頂空-固相微萃取和同時(shí)蒸餾萃取法提取肉桂的揮發(fā)性成分

詹思佳，蘇蔚瑩，王道梁，陳文嵩，蘭曉曄，孫雅倩，劉志彬，倪莉

（福州大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)研究所 福建省食品生物技術(shù)創(chuàng)新技術(shù)研究中心 福州 350108）

武夷巖茶屬于半發(fā)酵茶，是烏龍茶的典型代表。它可細(xì)分為肉桂、水仙、大紅袍、白雞冠等。其中，肉桂是武夷巖茶的主要品種，其風(fēng)味特征是香氣馥郁清長(zhǎng)，帶乳香或桂皮香或花果香[1-2]。

武夷肉桂的香氣是評(píng)價(jià)其品質(zhì)優(yōu)、劣的重要指標(biāo)。揮發(fā)性成分的萃取是分析茶葉香氣成分核心環(huán)節(jié)。常用的揮發(fā)性成分萃取方法有同時(shí)蒸餾萃取法（Simultaneous Distillation Extraction，SDE）、減壓蒸餾萃?。╒acuum Distillation Extraction，VDE）、攪拌棒吸附萃?。⊿tir Bar Sorptive Extraction，SBSE）、溶劑輔助香氣萃?。⊿olvent Assisted Flavor Evaporation，SAFE）、超臨界流體萃?。⊿upercritical Fluid Extraction，SFE）、頂空固相微萃取法（Head Space Solid Phase Microextraction，HS-SPME）等[3-4]。其中，HS-SPME 和SDE 是目前應(yīng)用最廣泛的揮發(fā)性成分萃取方法。張麗等[5]采用HS-SPME 萃取武夷巖茶的揮發(fā)性成分，結(jié)果表明該茶中醇類(lèi)、含氮化合物和醛類(lèi)所占比例較大。Liao 等[6]采用HS-SPME 萃取“烤玉米”香型綠茶的揮發(fā)性成分，其主要為醇類(lèi)、醛類(lèi)和酯類(lèi)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)HS-SPME 法所捕集到的主要是易揮發(fā)及中等揮發(fā)性的成分。周春娟等[7]發(fā)現(xiàn)SDE 法提取的鳳凰單樅茶的揮發(fā)性成分以醇類(lèi)、烷烴、萜烯等高沸點(diǎn)的揮發(fā)性成分居多。Song 等[8]比較了SDE 法和VDE 對(duì)南非紅葉茶揮發(fā)性成分的影響，結(jié)果表明：SDE 法可以有效萃取低揮發(fā)性和高分子量的成分。不同的揮發(fā)性成分提取方法各有優(yōu)、缺點(diǎn)。HS-SPME 法是一種集樣品采集、萃取、濃縮、進(jìn)樣、解析為一體的萃取方法，操作簡(jiǎn)便、快速，不需要添加溶劑，能夠體現(xiàn)樣品的真實(shí)香氣，然而，HS-SPME 不利于萃取揮發(fā)性弱的成分，同時(shí)其提取效率與試驗(yàn)條件的選取密切相關(guān)[3，9-10]。SDE 法將蒸餾與萃取合二為一，通過(guò)反復(fù)的萃取濃縮得到揮發(fā)性成分，然而，長(zhǎng)時(shí)間的高溫萃取易導(dǎo)致樣品香氣失真[11]。目前的研究大多采用單一的揮發(fā)性成分提取方法，而單獨(dú)使用SDE 或HS-SPME 可能無(wú)法充分反映肉桂茶的香氣成分。

為了充分提取肉桂茶的揮發(fā)性成分，獲得較為完整的香氣組分輪廓，本文采用HS-SPME 和SDE 兩種方法萃取肉桂茶的揮發(fā)性成分，并對(duì)HS-SPME 的萃取條件，包括萃取纖維材料、萃取時(shí)間和溫度、鹽添加量進(jìn)行優(yōu)化，為肉桂茶特征香氣成分的研究提高參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

茶葉樣品，福建省公泰茶葉有限公司武夷山制茶廠(chǎng)提供。氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉、乙醚（分析純），國(guó)藥基團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

