布魯氏菌病新型疫苗研究進展

劉晨芳, 翟景波, 梁 晨, 德恩金, 張國慶, 王立軍, 梁秀文

布魯氏菌病(簡稱布病)是一個世界范圍內(nèi)重大公共衛(wèi)生問題，是由布魯氏菌屬侵入機體，引起的傳染-變態(tài)反應性的人獸共患傳染病，在8種最容易被忽視的人獸共患疾病中排名第3[1]，同時也是《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定報告的乙類傳染病。布魯氏菌主要通過破損的皮膚黏膜、消化道和呼吸道等途徑傳播，人類患病后主要表現(xiàn)為發(fā)熱、多汗、乏力、關(guān)節(jié)疼痛等多樣化癥狀，且容易遷延累及多個系統(tǒng)成為慢性虛弱性疾病，動物患病后主要表現(xiàn)為流產(chǎn)、睪丸炎、附睪炎。

布魯氏菌病的流行為人類、動物健康及畜牧業(yè)發(fā)展帶來極大威脅及經(jīng)濟損失，作為一種傳染性疾病，控制布病疫情流行最有效的手段之一是接種疫苗。目前尚無被批準用于人類的布病疫苗[2]，人與受感染的家畜接觸往往是最常見的患病途徑，因此，控制布魯氏菌病等人獸共患疾病需要“同一健康”的理念，人類布魯氏菌病可以通過控制或根除動物布魯氏菌病的途徑得到最大程度的控制[3]。自20世紀初人們就開始了關(guān)于預防人和動物布病的疫苗研究[4]，目前使用最為廣泛的布病疫苗為減毒活疫苗，如國外廣泛使用的B.abortusS19、B．melitensisRev1疫苗及我國的B．suisS2、B.abortusA19、B．melitensisM5疫苗[5-6]，這些疫苗在控制布魯氏菌病方面是具有很大成效，但存在干擾診斷試驗、對人類具有致病性、可能導致懷孕動物流產(chǎn)等缺點[2]，因此研制有效而安全的布魯氏菌病疫苗一直是科學家面臨的一項挑戰(zhàn)。

按照研發(fā)技術(shù)來分，疫苗可分為傳統(tǒng)疫苗和新型疫苗。傳統(tǒng)疫苗包括滅活疫苗和減毒活疫苗，其成分一般包含整個病原體。近年來，隨著分子微生物學、基因工程等生物技術(shù)的發(fā)展，研發(fā)與減毒活疫苗具有同等或更高保護效力的新型布病疫苗成為熱點，這些疫苗主要包括重組蛋白疫苗、核酸疫苗(DNA疫苗和RNA疫苗)、基因缺失疫苗、病毒樣顆粒疫苗、載體疫苗等，這些疫苗的免疫原性及保護水平主要在小鼠模型中評估(表1)。

1 重組蛋白疫苗

重組蛋白疫苗是將病原體的目的抗原基因構(gòu)建在表達載體上，將已構(gòu)建的表達蛋白載體轉(zhuǎn)化到細菌、酵母或哺乳動物或昆蟲細胞中，進行大量培養(yǎng)，在一定的誘導條件下，表達出大量的抗原蛋白，通過純化后制備成疫苗。重組蛋白疫苗的優(yōu)點在于安全性高，不需要分離獲得菌株，再培養(yǎng)細菌來進行制造，只需要通過生物工程技術(shù)表達、純化布魯氏菌的抗原蛋白，不會引起疫苗生產(chǎn)者的感染及周圍環(huán)境的污染。目前已有許多關(guān)于布魯氏菌重組蛋白疫苗的相關(guān)研究，這些疫苗的免疫原性及保護力也被證實具有一定效果。重組蛋白疫苗研發(fā)的關(guān)鍵在于選擇合適的抗原。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的布魯氏菌相關(guān)蛋白有上千種，其中與布魯氏菌毒力及免疫原性密切相關(guān)的有外膜蛋白(OMPs)，Ⅳ型分泌系統(tǒng)相關(guān)蛋白，還有胞質(zhì)蛋白，尤其是外膜蛋白，因為它們是最早與宿主接觸的成分，因而成為布魯氏菌疫苗重要的候選抗原[7]。目前研究比較多的蛋白為Omp31、Omp28、Omp25、Omp19、Omp16、核糖體蛋白 L7/L12、IV 型分泌系統(tǒng)相關(guān)的蛋白 Vir B12 和胞質(zhì)結(jié)合蛋白 P39等。

