綜合性實驗“紅外光譜鑒別法在《中國藥典》中的應(yīng)用”的教學(xué)探索*

李 燕，曾紫微，嚴(yán)萬莉，何 彬

(貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

大學(xué)生創(chuàng)新能力和實踐能力的培養(yǎng)與提升一直是高校教育工作的重要任務(wù)之一[1]，實驗教學(xué)是培養(yǎng)學(xué)生綜合素質(zhì)和創(chuàng)新能力的重要手段。而基礎(chǔ)性實驗階段的主要任務(wù)是學(xué)習(xí)基礎(chǔ)、操作簡單實驗[2]，但是學(xué)生的培養(yǎng)只停留在這個階段，僅僅滿足于在教師對實驗教學(xué)的目的，為給學(xué)生提供更多自主創(chuàng)新的機會，提高學(xué)生的動手能力及創(chuàng)新意識，掌握解決實際科學(xué)實驗中所遇到的問題，有必要建立一個系統(tǒng)性、綜合性的實驗。

綜合性實驗是指在學(xué)生具有一定基礎(chǔ)知識和基本操作技能的基礎(chǔ)上運用某一課程或多門課程的綜合知識，對學(xué)生實驗技能和實驗方法進行綜合訓(xùn)練的一種復(fù)合性實驗[3-4]。綜合性實驗的設(shè)立使學(xué)生產(chǎn)生思考和探索的濃厚興趣，有目的的查閱相關(guān)資料，獨立操作儀器并且分析解決實驗中所遇到的問題。

紅外光譜是有機化合物的重要特征之一，其光譜比較復(fù)雜，但能與化合物的結(jié)構(gòu)一一對應(yīng)，具有高度的專屬性和特征性，常用于物質(zhì)的鑒別[5]。紅外光譜法與其他鑒別方法相比，具有應(yīng)用范圍廣，特征性強，突出整體性，儀器操作簡單等優(yōu)點[6]。所以我們設(shè)計了一個綜合性實驗，通過紅外光譜鑒別法探索其在《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)中的應(yīng)用[7]。實驗所用到的儀器簡便、安全，所設(shè)計知識與實驗操作對應(yīng)，給予足夠的空間給學(xué)生自主學(xué)習(xí)、創(chuàng)新，并且培養(yǎng)學(xué)生在實驗中分析及解決問題能力，著重培養(yǎng)學(xué)生綜合性能力，體現(xiàn)了綜合性學(xué)習(xí)本意。

1 實驗設(shè)計

1.1 實驗?zāi)康?/h3>

(1)培養(yǎng)學(xué)生獨立開展實驗、分析實驗結(jié)果的能力；

(2)掌握傅里葉變換紅外光譜儀的原理及其操作；

(3)掌握紅外光譜鑒別法在《中國藥典》中的應(yīng)用。

1.2 實驗原理及方法

(1)原理

傅里葉變換紅外光譜儀主要由三部分組成：光源、干涉儀和檢測器。其中光源能發(fā)射出穩(wěn)定、高強度、連續(xù)波長的紅外光，經(jīng)準(zhǔn)直系統(tǒng)變?yōu)橐皇叫泄馐筮M入干涉儀系統(tǒng)，經(jīng)干涉儀調(diào)制后將復(fù)色光變?yōu)橐皇缮婀猓缮婀馔ㄟ^樣品后成為帶有樣品信息的干涉光到達檢測器，檢測器將干涉光信號變?yōu)殡娪嵦?，然后將它通過模/數(shù)轉(zhuǎn)換器(A/D)送入計算機，由計算機進行傅里葉變換的快速轉(zhuǎn)換，將這一干涉信號所帶有的光譜信息轉(zhuǎn)換成以波束為橫坐標(biāo)的紅外光譜圖[8]。按照《中華人民共和國藥典》通則中的相關(guān)規(guī)定：除部分光學(xué)異構(gòu)體及長鏈烷烴同系物外，幾乎沒有兩個化合物具有相同的紅外光譜，據(jù)此可以對化合物進行定性和結(jié)構(gòu)分析。如果化合物種類或數(shù)量不相同，那么紅外光譜肯定就會存在一定差異，所以我們就可以以此為依據(jù)進行定性分析。此外，化合物對紅外輻射的吸收程度與其濃度的關(guān)系符合朗伯-比爾定律，這也是紅外光譜法得以應(yīng)用的重要依據(jù)之一。簡單來說，紅外光譜儀工作原理就是用一定頻率的紅外光聚焦照射被分析的樣品時，如果分子中某個基團的振動頻率與照射紅外線頻率相同便會產(chǎn)生共振，從而吸收一定頻率的紅外線，把分子吸收紅外線的這種情況用儀器記錄下來，便能得到全面反映樣品成分特征的光譜，進而推測化合物的類型和結(jié)構(gòu)。

