艾沙康唑、伏立康唑、兩性霉素B對我國多中心臨床分離絲狀真菌的體外藥物敏感性評估

井然，郭大文，王俊瑞，賀靖冬，王瑤，徐英春*

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科，疑難重癥及罕見病國家重點實驗室，北京協(xié)和醫(yī)院，北京 100730；2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京 100730；3侵襲性真菌病機制研究與精準(zhǔn)診斷北京市重點實驗室，北京 100730；4哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，哈爾濱 150007；5內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，內(nèi)蒙古 750306；6天津市胸科醫(yī)院檢驗科，天津 300051

近年來，隨著抗真菌藥、激素、免疫抑制劑的廣泛使用和侵入性治療的增加，我國和其他國家一樣，侵襲性肺曲霉病和毛霉病發(fā)病率逐漸增高[1-2]。

目前，伏立康唑（voriconazole，VOR）是被推薦用于治療侵襲性肺曲霉病的主要抗真菌藥物[3]，然而對VOR耐藥的煙曲霉感染患者的報道越來越多[4]。兩性霉素B（amphotericin B，AMB）被推薦用于治療毛霉病[5]，但存在藥物不良反應(yīng)，如腎毒性等[6]。因此，目前用于治療侵襲性真菌病的藥物十分有限。國外已有研究報道艾沙康唑（isavuconazole，ISA）對大范圍的酵母菌和絲狀真菌有較強的體外活性[7-8]。本研究旨在評估ISA對我國多中心臨床分離的曲霉屬和毛霉目菌株的體外活性，為指導(dǎo)臨床治療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料來源

收集來自2017～2020年中國醫(yī)院侵襲性真菌病監(jiān)測網(wǎng)（CHIF-NET）中國北方，包括北京、天津、內(nèi)蒙古、河北、黑龍江、吉林、遼寧和山西8個地區(qū)合作醫(yī)院的臨床分離絲狀真菌，共計131株。所有菌株統(tǒng)一傳種在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基[Sabouraud Dextrose Agar，SDA （Thermo Fisher Scientific）]，于28℃孵育3～7天。

1.2 研究方法

1.2.1 菌種鑒定

所有菌種采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）進(jìn)行鑒定，同時對未鑒定出結(jié)果的菌株進(jìn)行rDNA的ITS區(qū)域或28S rRNA的D1/D2區(qū)測序。

1.2.2 藥物敏感性檢測

依據(jù)CLSI M38-A3的微量肉湯稀釋法進(jìn)行體外藥物敏感性檢測[9]，藥敏板由IHMA（Europe Sarl）提供，包含3種抗真菌藥物，即ISA（MICs：0.008～8μg/ml）、VOR（MICs：0.008～8μg/ml）和 AMB（MICs：0.06～8μg/ml），其中VOR和AMB作為研究ISA敏感性的參考類抗真菌藥。近平滑念珠菌ATCC 22019和克柔念珠菌ATCC 6258作為藥敏試驗的質(zhì)控菌株，煙曲霉ATCC MYA-3627TM和黃曲霉ATCC 204304TM作為參考菌株[10]。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

依據(jù)CLSI M59和CLSI M57S[11-12]，目前只建立了 VOR、ISA和AMB對常見的曲霉屬，包括煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉和土曲霉的流行病學(xué)界值（epidemiological cutoffvalues， ECVs）。尚未建立毛霉目的ECV，因此通過計算50%最低抑菌濃度（50% minimun inhibitory concentration，MIC50）和90%最低抑菌濃度（90% minimun inhibitory concentration，MIC90）來評估抗真菌藥對毛霉目的體外活性[11-12]。