有研究表明選取多個抗原表位的疫苗比單一抗原可能會誘導更高水平的免疫保護，通常僅由一種抗原組成的疫苗不能有效地預防布魯氏菌感染。Yahya等[8]構(gòu)建了rOmp25-Omp31重組蛋白疫苗，在BALB/c小鼠體內(nèi)誘導了較高水平的IFN-γ和TNF-α，結(jié)果提示該疫苗免疫后小鼠產(chǎn)生了較強的Th1型免疫應答傾向；Gupta等[9]構(gòu)建了Omp25和L7/L12的雙價重組疫苗，并對單獨和聯(lián)合使用的疫苗潛力進行了評估，結(jié)果表明免疫雙價疫苗的小鼠表現(xiàn)出比單個基因疫苗更好的保護作用，發(fā)現(xiàn)2價疫苗具有針對其組分rOmp25和rL7/L12的高IgG水平的免疫原性，可以在小鼠體內(nèi)誘發(fā)Th2介導的免疫反應，從而針對布魯氏菌的感染提供保護力。Tran等[10]在RAW 264.7細胞系和鼠模型中，評估了4種布魯氏菌蛋白(Omp16、Omp19、Omp28、L7/L12)作為組合的重組蛋白疫苗的免疫原性及保護力，該疫苗處理的RAW 264.7細胞可顯著誘導IFN-γ和IL-12的產(chǎn)生，同時降低IL-10的產(chǎn)生，在處理的細胞中，一氧化氮產(chǎn)生的增強以及細胞因子分泌模式證明該疫苗顯著激活了巨噬細胞中的殺菌機制，與PBS對照組相比，用重組疫苗免疫的小鼠誘導高水平的TNF-α、IL-6和MCP-1的細胞因子的產(chǎn)生，主要誘導Th1型免疫反應，是一個潛在的預防布魯氏菌病的候選疫苗。除了布魯氏菌自身的免疫相關(guān)蛋白抗原以外，有研究者采用細胞因子與布魯氏菌外膜蛋白進行融合[11]，獲得重組蛋白，以增加小鼠感染布魯氏菌后的保護性免疫，研究者對其二級結(jié)構(gòu)和抗原性進行了計算機水平的預測，表明這種嵌合蛋白可用作小鼠模型中針對布魯氏菌感染的候選亞單位疫苗，但仍需臨床前實驗進行抗原性和保護力的進一步評估。目前大多數(shù)重組蛋白疫苗仍需加入佐劑以增強疫苗的免疫原性及保護力。亞單位候選疫苗的構(gòu)建和評估是通過實驗技術(shù)進行的，如免疫反應性抗原的克隆和表達、體外和體內(nèi)免疫原性評估，這些實驗方法耗時較長且步驟繁瑣，經(jīng)常會有失敗的可能性，因此，基于3D結(jié)構(gòu)的計算建模、B細胞和T細胞表位的預測以及MHC結(jié)合效力等免疫信息學的先進算法和處理工具被用于疫苗開發(fā)[12]。相關(guān)研究表明，與單組分亞單位疫苗相比，多組分疫苗能夠誘導更多的保護性免疫反應[13]。Mahdiye等[14]利用免疫信息學策略，利用布魯氏菌抗原Omp31、BP26、BLS、DnaK和L7-L12的免疫優(yōu)勢表位，設計了一種針對布魯氏菌病的保護性多表位疫苗，并通過電子方法評估了構(gòu)建疫苗的免疫學和理化特性，免疫信息學分析表明，這種多表位肽疫苗可以有效表達，并有可能用于布魯氏菌病的預防或治療，這種通過信息學進行表位預測及免疫特性評估的方式有望提供一種更安全、特異性較強、節(jié)約成本的布魯氏菌新型亞單位疫苗構(gòu)建方法。

2 DNA疫苗

DNA疫苗概念的誕生，最初是在1990年Wolff等[15]將DNA重組表達載體注入小鼠骨骼肌中，發(fā)現(xiàn)該DNA能夠在肌細胞中表達、并產(chǎn)生抗體，即最初的DNA疫苗。布魯氏菌DNA疫苗是指將編碼某種布魯氏菌抗原蛋白的DNA片段，通過適合的載體導入動物體內(nèi)，并通過宿主細胞的表達系統(tǒng)合成相應的抗原蛋白，從而誘導宿主產(chǎn)生針對布魯氏菌的免疫應答，以達到預防布魯氏菌感染的目的。與重組蛋白疫苗不同，DNA疫苗在制備方法上要更加便捷，不需要在體外進行蛋白的表達及純化，因此成為布魯氏菌新型疫苗研究領(lǐng)域的熱點。