(2)方法

①試樣的制備：液膜法、壓片法和ATR法。

②儀器：紅外分光光度計

③環(huán)境要求：溫度18～35 ℃，相對濕度(RH)<50%。

④儀器檢查：打開紅外光譜儀電源及工作站電腦，Labsolutions軟件，儀器初始化，分束器，光源，激光，濕度四個參數(shù)指示燈顯示綠色后，依次設(shè)置下列參數(shù)，測定模式：透過率；變跡函數(shù)：Happ-Genzel；光束：內(nèi)部；檢測器：標(biāo)準(zhǔn)；動鏡速度：2.8；增益：自動；光闌：自動；光闌延遲：10 s；IR范圍：中紅外；光源：陶瓷光源；零填充：否。

⑤試樣測定：掃描范圍：4000～650 cm-1；分辨率： 2 cm-1；掃描次數(shù)：16次。

1.3 實驗內(nèi)容

液體試樣的紅外光譜鑒別采用液膜法，步驟如下：(1)空白制備：將干凈的兩片溴化鉀窗片安裝在液體池架上，得空白片；(2)取溴化鉀窗片一片，安裝到液體池架上，取供試品2～5滴均勻涂抹于溴化鉀窗片上，用另一片溴化鉀窗片覆蓋，排除氣泡，裝好，即得供試品；(3)按上述紅外光譜儀的標(biāo)準(zhǔn)操作，進行掃描測定，先掃空白片，再掃供試品；(4)分析：供試品的紅外吸收光譜圖應(yīng)與對照的圖譜(光譜集)或?qū)φ掌返募t外光譜圖一致[9]。

固體試樣的紅外光譜鑒別采用壓片法，步驟如下：(1)取 5～10 g溴化鉀或氯化鉀晶體，置干凈的玻璃研缽中研細(xì)，置紅外燈下干燥30 min以上;(2)空白制備：取干燥過的(溴化鉀或氯化鉀)細(xì)粉200～300 mg，置于瑪瑙研缽中，充分研磨混勻，置于直徑為13 mm的壓片模具中，使鋪展均勻，抽真空約2 min，加壓至(0.8～1)×106kPa(>2 T/cm2)，保持壓力2 min，撤去壓力并放氣后取出制成的供試片，目視檢測，片子應(yīng)呈透明狀，其中樣品分布應(yīng)均勻，并無明顯的顆粒狀樣品，即得空白片，立即測定；(3)供試品制備：將供試品混勻，采用四分法取供試品約1 g置于紅外燈下干燥30 min以上，再次混勻并采用四分法取干燥過的供試品約0.2 g，置于瑪瑙研缽中，充分研磨成細(xì)粉。然后，取研磨好的供試品約1～1.5 mg，置于另一瑪瑙研缽中，加入干燥的溴化鉀或氯化鉀細(xì)粉約200～300 mg(與供試品的比約為200:1)作為分散劑，充分研磨混勻， 置于直徑為13 mm的壓片模具中，使鋪展均勻，抽真空約2 min，加壓至(0.8～1)×106kPa(>2 T/cm2)，保持壓力2 min，撤去壓力并放氣后取出制成的供試片，目視檢測，片子應(yīng)呈透明狀，其中樣品分布應(yīng)均勻，并無明顯的顆粒狀樣品，即得供試品片，立即測定。亦可采用其他直徑的壓模制片，樣品與分散劑的用量需相應(yīng)調(diào)整以制得濃度合適的片子；(4)按上述紅外光譜儀的標(biāo)準(zhǔn)操作，進行掃描測定，先掃空白片，再掃供試品；(5)分析：供試品的紅外吸收光譜圖應(yīng)與對照的圖譜(光譜集)或?qū)φ掌返募t外光譜圖一致。