2 結(jié)果

2.1 菌種鑒定

臨床共分離絲狀真菌131株，最終鑒定出曲霉屬105株和毛霉目26株。105株曲霉屬中，煙曲霉復(fù)合群（A.fumigatuscomplex）占所有曲霉屬的71.4%（75/105），其次是黑曲霉復(fù)合群（A.nigercomplex）占10.5%（11/105），黃曲霉復(fù)合群（A.flavuscomplex）占9.5%（10/105）和土曲霉復(fù)合群（A.terreuscomplex） 占 8.6%（9/105）。 在 26株 毛 霉 目中，以根霉屬為主，占50%（13/26）[其中，米根霉/少根根霉（R.oryzae/R.arrhizus）占84.6%（11/13），小孢根霉（R.microspores）和匍枝根霉（R.stolonifera）各有1株]。其次為根毛霉屬[占15.4%（4/26），包含3株微小根毛霉（R.pusillus）和1株米黑根毛霉（R.miehei）]和橫梗霉屬[占15.4%（4/26），均為分枝橫梗霉（Lichtheimia ramosa）]。最后為共頭霉屬[占 11.5%（3/26），均為總狀共頭霉（S.racemosum）]和毛霉屬[僅有2株，均為卷枝毛霉（M.circinelloides）]。

2.2 ISA、VOR和AMB對不同曲霉屬體外藥物敏感性比較

研究總結(jié)了ISA、VOR和AMB對不同曲霉屬的作用效果（見圖1）。根據(jù)CLSI-M59對部分曲霉ECVs的判斷標(biāo)準(zhǔn)[11]，當(dāng)測定某一抗真菌藥對某菌株的MIC值≥ECV值時，該菌株被定義為對這種抗真菌藥的非野生型菌株，在本研究中我們可以解釋為 “耐藥”；相反，當(dāng)MIC值

圖1 ISA、VOR和AMB對不同曲霉屬的體外藥物敏感性交叉比較

如圖1A所示，在75株煙曲霉復(fù)合群中，有67株（67/75，89.3%）對AMB耐藥。在對AMB耐藥的煙曲霉復(fù)合群的菌株中，有4株對ISA和VOR耐藥（6.0%，4/67），剩余63株對ISA和VOR均敏感。對比AMB，煙曲霉復(fù)合群對ISA和VOR 2種唑類藥物同時敏感的菌株占比為92.0%（69/75）。此外，對ISA耐藥的6株煙曲霉復(fù)合群菌株中，有5株VOR耐藥株和1株VOR敏感株。

如圖1B所示，在10株黃曲霉復(fù)合群菌株中，10株均對VOR敏感，有2株對ISA耐藥。在對AMB耐藥的4株菌株中，有1株對ISA耐藥。對比AMB，黃曲霉復(fù)合群對ISA和VOR 2種唑類藥物同時敏感的菌株占比為80.0%（8/10）。

如圖1C所示，在11株黑曲霉復(fù)合群中，有4株對AMB耐藥的同時，對ISA和VOR敏感。對比AMB、ISA和VOR對黑曲霉復(fù)合群均有較好的活性，均敏感（100%）。

如圖1D所示，在9株土曲霉復(fù)合群中，僅1株菌（11.1%，1/9）對AMB耐藥，9株（100%）均對ISA和VOR敏感。

2.3 ISA、VOR和AMB對毛霉目體外藥物敏感性分析

體外藥敏結(jié)果顯示（見表1），VOR對所有毛霉目均無活性，MIC值范圍為4～>8 μ g/ml，中位數(shù) MIC 值（mMIC）、MIC50和 MIC90均>8 μ g/ml。ISA對毛霉目的藥敏結(jié)果顯示，毛霉屬和共頭霉屬對ISA的MIC值范圍分別為0.5～8μg/ml和0.5～>8μg/ml，各有1株卷枝毛霉和總狀共頭霉對ISA耐藥（MIC>8μg/ml）。ISA對根霉屬、根毛霉屬和橫梗霉屬有較強的體外活性，MIC值范圍分別 為 0.06～2、0.25～1μg/ml和 0.06～2μg/ml。 對比VOR和ISA，AMB對毛霉目不同種均有較好的活性，MIC值范圍為0.12～2μg/ml。

