宏基因二代測序與傳統(tǒng)檢測方法在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中的對比觀察

張曉杰 范 磊 潘妍婷

1 河北北方學(xué)院研究生院，張家口，075000，中國

2 河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，張家口，075000，中國

3 張家口市第一醫(yī)院，張家口，075000，中國

目前中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）感染性疾病的病原學(xué)診斷主要依靠腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）涂片鏡檢、病原體培養(yǎng)、抗原抗體檢測、PCR 檢測，但其陽性率低［1-2］。近年來，二代測序以其“高通量優(yōu)勢”在臨床中廣泛應(yīng)用，宏基因二代測序法（metagenomics next-generation sequencing，mNGS）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病病原學(xué)檢出率及診斷水平提高中發(fā)揮重要作用。與常規(guī)檢測方法相比，mNGS技術(shù)的陽性百分比、一致性顯著增加，同時(shí)提高病原體的識別率［3］。本研究收集我院診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的60 例患者，分析腦脊液培養(yǎng)與mNGS 方法的敏感性，探討mNGS 技術(shù)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者腦脊液中提供病原學(xué)證據(jù)的效能差異及臨床診治中的指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧分析河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院2019 年5月～2021 年5 月神經(jīng)內(nèi)科住院且臨床確診為中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者60 例。

1.2 研究方案

收集同期臨床確診的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的患者60例，疾病納入標(biāo)準(zhǔn)［4］參考王維治主編的《神經(jīng)病學(xué)》中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)排除標(biāo)準(zhǔn)，包括：①年齡≤28 d；②腦脊液細(xì)胞學(xué)證實(shí)腦膜惡性腫瘤；③損傷所致明顯血性腦脊液；④已經(jīng)確診自身免疫性腦炎的病例；⑤HIV、梅毒感染或者拒絕簽署知情同意書。將每個(gè)組別的腦脊液同期進(jìn)行腦脊液傳統(tǒng)檢驗(yàn)和mNGS檢測，觀察mNGS 方法的陽性檢出率及指導(dǎo)臨床選用抗菌素的治療效果。本研究通過河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.3 CSF 標(biāo)本的收集

患者入組后盡早留取CSF，需注意嚴(yán)格無菌操作，避免損傷性出血導(dǎo)致溶血，控制顱內(nèi)高壓患者的放液速度，避免腦疝形成；經(jīng)引流管道采集時(shí)，排去管腔內(nèi)約3～5 mL 的潴留液體，盡可能收集新鮮CSF。標(biāo)本收集后立即分裝至無菌、干燥、潔凈的凍存試管內(nèi)，每一標(biāo)本的留取量應(yīng)≥1.5 mL。

1.4 檢驗(yàn)方法

試管內(nèi)標(biāo)本同時(shí)行mNGS 及微生物培養(yǎng)檢測。微生物培養(yǎng)方法：在無菌條件下，將CSF 標(biāo)本或其離心沉淀物分別接種于血平板、巧克力平板、麥康凱平板，5.5%CO2：，35℃條件下，培養(yǎng)18～48 h，獲取菌株后進(jìn)行鑒定。mNGS 由廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)集團(tuán)股份有限公司完成，CNS 感染特征確定參考數(shù)據(jù)庫，所用數(shù)據(jù)庫包括細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲、支原體或衣原體。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0 及MedCalc15.2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。分類變量以例數(shù)（百分率）表示，近似服從正態(tài)分布的連續(xù)性變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，并計(jì)算曲線下面積（areaunder the curve，AUC），以AUC=0.5 為診斷參考線，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

分析的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的60 例患者中，有慢性病史者9 例（15.0%），送檢化驗(yàn)前使用抗生素6 例（10.0%），影像檢查伴有腦膿腫患者5例（8.33%），脊髓膿腫2 例（3.33%）。按不同感染源進(jìn)行分組（Tab.1），細(xì)菌感染42 例（70%）；病毒感染16 例（26.67%）；寄生蟲感染2 例（3.33%）。

Tab.1 mNGS results of 60 patients with central nervous system infection

2.2 mNGS 結(jié)果

總體陽性例數(shù)為52 例（86.67%），對細(xì)菌感染的陽性例數(shù)為40 例（95.24%），病毒感染陽性11 例（68.75%），寄生蟲感染陽性1 例（50%）。mNGS 對細(xì)菌和病毒的陽性率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，P＜0.05（P=0.004），提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Tab.2）。

Tab.2 Analysis of mNGS results

2.3 mNGS 對入組中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者的診斷效能評價(jià)結(jié)果