Moslem等[16]將布魯氏菌omp25和omp31基因克隆到真核表達載體 pcDNA3.1/Hygro (+) 中，結(jié)果表明DNA疫苗免疫BALB/c小鼠后，可引發(fā)明顯的IgG應答、T細胞增殖應答和誘導較高水平的IFN-γ分泌，表明該疫苗能產(chǎn)生以Th1型為主的T細胞免疫應答，能在殺滅和清除體內(nèi)布魯氏菌的過程中起到重要的作用。Emilia等[17]設計了銅鋅超氧化物歧化酶和布魯氏菌基因組島-3(bab1_0260、bab1_0270、bab1_0273和bab1_0278)的開放閱讀框的多表位DNA質(zhì)粒疫苗嵌合體，結(jié)果表明該DNA疫苗能誘導BALB/c小鼠產(chǎn)生典型的以Th1為主的免疫應答，激發(fā)了IgG2a和IFN-γ的產(chǎn)生。另外，開發(fā)布魯氏菌病DNA疫苗的潛在候選抗原還包括gntR[18]、omp2b[19]、L7/L12[20]、bvrR[21]、bls[22]等。布魯氏菌DNA疫苗適合于誘導保護性免疫和針對布魯氏菌等胞內(nèi)病原體制定有效、安全的免疫策略，一些研究表明，與相應的單價疫苗相比，多價疫苗聯(lián)合免疫能誘導更強的免疫應答，并對布魯氏菌的入侵有更好的保護作用[21]。目前已有文獻報道的布魯氏菌DNA疫苗均在一定程度上能有效地誘導動物產(chǎn)生較強的體液和細胞免疫應答，并在攻毒實驗中能降低布魯氏菌的細菌載量，但保護程度仍不能達到減毒活疫苗的免疫效果，考慮到DNA疫苗具有安全性高、生產(chǎn)便捷、設計靈活等優(yōu)點，仍需要探索新的疫苗設計策略來提升布魯氏菌DNA疫苗的免疫原性。

3 基因標記疫苗

基因缺失疫苗是通過基因工程技術(shù)使疫苗株中某些特定毒力基因缺失，從而減弱病原體毒力、同時因特定基因的缺失可以與野毒株感染進行鑒別區(qū)分[23]，通過這種方式改造的新疫苗既保留有較強的免疫原性，同時安全性更高，并解決了疫苗免疫和野毒株感染造成的血清學檢測混淆的難題，具有重要的研究價值。由新疆畜牧科學院獸醫(yī)所和天康生物聯(lián)合研發(fā)的A19-ΔVirB12為基因缺失疫苗，在原A19疫苗株的基礎(chǔ)上敲除布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)中毒力基因virB12，該疫苗已在犢牛中進行了安全性、有效性的評估[24]，同時證實該疫苗可以針對疫苗免疫和野毒株感染進行有效區(qū)分，且通過多抗原檢測可以提高A19-ΔVirB12免疫和田間感染鑒別診斷的準確性[25]，有助于免疫凈化，目前該疫苗已獲得農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒發(fā)的新獸藥證書，表明布魯氏菌病疫苗研究領(lǐng)域取得了新的突破。馮生等[26]以omp16(BMEI0340)基因為研究靶點，利用基因同源重組技術(shù)構(gòu)建了A19-ΔOmp16 缺失突變株，且可穩(wěn)定遺傳，毒力較A19有一定程度減弱，通過omp16抗體的檢測結(jié)果可以區(qū)分疫苗免疫及野毒株的感染；彭小薇等[27]以牛種布魯氏菌 2308為親本株，構(gòu)建了牛種布魯氏菌clpP基因缺失疫苗，評估了該疫苗在 RAW264.7 巨噬細胞感染模型和小鼠感染模型中的毒力及免疫保護力，結(jié)果表明基因標記疫苗毒力顯著低于布魯氏菌 2308株，表明clpP基因與布魯氏菌毒力相關(guān)，但經(jīng)攻毒保護實驗證實該疫苗保護力明顯降低，可能原因為無法誘導機體產(chǎn)生足夠的細胞免疫反應。