藥包材試樣的紅外光譜鑒別采用ATR法，需安裝ATR附件，將塑料或者橡膠試樣切割成薄膜狀，緊貼ATR的紅外透光晶體面上，其余步驟與上述步驟一致[10]。

1.4 思考題

(1)不同樣品或樣品狀態(tài)的掃描次數(shù)不同。

(2)固體試樣中有些樣品需要用氯化鉀壓片而有些樣品需要用溴化鉀壓片。

(3)當(dāng)檢測出供試品的紅外吸收光譜圖與對照的圖譜(光譜集)或?qū)φ掌返募t外吸收光譜圖不一致。

2 實驗的可行性

2.1 實驗特點

紅外光譜法具有特征性強、測定快速、不破壞試樣、試樣用量少、操作簡便、能分析各種狀態(tài)的試樣、分析靈敏度較低、定量分析誤差較大。產(chǎn)生紅外吸收的條件只需要滿足輻射后具有能滿足物質(zhì)產(chǎn)生振動躍遷所需的能量，或分子振動有瞬間偶極距變化。當(dāng)分子振動引起分子偶極矩變化時，就能形成穩(wěn)定的交變電場，其頻率與分子振動頻率相同，可以和相同頻率的紅外輻射發(fā)生相互作用，使分子吸收紅外輻射的能量躍遷到高能態(tài)，從而產(chǎn)生紅外吸收光譜。紅外光譜具有鮮明的特征性，其譜帶的數(shù)目、位置、形狀和強度都隨化合物不同而各不相同。因此，紅外光譜法是定性鑒定和結(jié)構(gòu)分析的有力工具。對于已知化合物的鑒定，將試樣的譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品測得的譜圖比較，或者與文獻上的標(biāo)準(zhǔn)譜圖(如：《藥品紅外光譜圖集》等)相比較就可以進行定性分析了。使用標(biāo)準(zhǔn)譜圖比較時應(yīng)當(dāng)注意：試樣的物態(tài)、結(jié)晶形狀、溶劑、測定條件以及所用儀器類型均應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)譜圖相同。對于未知化合物或者新化合物的鑒定，鑒于紅外光譜主要提供官能團的結(jié)構(gòu)信息，對于復(fù)雜未知化合物，或者復(fù)雜新化合物，單靠紅外光譜不能解決問題，需要與紫外光譜、質(zhì)譜和核磁共振等分析手段互相配合，進行綜合光譜解析，才能確定分子結(jié)構(gòu)。

紅外光譜法操作簡單，關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于樣品的制備，常見的樣品為液體樣品和固體樣品。對于液體樣品，又分為純液體樣品和溶液樣品兩種。如有可能，盡量不用溶液，以免帶入溶劑的吸收干擾。只有試樣的吸收很強，液膜法無法制成很薄的吸收層，或為了要避免試樣分子間相互締合的影響，才采用溶液法測試。選用溶液測試時，應(yīng)考慮溶解度，且在特征吸收帶處溶劑無吸收或僅有非常弱的吸收，常用的溶劑為四氯化碳、二硫化碳、二氯甲烷、丙酮等。對于固體樣品，采用壓片法，采用KBr或KCl與樣品混合壓片處理，所用KBr或KCl一般采用光譜純的，也可以采用分析純的，關(guān)鍵在于沒有雜質(zhì)，如存在雜質(zhì)的紅外背景，可以通過馬弗爐中高溫干燥30 min，置于專用的干燥器中冷卻，待用。制備固體樣品之前，一定要通過干燥烘箱或紅外燈充分干燥，并用干凈的瑪瑙研缽仔細(xì)研磨細(xì)，以便壓片制備固體樣品。對于特殊的供試品，如橡膠和塑料等藥包材樣品，需要通過刀片切割成均勻薄片，且具有較好的透過率，這樣處理才有利于ATR全反射法的紅外光譜測定。

