組織工程技術(shù)在細(xì)胞培養(yǎng)肉上的應(yīng)用進(jìn)展

包立輝，周鳳，王向東，金巖

（1 西安組織工程與再生醫(yī)學(xué)研究所 西安710032 2 空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院組織工程中心 西安 710032）

根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織的預(yù)測(cè)，預(yù)計(jì)到2050年，全世界對(duì)肉食產(chǎn)品的需求將增長(zhǎng)73%。這是由于世界各地人口增長(zhǎng)、收入增加和城市化進(jìn)程加快引起的對(duì)肉類(lèi)消費(fèi)需求的增加所致[1]。全球日益增長(zhǎng)的肉類(lèi)消費(fèi)需求，必然導(dǎo)致畜牧業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的持續(xù)擴(kuò)大，而牲畜肉類(lèi)行業(yè)的這種指數(shù)增長(zhǎng)對(duì)生態(tài)、資源和糧食生產(chǎn)系統(tǒng)的可持續(xù)性構(gòu)成了巨大挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)肉類(lèi)生產(chǎn)系統(tǒng)對(duì)溫室氣體排放大量的二氧化碳、甲烷和一氧化二氮，同時(shí)，對(duì)土地資源占用、水和能源消耗產(chǎn)生了顯著影響[2]。另外，全球畜牧業(yè)的肉類(lèi)生產(chǎn)能力趨于飽和狀態(tài)，在未來(lái)，傳統(tǒng)畜牧業(yè)的肉類(lèi)產(chǎn)量可能難以滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的消費(fèi)和營(yíng)養(yǎng)需求[1]。盡管素食主義者在各國(guó)人口中都占有一定比例，然而，在工業(yè)化社會(huì)中素食者的比例還很低，而且在過(guò)去35 年中沒(méi)有增加。另外，從全球龐大的且持續(xù)增長(zhǎng)的人口基數(shù)以及人體飲食對(duì)優(yōu)質(zhì)動(dòng)物蛋白的需求來(lái)看，通過(guò)放棄肉食消費(fèi)，不太可能減少肉類(lèi)需求[3]。從動(dòng)物福利及倫理角度來(lái)看，大量屠宰動(dòng)物以滿(mǎn)足人類(lèi)的肉類(lèi)消費(fèi)行為，與當(dāng)今高度發(fā)展的人類(lèi)文明相悖。因此，一種基于細(xì)胞生物學(xué)及組織工程技術(shù)的新型肉類(lèi)替代品——細(xì)胞培養(yǎng)肉，逐漸成為當(dāng)前肉類(lèi)食品體系危機(jī)的潛在解決方案。細(xì)胞培養(yǎng)肉也被稱(chēng)為“試管肉”“離體肉”“細(xì)胞基人造肉”等，是采用動(dòng)物來(lái)源的組織提取種子細(xì)胞，通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)的方式生產(chǎn)出的生物質(zhì)。該技術(shù)來(lái)源于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，其目標(biāo)是利用體外培養(yǎng)的功能性組織恢復(fù)功能失調(diào)或器質(zhì)受損的器官[3]。

1 細(xì)胞培養(yǎng)肉的發(fā)展簡(jiǎn)況

早在20 世紀(jì)30 年代，溫斯頓·丘吉爾（Winston Churchill）第1 次提出細(xì)胞培養(yǎng)肉的暢想，幾十年后，威廉·范·埃倫（Willem van Eelen）也提出同樣的想法[4]。在整個(gè)20 世紀(jì)，關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)肉的想法一直處于人們所關(guān)注的重點(diǎn)之外，然而，隨著傳統(tǒng)肉類(lèi)生產(chǎn)的弊端日益凸顯，特別是給生態(tài)和資源造成的沉重負(fù)擔(dān)以及動(dòng)物福利，這一暢想正逐漸變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)肉的研究項(xiàng)目最先由美國(guó)國(guó)家航天局（NASA）發(fā)起，目的是為長(zhǎng)距離太空航行提供肉類(lèi)來(lái)源。而真正把細(xì)胞培養(yǎng)肉從預(yù)想變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)的則是荷蘭馬斯特里赫特大學(xué)生理學(xué)系教授馬克·波斯特（Mark Post），2013 年8 月，馬克·波斯特向媒體展示了一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)牛肉漢堡作為第1 個(gè)“概念證明”，證明了這一想法的可行[5]。隨后，國(guó)內(nèi)和國(guó)際細(xì)胞培養(yǎng)肉領(lǐng)域進(jìn)入快速發(fā)展時(shí)期。從全球細(xì)胞培養(yǎng)肉企業(yè)數(shù)量來(lái)看，截止2021 年，涉及細(xì)胞培養(yǎng)肉研發(fā)的初創(chuàng)企業(yè)數(shù)量達(dá)到107 家，其中僅2021 年新增的細(xì)胞肉風(fēng)投企業(yè)數(shù)量就達(dá)到21 家。國(guó)內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)肉行業(yè)也出現(xiàn)諸多進(jìn)展，繼2019 年有研究團(tuán)隊(duì)利用豬來(lái)源骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成功培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)豬肉以來(lái)，2021 年又發(fā)布細(xì)胞培養(yǎng)豬五花肉等產(chǎn)品[6]。即便在細(xì)胞培養(yǎng)肉領(lǐng)域越來(lái)越多標(biāo)志性事件的出現(xiàn)預(yù)示著其快速發(fā)展的勢(shì)頭，然而，距離細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)源的新蛋白出現(xiàn)在大眾餐桌上仍有很長(zhǎng)的路要走。