7890-B/5977A 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GCMS），美國(guó)Agilent 公司；手動(dòng)固相微萃取裝置和固相微萃取頭（含有50/30 μm CAR/DVB/PDMS、100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB 和75 μm CAR/DVB/PDMS 萃取頭），美國(guó)Supelco 公司；BL150 電子天平，德國(guó)賽多利斯公司；DC-12 氮吹儀，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；DF-1 集熱式磁力攪拌器，金壇市鑫渃實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng)；同時(shí)蒸餾萃取裝置，福州科翰實(shí)驗(yàn)儀器貿(mào)易有限公司；QYSW-10B 超純水機(jī)，重慶前沿水處理設(shè)備有限公司；電熱套；HH-1 數(shù)字恒溫水浴鍋，常州普天儀器制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 茶香氣的萃取

1.3.1.1 頂空-固相微萃取條件優(yōu)化 稱(chēng)取0.1 g茶粉、5 mL 沸騰去離子水與磁力轉(zhuǎn)子一同置于15 mL 頂空瓶中，浸提5 min。使用SPME 萃取樣品中的揮發(fā)性成分，比較4 種纖維頭（100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS 和50/30 μm DVB/CAR/PDMS）、5 個(gè)萃取溫度（40，50，60，70，80 ℃）、5 個(gè)萃取時(shí)間（30，40，45，50，60 min）和5 個(gè)鹽添加量（10%，20%，30%，40%，50%）對(duì)揮發(fā)性成分的提取效果。SPME 在GC-MS 上的解吸附條件為250 ℃，5 min。

1.3.1.2 同時(shí)蒸餾萃取 依照文獻(xiàn)[11]報(bào)道的優(yōu)化的同時(shí)蒸餾萃取條件提取武夷肉桂的揮發(fā)性成分。得到的萃取液經(jīng)氮?dú)鉂饪s除去大部分乙醚溶劑至1 mL，移入棕色小瓶中密封，于-20 ℃冰箱保存，待GC-MS 分析。

1.3.2 GC-MS 分析條件 色譜條件：色譜柱HPINNOWAX 毛細(xì)管柱（30 m × 0.25 μm ×0.25 mm）；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持5 min，以5 ℃/min 升至120 ℃，再以10 ℃/min 升至240 ℃，保留5 min；后運(yùn)行溫度240 ℃，后運(yùn)行時(shí)間5 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣。載氣為高純He，純度99.999%。

質(zhì)譜條件：離子源溫度230 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃；掃描模式：全掃描；質(zhì)量掃描范圍：m/z 35-450。

1.4 數(shù)據(jù)分析

結(jié)合NIST11 譜庫(kù)檢索和保留指數(shù)RI，根據(jù)參考文獻(xiàn)[12]，[13]共同定性。揮發(fā)性成分定量采用面積歸一化法。

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)化的頂空-固相微萃取條件

2.1.1 萃取纖維 選擇合適的萃取纖維對(duì)茶香氣的萃取非常重要。萃取纖維是基于揮發(fā)性成分在涂有極性或非極性固定性薄層的熔融石英纖維上吸附和解吸，PDMS 為非極性萃取頭，主要吸附非極性揮發(fā)性成分；CAR/PDMS 和PDMS/DVB 具有雙極性特性；DVB/CAR/PDMS 包含3 種涂層，主要吸附C3～C20 揮發(fā)性和半揮發(fā)性成分[14]。本試驗(yàn)對(duì)4 種常見(jiàn)的萃取纖維（DVB/CAR/PDMS、CAR/PDMS、PMDS/DVB 和PDMS）在50 ℃下萃取45 min，并添加40% NaCl，進(jìn)行比較分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。不同萃取纖維所得揮發(fā)性成分的總量（總峰面積）有顯著差異（P＜0.05）。其中，DVB/CAR/PDMS 纖維所萃取的揮發(fā)性成分總峰面積和數(shù)量最多，而PDMS 最少，可能是因?yàn)镈VB/CAR/PDMS是一種具極性和非極性復(fù)合涂層的萃取纖維，它對(duì)揮發(fā)性成分的萃取效果最好。同時(shí)，這4 種常見(jiàn)的萃取纖維對(duì)不同種類(lèi)揮發(fā)性成分的萃取也存在較大的差異（圖2）。CAR/PDMS/DVB 對(duì)醇類(lèi)、酚類(lèi)、呋喃類(lèi)、含氮化合物、酮類(lèi)和酯類(lèi)的萃取效果好，CAR/PDMS 對(duì)含氮化合物和烴類(lèi)萃取效果好，PMDS/DVB 適合萃取酯類(lèi)成分。綜上，CAR/PDMS/DVB 對(duì)武夷肉桂揮發(fā)性成分的萃取效果最好。