ROC 曲線分析顯示（Fig.1），mNGS 的AUC 為0.705，診斷價(jià)值中等，與AUC=0.5 的診斷參考線比較P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Fig.1 Receiver operating characteristic（ROC）curve for mNGS diagnosis of CNS infection（n=60）

2.4 實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果

所有病例均完善血細(xì)胞分析、C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、降鈣素原（procalcitonin，PCT）、肝功能、腎功能、電解質(zhì)及腦脊液常規(guī)、生化等基礎(chǔ)檢驗(yàn)項(xiàng)目，60 例病人C-反應(yīng)蛋白、降鈣素原、腦脊液中白細(xì)胞、腦脊液壓力出現(xiàn)不同程度增高（Tab.3）。

Tab.3 Laboratory tests were positive in 60 patients with CNS infections

2.5 影像資料

病毒感染組核磁結(jié)果平掃陽性例數(shù)13 例，細(xì)菌感染組核磁平掃結(jié)果陽性例數(shù)30 例，其中5 例伴有腦膿腫，2 例脊髓膿腫患者以及2 例寄生蟲感染者，均由增強(qiáng)核磁進(jìn)一步明確診斷。

3 討論

有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，腦炎患者中約63%的病例是病原體診斷不明［5］。對于腦炎而言，明確其是自身免疫因素還是感染性疾病導(dǎo)致的炎癥，對于其后續(xù)的診治方案選擇具有重要意義，這更加彰顯出明確病原體的重要 性［6］。臨床工作中發(fā)現(xiàn)，mNGS 技術(shù)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病病原學(xué)的診斷與其他傳統(tǒng)診斷方法比較有一定的優(yōu)越性［7］。有文獻(xiàn)提示腦脊液常見的病毒、細(xì)菌、寄生蟲感染中mNGS 技術(shù)較傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法有較高的敏感性及特異性［8］。本組患者分析結(jié)果提示，腦脊液mNGS技術(shù)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的總的陽性率為95.24%，與文獻(xiàn)報(bào)道類似［9］。mNGS 技術(shù)提高病因檢測陽性率，尤其在傳統(tǒng)病原菌檢測陰性時(shí)，可有效輔助臨床診斷。

通過mNGS 結(jié)果分析，可進(jìn)一步提示細(xì)菌的種屬信息，為臨床工作提供精準(zhǔn)的治療信息。本組中1 例患者mNGS 檢查結(jié)果，細(xì)菌種屬提示為革蘭陰性普雷沃菌系口腔細(xì)菌，給予奧硝唑治療，臨床癥狀明顯好轉(zhuǎn)。另外2 例脊髓膿腫患者，經(jīng)強(qiáng)化磁共振證實(shí)診斷，但多次送檢常規(guī)腦脊液化驗(yàn)均為陰性，而送檢二代測序提示布氏桿菌感染，目前相關(guān)文獻(xiàn)并無布氏桿菌導(dǎo)致脊髓膿腫病例報(bào)道。因此對于慢性及不明原因感染患者與傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法相比，mNGS 技術(shù)可作為更有效的檢測手段［10］，并可有效縮短疾病的診斷及治療時(shí)間。

mNGS 對病毒、真菌等非細(xì)菌類病原體的檢出存在著其固有優(yōu)勢。微生物培養(yǎng)的檢測閾值僅為100～1 000 CFU·mL-1，mNGS 的檢測閾值在0.01～ 130.00 CFU·mL-1［11］。其次，mNGS 的檢測對象是病原體基因序列，不區(qū)分病原體活性，對已接受廣譜抗生素經(jīng)驗(yàn)治療的患者，其CSF 中病原體仍可在mNGS 中檢出。但mNGS 技術(shù)作為新型的病原微生物檢測技術(shù)，檢測技術(shù)昂貴，無法同步提供藥敏結(jié)果。總之，腦脊液mNGS 雖然還有待進(jìn)一步完善與標(biāo)準(zhǔn)化，但為中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病因精準(zhǔn)診療帶來了顯著的進(jìn)步。這種診斷方法顯著縮短診斷、治療時(shí)長，能夠識別新出現(xiàn)的感染病原體和新發(fā)感染性疾病。在病原體診斷技術(shù)相對落后的基層醫(yī)院和臨床實(shí)踐中如何合理應(yīng)用mNGS，并與傳統(tǒng)微生物檢測方法相結(jié)合，以提高神經(jīng)感染性疾病的診治水平。

綜上所述，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染診療中，mNGS 較傳統(tǒng)檢驗(yàn)具有更好的診斷效能，可以作為微生物培養(yǎng)等常規(guī)診斷技術(shù)的必要補(bǔ)充，進(jìn)一步為中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染提供精準(zhǔn)治療依據(jù)。