4 載體疫苗

載體疫苗是指將編碼目的抗原的基因通過分子生物學手段導入減毒的細菌或病毒中，從而借助細菌或病毒使目的基因進入宿主并得以正確表達，誘發(fā)相應的免疫保護應答[28]。因載體本身在進入宿主體內(nèi)時即可啟動免疫反應，因此載體疫苗在一定程度上可以增強疫苗的免疫原性。開發(fā)安全有效的布魯氏菌病疫苗，最重要的策略之一是使用能產(chǎn)生布魯氏菌抗原的非致病微生物(細菌和病毒)載體。目前乳酸乳球菌[29]、大腸桿菌[30]、腸道沙門氏菌[31]已被用作體內(nèi)表達布魯氏菌病蛋白抗原的載體。成璐[32]構(gòu)建了重組質(zhì)粒 pMV306-L7/L12-Omp16，并導入牛分枝桿菌卡介苗(BCG)感受態(tài)細胞中，構(gòu)建了布魯氏菌BCG載體疫苗，結(jié)果表明該載體疫苗可以誘導機體細胞免疫反應的顯著增強。周麗麗等[33]將減毒沙門菌作為載體，遞送布魯氏菌bls-L7/L12融合基因重組真核質(zhì)粒，觀察其誘導細胞免疫、體液免疫及粘膜免疫應答的能力，結(jié)果提示該疫苗可以誘發(fā)機體產(chǎn)生以 Th1為主的免疫反應。相關(guān)研究表明納米尺寸的抗原會增強抗原免疫原性，此外納米疫苗可以承載多種抗原，提供抗原靶向性及穩(wěn)定性。鄭晗旭[34]采用水熱法制備了酚醛樹脂磁性復合微球 Fe3O4@CFR 納米粒子，將純化后的P39和Rsα蛋白與被酚醛樹脂修飾后的 Fe3O4磁性材料納米粒子吸附，免疫小鼠后結(jié)果表明該納米顆粒疫苗納米粒子可以促進抗原在體內(nèi)的遞呈，提高抗體水平，但是不同蛋白是有差異的，可以在一定程度上促進IgG2a的分泌，可能影響Th1型免疫，但具體機制有待進一步探索，此研究結(jié)果可為布魯氏菌病納米疫苗的研制提供依據(jù)。

5 菌影疫苗

細菌菌影(bacterial ghosts，BGs)是通過生物滅活的方式在革蘭氏陰性菌細胞膜上形成裂解孔道，使得核酸和其他胞質(zhì)內(nèi)容物通過孔道排出，形成細菌空殼，由于細菌細胞膜保留完整，BGs具有固有的免疫原性，目前已被用于疫苗遞送系統(tǒng)和疫苗佐劑[35]。研究表明通過基因工程手段制備的BGs保留了病原菌的幾乎所有結(jié)構(gòu)抗原[36]，包括病原體相關(guān)分子模式 (PAMPs)，例如脂多糖 (LPS)、脂蛋白 (LPP)、肽聚糖 (PGN) 和菌毛等[37]，可誘導非常強、有效的體液免疫和細胞免疫反應。 Wang等[38]構(gòu)建了布魯氏菌2308ΔGntR菌影疫苗， 其中攻毒實驗結(jié)果表明，免疫后的BALB/c小鼠產(chǎn)生了抗S2308攻擊的高保護性免疫，同時誘導小鼠產(chǎn)生了抗布魯氏菌特異性IgG，并誘導細胞因子IFN-γ和IL-4的分泌，此外該菌影疫苗表現(xiàn)出較強的脾臟CD4+和CD8+T細胞反應，這些結(jié)果表明該疫苗是一種潛在的布魯氏菌新型候選疫苗。在疫苗的設計研究中，佐劑是重要的組成部分，菌影本身因表面具有 LPS、鞭毛等結(jié)構(gòu)而具有很強的佐劑活性，同時也能夠通過鞭毛、菌毛等粘附分子攜帶其他佐劑進入體內(nèi)，從而加強免疫效果[39]。

表1 布魯氏菌病新型疫苗特點及代表性疫苗研究Tab.1 Characteristics of novel brucellosis vaccines and representative vaccine studies

6 總結(jié)與展望

自20世紀初就有關(guān)于預防人和動物布病的疫苗研究[40]。雖然體液免疫反應對于預防布魯氏菌病很重要，但針對布魯氏菌的免疫保護主要取決于細胞免疫，特別是巨噬細胞和T細胞，已被證明是抵御布魯氏菌和其他細胞內(nèi)細菌病原體的關(guān)鍵[41]。到目前為止，針對布魯氏菌入侵最有效的保護力是由激發(fā)強大細胞介導免疫的減毒活疫苗提供的[42]。因此，開發(fā)新的有效的布魯氏菌病疫苗的關(guān)鍵在于誘導顯著的Th1免疫應答并提供高水平的保護效果[43]。新型布病疫苗在一定程度上克服了傳統(tǒng)疫苗安全性不高、免疫期短及制備程序復雜的缺點，但仍未有明確的新型疫苗被推廣應用，主要原因為新型疫苗提供的保護力仍未達到理想水平，且目前大部分布病疫苗研究都是在小鼠、家兔等動物中進行，這可能與在大型動物中進行疫苗的評價實驗的成本過高有關(guān)。然而更為重要的是需要設計開發(fā)能夠增強新型疫苗免疫原性的新策略，仍需進一步闡明布魯氏菌的致病機制，同時在抗原的選取、動物模型的選擇以及有效的佐劑及遞送載體等方面進行深入探索，此外生物信息學、反向疫苗學等技術(shù)的應用有助于識別保護性抗原中最有可能引發(fā)免疫反應的區(qū)域，對于疫苗免疫原性的預測及提高具有重要的意義。

利益沖突：無