圖1 萃取纖維對(duì)總峰面積（a）和峰數(shù)（b）的影響Fig.1 Effect of fibers on total peak area and total peak number

圖2 萃取纖維對(duì)不同揮發(fā)性成分類(lèi)別的影響Fig.2 Effect of fibers on the classes of volatile components

2.1.2 萃取溫度 在確定最佳萃取纖維材料（CAR/PDMS/DVB）后，探究萃取溫度（40，50，60，70，80 ℃）對(duì)肉桂揮發(fā)性成分的影響，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)萃取溫度為50 ℃時(shí)，揮發(fā)性成分的總峰面積和數(shù)量達(dá)到峰值，隨后，隨著溫度的上升，揮發(fā)性成分的總峰面積顯著下降。提高萃取溫度有利于加速揮發(fā)性成分的擴(kuò)散速率，而HS-SPME過(guò)高的萃取溫度會(huì)降低其的分配系數(shù)，導(dǎo)致?lián)]發(fā)性成分的萃取效率降低[15]。綜上，選擇50 ℃作為最佳的萃取溫度。

圖3 萃取溫度對(duì)總峰面積（a）和峰數(shù)（b）的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on total peak area and total peak number

2.1.3 萃取時(shí)間 萃取纖維需暴露在頂空一段時(shí)間，以萃取茶葉中的揮發(fā)性成分。探究5 個(gè)萃取時(shí)間（30，40，45，50，60 min）對(duì)揮發(fā)性成分的影響。結(jié)果表明，揮發(fā)性成分的總峰面積和數(shù)量隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加，在60 min 時(shí)顯著降低（圖4）。這一變化趨勢(shì)與Du 等[14]的研究結(jié)果一致，HS-SPME 的萃取時(shí)間在低于60 min 時(shí)，揮發(fā)性成分總峰面積顯著上升，而高于60 min 時(shí)顯著降低。樣品萃取時(shí)間過(guò)短，頂空、萃取纖維和茶湯之間無(wú)法達(dá)到平衡；萃取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)引起揮發(fā)性成分在萃取纖維吸附相上發(fā)生位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致香氣成分總量降低[16]。選擇最佳萃取時(shí)間50 min。

圖4 萃取時(shí)間對(duì)總峰面積（a）和峰數(shù)（b）的影響Fig.4 Effect of extraction times on total peak area and total peak number

2.1.4 鹽添加量 選擇加鹽量10%，20%，30%，40%，50%，研究鹽添加量對(duì)揮發(fā)性成分的影響。茶葉萃取過(guò)程中加鹽有利于降低揮發(fā)性成分的水溶性，促進(jìn)擴(kuò)散速率，結(jié)果見(jiàn)圖5。揮發(fā)性成分的總峰面積在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著差異。當(dāng)鹽添加量為20%時(shí)，收集的揮發(fā)性成分種類(lèi)最多。這可能是因?yàn)辂}含量過(guò)高，存在溶液黏度增大的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致萃取效率降低[17]。選取最佳鹽添加量20%。

圖5 鹽添加量對(duì)總峰面積（a）和峰數(shù)（b）的影響Fig.5 Effect of salt contents on total peak area and total peak number

2.2 HS-SPME 和SDE 兩種提取方法所得揮發(fā)性成分

采用優(yōu)化后的HS-SPME 條件和文獻(xiàn)報(bào)道的SDE 條件[11]提取武夷肉桂揮發(fā)性成分，采用GCMS 進(jìn)行定性、定量分析，所得總離子流圖見(jiàn)圖6。采用兩種萃取方法共鑒定出93 種揮發(fā)性成分，各成分的定性與定量結(jié)果見(jiàn)表1。其中，采用HSSPME 法共鑒定出84 種揮發(fā)性成分，SDE 法為40種。兩種方法共同檢出的成分有26 種。綜合兩種提取方法可知，武夷肉桂中的主要的揮發(fā)性成分有雜環(huán)類(lèi)化合物、醇類(lèi)、烯烴類(lèi)和酯類(lèi)等。兩種方法對(duì)這些物質(zhì)的萃取效率有一定差異。