2 基于組織工程技術(shù)的細(xì)胞工程肉構(gòu)建

組織工程（tissue engineering）技術(shù)是使用活細(xì)胞、生物相容材料和合適的生化（例如：生長(zhǎng)因子）和物理（例如：攪拌式生物反應(yīng)器）因素，產(chǎn)生組織樣結(jié)構(gòu)，用于修復(fù)或改善缺損組織、器官結(jié)構(gòu)和功能的生物替代物的一門(mén)科學(xué)[7]。我國(guó)的組織工程技術(shù)在國(guó)家的大力支持下，在基礎(chǔ)研究方面取得了很大的成績(jī)，研究的重點(diǎn)主要是組織工程皮膚、軟骨、骨、肌腱、角膜、血管、微囊化細(xì)胞等.其中，金巖教授的團(tuán)隊(duì)研發(fā)的由成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞和膠原膜構(gòu)成的組織工程皮膚[8]和基于脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的生物工程角膜[9]已獲得國(guó)家醫(yī)療器械產(chǎn)品注冊(cè)證，獲得了上市批準(zhǔn)。在骨骼肌方面，最早在20 世紀(jì)60 年代Konigsberg 等[10]將原代雞胚肌肉細(xì)胞在培養(yǎng)皿上分化為一個(gè)具有交叉橫紋肌的纖維樣細(xì)胞群。2013 年，荷蘭生物學(xué)家Mark Post 用組織工程技術(shù)生產(chǎn)出有史以來(lái)的第1 塊人造肉，引起廣泛的關(guān)注[11]。隨著三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和各種新型生物支架材料的發(fā)展，使利用組織工程技術(shù)生產(chǎn)質(zhì)量受控、無(wú)需飼養(yǎng)動(dòng)物的肉類(lèi)成為可能。而實(shí)現(xiàn)這一切的前提是動(dòng)物細(xì)胞的有效擴(kuò)增，更加廉價(jià)的生物材料，不同細(xì)胞合理排列的組織工程以及注重營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和感官特性的技術(shù)開(kāi)發(fā)。

2.1 種子細(xì)胞

細(xì)胞培養(yǎng)肉的培養(yǎng)由多個(gè)環(huán)節(jié)組成，綜合來(lái)看多種類(lèi)型的細(xì)胞培養(yǎng)肉，首要環(huán)節(jié)是種子細(xì)胞的制備。從健康的供體動(dòng)物提取組織，經(jīng)原代培養(yǎng)后實(shí)現(xiàn)細(xì)胞體外擴(kuò)增，對(duì)達(dá)到一定數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行凍存形成種子細(xì)胞[12]。這一環(huán)節(jié)主要是針對(duì)種子細(xì)胞庫(kù)的建立，具備一定規(guī)模的種子細(xì)胞庫(kù)可為細(xì)胞培養(yǎng)肉的規(guī)模化生產(chǎn)提供穩(wěn)定的細(xì)胞供應(yīng)，因此種子細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及種子細(xì)胞庫(kù)的建立是細(xì)胞培養(yǎng)肉必不可少的重要環(huán)節(jié)。本文下面闡述細(xì)胞培養(yǎng)肉中常用的幾種細(xì)胞類(lèi)型。

