菌分離株MLVA基因型具有型別多樣性。MLVA-16基因型的地區(qū)分布中，遵義及黔東南州分布的基因型最多，提示這2地的布病疫情可能存在多個(gè)傳染源。MST圖顯示，相鄰時(shí)間段，相鄰地區(qū)流行的基因型遺傳距離較近，提示貴州省省內(nèi)布病疫情流行株的基因型未發(fā)生較大改變，遵義與黔南、黔東南、畢節(jié)等地的布魯氏菌流行株間的共享基因型，從時(shí)間維度(遵義疫情早于其他地區(qū)疫情)及基因型角度，揭示布病疫情可能存在從遵義擴(kuò)散導(dǎo)致的省內(nèi)傳播。2015年之后，貴州南部(黔東南、黔南、黔西南)相繼出現(xiàn)聚集性布病疫情，其基因型與遵義疫情基因型間的遺傳距離較遠(yuǎn)，而與臨省廣西、云南的MLVA-8基因型一致，提示可能為省外輸入性導(dǎo)致的聚集性布病疫情。

布魯氏菌的MLVA分型分析對(duì)于布病疫情判斷及防控具有重要意義，貴州省羊種布魯氏菌分離株經(jīng)MLVA分析發(fā)現(xiàn)，貴州省布病疫情可能存在以遵義為中心的省內(nèi)傳播及來(lái)自省外輸入傳播的多條傳播鏈。相關(guān)部門(mén)需要做好布病疫情的外防輸入，內(nèi)防擴(kuò)散，衛(wèi)生疾控部門(mén)與動(dòng)物防疫部門(mén)應(yīng)加強(qiáng)聯(lián)防聯(lián)控，對(duì)于外防輸入，須嚴(yán)格加強(qiáng)對(duì)跨地區(qū)動(dòng)物檢疫，對(duì)于內(nèi)防擴(kuò)散，加強(qiáng)疫情監(jiān)測(cè)是相關(guān)部門(mén)需要關(guān)注的防控重點(diǎn)。

利益沖突：無(wú)