圖6 HS-SPME（a）與SDE（b）提取武夷肉桂茶揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.6 Total ion current chromatograms of volatile compounds from Wuyi rougui extracted by HS-SPME and SDE

雜環(huán)類(lèi)化合物，如吡嗪、吡咯、吲哚、呋喃等[18]，主要是茶葉在加工過(guò)程中發(fā)生美拉德反應(yīng)而形成的香氣成分。從表1 可知，2-甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪、2，6-二甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪和吲哚在兩種提取方法中均有檢出。吡嗪、吡咯和呋喃是美拉德反應(yīng)形成的關(guān)鍵產(chǎn)物，其中吡嗪是具有強(qiáng)烈的焙烤香、堅(jiān)果香的揮發(fā)性成分，并且有較低的感官閾值[19]。吲哚也是烏龍茶的重要香氣成分，在低濃度下呈現(xiàn)濃郁的花香。對(duì)比兩種提取方法發(fā)現(xiàn)，HS-SMPE 對(duì)吡嗪、吡咯和呋喃的提取效率更高，例如用HS-SPME 法所得2，5-二甲基吡嗪含量為1.39%，而SDE 法為0.60%；HS-SPME 法檢出茶吡咯為15.13%，而SDE 法中未被檢出；在HS-SPME 法得到的糠醛含量為2.22%，而SDE 法為1.39%。然而，SDE 有利于吲哚的萃取，其含量為1.24%，而HS-SPME法僅為0.47%。

表1 經(jīng)HS-SPME 和SDE 萃取后武夷肉桂的揮發(fā)性成分Table 1 The volatile compounds of Wuyi rougui by HS-SPME and SDE

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

醇類(lèi)在肉桂中所占比例較大，僅次于雜環(huán)類(lèi)化合物。其中芳樟醇、苯甲醇、苯乙醇和橙花叔醇在兩種提取方式下均有檢出。芳樟醇是茶葉中呈現(xiàn)花香的萜烯醇類(lèi)。在磷酸甲基赤蘚糖醇途徑中生成的香葉焦磷酸是生成芳樟醇的重要前體物質(zhì)[20]。苯甲醇和苯乙醇是茶葉中呈現(xiàn)“果香”的重要成分，可以通過(guò)苯丙氨酸轉(zhuǎn)化形成[21]。橙花叔醇具有玫瑰、水果香氣，是衡量肉桂品質(zhì)的重要香氣成分。兩種提取方法對(duì)醇類(lèi)的提取效率存在很大的差異，HS-SPME 法適合提取中、低沸點(diǎn)的脂肪族醇類(lèi)，如己醇、反-3-己烯醇、庚醇和1-辛烯-3-醇等，它們?cè)赟DE 法均未檢出，可能因?yàn)镾DE 法的長(zhǎng)時(shí)間高溫萃取導(dǎo)致中、低沸點(diǎn)脂肪族醇類(lèi)的損失。SDE 法有利于提取揮發(fā)性較低的醇類(lèi)，如葉醇和異植醇，它們僅在SDE 法中被檢出，主要呈現(xiàn)清香和花香，然而，它們的氣味閾值高不易被感知，雖然含量較高，但是這兩種化合物的揮發(fā)性較低[14，22]，對(duì)武夷肉桂的香氣貢獻(xiàn)不大。

烯烴類(lèi)也是構(gòu)成武夷肉桂揮發(fā)性成分的重要一部分。王鵬杰等[23]發(fā)現(xiàn)武夷巖茶香氣成分以醇、烯、酯類(lèi)化合物居多，橙花叔醇、α-法尼烯、吲哚、（Z）-己酸-3-己烯酯是巖茶的特征香氣成分。兩種提取方法均檢出α-法尼烯、對(duì)二甲苯。α-法尼烯主要呈花香，可通過(guò)類(lèi)胡蘿卜素非酶促氧化而形成[24]，其在HS-SPME 和SDE 法的含量分別為0.48%和1.07%，是武夷肉桂較為重要的香氣成分。HSSPME 法檢出對(duì)二甲苯為4.52%，SDE 法僅為0.16%。