2.1.1 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞是駐留在肌纖維基底膜下，生理?xiàng)l件下為靜息狀態(tài)，當(dāng)肌肉損傷發(fā)生時(shí)，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞能夠分化成肌細(xì)胞，進(jìn)一步形成多核肌管，填充到肌纖維中[13-14]，因此，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞是目前公認(rèn)的細(xì)胞培養(yǎng)肉最適合的種子細(xì)胞來(lái)源[15]。骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞是肌肉中存在一種特異性的干細(xì)胞，隨著骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化特性被發(fā)現(xiàn)，它能高效地再現(xiàn)肌肉生成過(guò)程，這為通過(guò)在體外培養(yǎng)動(dòng)物肌肉組織提供了證據(jù)支持[16]。目前已形成成熟的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞肉培養(yǎng)策略，包括用于細(xì)胞分離的肌肉組織取樣、肌肉組織處理方法和骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分離、原代細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞傳代培養(yǎng)、肌肉分化和成熟、肌肉組織收獲[17]。骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程是：從供體動(dòng)物組織樣本中分離骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，將這些細(xì)胞置于含有多種因子的培養(yǎng)液中分別經(jīng)過(guò)原代培養(yǎng)和傳代擴(kuò)增培養(yǎng)，肌衛(wèi)星細(xì)胞逐漸成為增殖性成肌細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞擴(kuò)增至一定數(shù)量時(shí)，向培養(yǎng)液中添加具有定向誘導(dǎo)能的因子，使成肌細(xì)胞融合成不可增殖的肌細(xì)胞，這些肌細(xì)胞繼續(xù)融合成多核肌管，隨著細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成和積累，多核肌管體積逐漸增大[18-20]。自首個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)牛肉漢堡餅是基于骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)的報(bào)道以來(lái)，后續(xù)大多細(xì)胞數(shù)培養(yǎng)肉的研究主要集中于骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的體外培養(yǎng)和分化[19]。雖然骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的研究是一個(gè)成熟的領(lǐng)域，但是這些步驟仍有待優(yōu)化，以適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)肉規(guī)?；囵B(yǎng)的要求。例如，在延長(zhǎng)肌肉組織儲(chǔ)存時(shí)間后，分離出的牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和肌源性分化特性的變化，將影響細(xì)胞培養(yǎng)肉生產(chǎn)中對(duì)組織樣本驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)的制定和肌肉組織樣本儲(chǔ)存方法的確定[21]。

2.1.2 干細(xì)胞及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 雖然骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞被較多地采用為細(xì)胞培養(yǎng)肉種子細(xì)胞，但是其屬于單能干細(xì)胞，分化方向單一，不能分化為骨骼肌以外的組織，并且在培養(yǎng)中很難保持其干性，經(jīng)歷一定次數(shù)的傳代后很容易自發(fā)分化為肌管和更成熟的肌原纖維[22]。干細(xì)胞是一種未分化的細(xì)胞群，其特征是具有自我更新的能力，可在相當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞中保持未分化的狀態(tài)，在一定誘導(dǎo)條件下分化為不同類(lèi)型的細(xì)胞和組織。干細(xì)胞有多種來(lái)源，其效力各不相同。有幾種干細(xì)胞已被鑒定并用于體外培養(yǎng)肉。根據(jù)發(fā)育來(lái)源不同，干細(xì)胞分為兩類(lèi)：源自植入前胚胎的干細(xì)胞被稱(chēng)為胚胎干細(xì)胞，源自出生后組織的干細(xì)胞被稱(chēng)為成體干細(xì)胞。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞是通過(guò)在體細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)確定的轉(zhuǎn)錄因子而分化的特定細(xì)胞類(lèi)型，例如，通過(guò)轉(zhuǎn)錄Oct4、Sox2、KLF4 和c-Myc 等特定轉(zhuǎn)錄因子，可以成功誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞的多能性[23]。干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞被認(rèn)為是細(xì)胞培養(yǎng)肉的另一種子細(xì)胞來(lái)源。雖然這兩類(lèi)細(xì)胞都具備向肌肉纖維分化的潛力，但是與肌肉衛(wèi)星細(xì)胞不同的是：前者需在含有定向誘導(dǎo)分化劑的條件培養(yǎng)液作用下才能調(diào)動(dòng)潛在的分化機(jī)制。因此，要尋找符合食品安全要求的干細(xì)胞分化誘導(dǎo)成分或者從植物中提取合適的天然成分以對(duì)其進(jìn)行定向分化誘導(dǎo)。另外，由于涉及因子轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的安全性和在細(xì)胞培養(yǎng)肉大規(guī)模生產(chǎn)中的適用性尚未得到充分證實(shí)，因此在干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的成肌分化誘導(dǎo)過(guò)程中，非預(yù)期分化的可能性仍是需要重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題。