表1 ISA、VOR和AMB對毛霉目的體外藥物敏感性μg/ml

3 討論

近些年，侵襲性霉菌感染的發(fā)病率逐年升高[13]，除曲霉屬為主要病原體外，毛霉目是另一類常見的病原體。由于近年來新冠肺炎疫情，許多國家報道了新冠肺炎（COVID-19）合并肺曲霉病和毛霉菌肺炎的病例[14-18]。毛霉病與血管侵犯有關(guān)，死亡率高于侵襲性肺曲霉病，可達(dá)50%～70%[19]，且在糖尿病患者中的發(fā)病率逐漸增高[20-23]。

ISA已于2015年被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）和歐洲藥品管理局（EMA）獲批用于治療侵襲性肺曲霉病和毛霉病，同時ISA也被推薦作為治療侵襲性霉菌感染的一線藥物[24]。

但隨著煙曲霉對唑類藥物耐藥不斷被報道[4]，當(dāng)遇到唑類藥物耐藥的煙曲霉感染時，AMB可作為治療方案[24]。然而，大規(guī)模和長期使用AMB可能會降低其對煙曲霉復(fù)合群的敏感性，逐漸出現(xiàn)對AMB耐藥的煙曲霉復(fù)合群菌株。如加拿大報道了AMB對一批煙曲霉菌株有更低的敏感性，耐藥率達(dá)96.4%（188/195），高于本研究中煙曲霉復(fù)合群菌株對AMB的耐藥率（89.3%）[25]。本研究為我國首次開展的多中心ISA對臨床分離的絲狀真菌的體外藥物敏感性評估，結(jié)果顯示對煙曲霉復(fù)合群、黃曲霉復(fù)合群、黑曲霉復(fù)合群和土曲霉復(fù)合群，VOR和ISA的作用效果相似。此外，有研究指出與VOR相比，ISA有更廣泛的活性譜（包括對大多數(shù)毛霉目真菌）及良好的耐受性，可加載劑量后每日1次給藥，且其為線性藥動學(xué)，具有水溶性和更少的細(xì)胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP450）介導(dǎo)的藥物與藥物間的相互作用[26-27]。基于此，提示ISA同樣可以作為治療侵襲性曲霉感染的治療藥物[27]。

根據(jù)相關(guān)指南推薦[28]，治療毛霉病的一線抗真菌藥是AMB。本研究結(jié)果與指南推薦一致，即AMB對毛霉目菌株均有較好的活性（MICs為0.12～2μg/ml）。雖然AMB是有效的，但會產(chǎn)生腎毒性等不良反應(yīng)，在治療毛霉病時需要控制好使用劑量和治療時間[29-30]。本研究結(jié)果顯示，VOR對所有毛霉目均無活性（MICs為4～>8 μ g/ml），與國外相關(guān)報道的結(jié)果一致[31-33]。

本研究尚存在一些局限型。首先，收集的菌株來自中國北方地區(qū)的合作醫(yī)院，所以目前的藥敏數(shù)據(jù)僅可代表中國北方地區(qū)的臨床菌株的藥敏表型，未來需擴大更多的合作醫(yī)院，收集來自全國各個區(qū)域的臨床菌株進(jìn)行全國多中心的研究；其次，由于臨床毛霉目菌株十分有限，目前只收集到了26株，未來仍需繼續(xù)擴大范圍和累積收集年限，收集更多毛霉目菌株。

綜上所述，本研究多中心體外藥敏結(jié)果可為臨床治療侵襲性肺曲霉病和毛霉病的參考，即ISA對曲霉屬的體外活性不次于VOR，且對大部分毛霉目具有良好活性，可作為治療初級侵襲性霉菌感染的治療藥物；而VOR對所有毛霉目均無活性；AMB對毛霉目的活性較強，但需要注意在治療侵襲性霉菌感染中其帶來的不良反應(yīng)。