酯類(lèi)通常被認(rèn)為是茶葉中一類(lèi)具有花果香特征的香氣成分，是肉桂重要的一類(lèi)揮發(fā)性成分。2-糠酸甲酯、己酸己酯、水楊酸甲酯和棕櫚酸甲酯在兩種提取方法中均有檢出，僅含量存在差異。如2-糠酸甲酯在茶葉中主要呈現(xiàn)焦糖香，它在SDE法的含量為1.60%，HS-SPME 法為0.66%。棕櫚酸甲酯是一類(lèi)高沸點(diǎn)、高分子量的成分，主要呈現(xiàn)蠟香，氣味強(qiáng)度極低，在SDE 法檢出為2.44%，而在HS-SPME 法僅為0.04%。水楊酸甲酯是茶葉中重要的甜香、薄荷香風(fēng)味的貢獻(xiàn)者，HS-SPME 的萃取效率較高，為2.82%，而SDE 法僅為0.28%。茉莉內(nèi)酯、己酸葉醇酯、乙酸芐酯、苯乙酸甲酯等僅在HS-SPME 中被檢出，亞麻酸甲酯、鄰苯二甲酸二丁酯等僅在SDE 法被檢出。

HS-SPME 較SDE 法更適合提取酮類(lèi)成分，僅β-紫羅蘭酮在兩種提取方法均有檢出，它是茶葉中一類(lèi)具有木質(zhì)味、紫羅蘭香的成分，可通過(guò)β-類(lèi)胡蘿卜素氧化形成[25]，然而，它在肉桂中的含量較低。與SDE 相比，HS-SPME 法檢出的酚類(lèi)和酸類(lèi)含量較少，可能是因?yàn)榉宇?lèi)和酸類(lèi)成分一般沸點(diǎn)較高，而HS-SPME 相對(duì)于SDE 法而言是一種比較溫和的萃取方式，萃取溫度較低不利于這些成分的萃取。

通過(guò)兩種提取方法的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)HS-SPME法和SDE 法所得揮發(fā)性成分含量和種類(lèi)存在明顯差異。相比于SDE，HS-SPME 法對(duì)雜環(huán)類(lèi)化合物、中低沸點(diǎn)脂肪族醇類(lèi)、烯烴類(lèi)、酮類(lèi)的萃取效率高；而SDE 法適合萃取分子量大和揮發(fā)性弱的成分，如沸點(diǎn)較高的醇類(lèi)（葉醇和異植醇）、酚類(lèi)和酸類(lèi)。兩者對(duì)于酯類(lèi)的萃取效果相當(dāng)。HS-SPME法相對(duì)于SDE 法萃取條件較為溫和，有利于萃取揮發(fā)性強(qiáng)和熱敏性的成分，然而，限制了揮發(fā)性較弱成分的提取。SDE 法需在長(zhǎng)時(shí)間高溫條件下反復(fù)萃取濃縮，易造成低沸點(diǎn)和熱不穩(wěn)定性揮發(fā)性成分的損失，然而，有利于萃取分子量較高、揮發(fā)性弱的成分。這兩種萃取方法各具特點(diǎn)，可相互補(bǔ)充。使用兩種萃取方法可更全面反映肉桂的揮發(fā)性成分。

3 結(jié)論

本文優(yōu)化了HS-SPME 提取武夷肉桂揮發(fā)性成分的方法，結(jié)果表明最優(yōu)的提取條件為：采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取纖維，萃取溫度50 ℃，萃取時(shí)間50 min，NaCl 添加量30%，在該條件下共獲得84 種揮發(fā)性成分。對(duì)比了優(yōu)化的HSSPME 與文獻(xiàn)報(bào)道的SDE 兩種萃取方法對(duì)武夷肉桂揮發(fā)性成分的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者對(duì)肉桂揮發(fā)性成分的提取效果存在明顯差異，對(duì)于酯類(lèi)的萃取效率相當(dāng)。HS-SPME 在提取雜環(huán)類(lèi)化合物、中、低沸點(diǎn)脂肪族醇類(lèi)、烯烴類(lèi)、酮類(lèi)的效率高于SDE；而SDE 因提取時(shí)間長(zhǎng)，提取溫度高，更有利于萃取高分子量、高沸點(diǎn)的揮發(fā)性成分提取，同時(shí)會(huì)造成低沸點(diǎn)揮發(fā)性成分的損失。綜上，結(jié)合兩種提取方法可全面反映肉桂的香氣成分。