本實驗旨在鍛煉學(xué)生綜合性實驗?zāi)芰?，在實驗中運用所學(xué)知識發(fā)現(xiàn)問題、解決問題并且將實驗知識延伸，探索《中國藥典》中所有相關(guān)應(yīng)用。本實驗將從液膜法、壓片法、ATR法這三種方法全面給學(xué)生講解紅外光譜鑒別法，并挑選每種方法的其中一種代表物進行操作講解，接著讓學(xué)生們發(fā)散思維找尋《中國藥典》中藥物適合的鑒別方法，這就引導(dǎo)學(xué)生從書本學(xué)習(xí)知識并且通過實驗驗證結(jié)果。

2.2 實驗的可行性

2020年版《中華人民共和國藥典》中收載了紅外光譜鑒別法鑒別的許多品種，規(guī)定了紅外光譜法作為藥品檢驗方法之一。由于醫(yī)藥化工行業(yè)的原料(輔料)、成品的種類繁多，許多藥品化學(xué)結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜或者相互之間的化學(xué)差異較小，常常不足以相互區(qū)分，而紅外光譜法具有高度的專屬性，是有機化合物領(lǐng)域定性分析時廣泛應(yīng)用的方法。在藥品檢驗中，紅外光譜法常與其它理化方法聯(lián)合使用，作為有機藥品的重要的鑒別方法。因此，紅外光譜法作為經(jīng)典的光譜鑒別法之一，在理論上和實踐中均具有非常高的可行性。本實驗所用到的儀器安全、操作簡單，試劑材料耗費少，也配備專業(yè)的實驗人員進行講解。本實驗將從書本理論知識通過學(xué)生親手實驗操作進行驗證并應(yīng)用于《中國藥典》中，有效提升了自身的綜合能力，達到了綜合性實驗素質(zhì)教育的目的。

3 結(jié) 語

培養(yǎng)創(chuàng)新型高素質(zhì)復(fù)合型藥學(xué)人才，是適應(yīng)新時代提出建設(shè)創(chuàng)新型國家的要求，也是醫(yī)學(xué)院校相關(guān)專業(yè)教育教學(xué)的不懈追求。綜合性實驗一般是通過給定的實驗主題和條件，學(xué)生能夠自行涉及實驗方案，并最終能夠完成的實驗。當(dāng)前藥學(xué)教育重視 專業(yè)基礎(chǔ)理論教學(xué)課程，雖然，實驗教學(xué)也有，但是，重視程度相對不足，往往是一些基礎(chǔ)單元操作，實驗課時相對較少，實驗內(nèi)容相對落后陳舊，與實際需求脫節(jié)比較大。然而，實驗教學(xué)實際上是理論知識與實踐要求的重要連接和紐帶，也是激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣的主要依托。目前的單元性實驗的教學(xué)大多屬于驗證性和重復(fù)性，對學(xué)生創(chuàng)新型思維和應(yīng)用型能力的培養(yǎng)并不突出，因此，開展綜合設(shè)計性實驗顯得尤其迫切和必要了。藥學(xué)專業(yè)的綜合性實驗設(shè)計可以有機地將基礎(chǔ)理論知識和單元實驗所學(xué)的各種實驗技能和方法加以總結(jié)、分析、借鑒并最終形成一個完整的實驗形式，這個過程也是一個開放式的情景沉浸式的實驗，在老師的指導(dǎo)下，學(xué)生完成文獻調(diào)研、實驗設(shè)計、操作、分析報告等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是一種綜合性的創(chuàng)新性的實驗訓(xùn)練。通過綜合性實驗的開設(shè)，我們給予學(xué)生一個培養(yǎng)綜合性能力的實驗平臺，讓學(xué)生在課本所學(xué)基礎(chǔ)知識運用到實驗中，并將實驗中所學(xué)運用在《中國藥典》中，探索《中國藥典》中相關(guān)的知識。本實驗讓學(xué)生了解實驗、接觸實驗并且親自動手做實驗，讓學(xué)生感受科學(xué)實驗就在我們身邊，對于培養(yǎng)學(xué)生興趣以及對學(xué)生未來選擇都有著明顯益處。這不僅讓我們的教學(xué)有意義，更讓綜合性素質(zhì)教育有所延伸。