2.2 基于微載體的細(xì)胞工程肉規(guī)?；囵B(yǎng)策略

無(wú)論是通過(guò)飼養(yǎng)動(dòng)物生產(chǎn)的傳統(tǒng)肉還是細(xì)胞培養(yǎng)肉，其產(chǎn)生的最基本的生理活動(dòng)都離不開(kāi)細(xì)胞的分裂增殖及其伴隨的蛋白質(zhì)與其它物質(zhì)的合成。因此，細(xì)胞培養(yǎng)肉需要首先解決的問(wèn)題是細(xì)胞如何在體外環(huán)境中實(shí)現(xiàn)規(guī)模化增殖。雖然細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)過(guò)多年發(fā)展逐漸成為一項(xiàng)成熟的技術(shù)，在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、制藥、生物學(xué)等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，但是這一細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)多采用平皿方式，其出發(fā)點(diǎn)是更多的為實(shí)驗(yàn)室研究提供所需要的細(xì)胞模型，從規(guī)?；尚行苑矫鎭?lái)講其并不具備產(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)化落地的條件，因此在細(xì)胞培養(yǎng)肉的研發(fā)過(guò)程中仍需尋找一種可以在產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化中適合規(guī)模放大的細(xì)胞體外生產(chǎn)方式。

三維培養(yǎng)系統(tǒng)的引入是細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的一項(xiàng)重要進(jìn)展，其中，基于微載體的細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)是一種具有良好應(yīng)用前景的方式[24]。微載體細(xì)胞培養(yǎng)方式的本質(zhì)是通過(guò)制備具有表面微結(jié)構(gòu)的微球，為細(xì)胞黏附提供更多的表面積，而微載體本身可以在攪拌罐式生物反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)懸浮，通過(guò)這種方式來(lái)提高細(xì)胞的增殖效率，同時(shí)微載體材料本身的生物相容性和機(jī)械特性也為細(xì)胞模擬出類(lèi)似體內(nèi)環(huán)境的體外擴(kuò)增微環(huán)境[25]。近年來(lái)，微載體經(jīng)歷了多次修改和創(chuàng)新以適應(yīng)多種細(xì)胞類(lèi)型對(duì)基質(zhì)的要求，目前已有多種商品化的微載體可從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)。雖然細(xì)胞培養(yǎng)微載體已經(jīng)發(fā)展到相對(duì)成熟的階段，但是細(xì)胞培養(yǎng)肉的應(yīng)用場(chǎng)景使其面臨一系列特有的限制。例如，為了滿(mǎn)足細(xì)胞培養(yǎng)肉的食品屬性和規(guī)?；a(chǎn)的要求，應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)肉中的支架材料在具備良好生物相容性的同時(shí)還需兼顧可食用、低成本及易批量制備等創(chuàng)新屬性，這對(duì)新型材料的研發(fā)和原料的篩選帶來(lái)了更多的挑戰(zhàn)。若將這些考量融入微載體研發(fā)的初始設(shè)計(jì)階段，則會(huì)顯著縮短微載體的研發(fā)周期。

2.3 基于無(wú)血清條件培養(yǎng)液的細(xì)胞外基質(zhì)自分泌

微載體技術(shù)解決了細(xì)胞工程肉構(gòu)建所需的細(xì)胞數(shù)量問(wèn)題，然而，通過(guò)分析傳統(tǒng)肉的成分可以得知，傳統(tǒng)肉的食用部分并不單獨(dú)由細(xì)胞數(shù)量的疊加形成，而是通過(guò)一種復(fù)雜的空間排布形成傳統(tǒng)肉的特殊紋理，由細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)填充在細(xì)胞間的空隙部位，這一生理結(jié)構(gòu)賦予肉類(lèi)特有的質(zhì)感，而細(xì)胞外基質(zhì)也是肉類(lèi)芳香成分及多汁風(fēng)味的重要來(lái)源。由于細(xì)胞外基質(zhì)某些成分的改變會(huì)影響傳統(tǒng)肉的感官品質(zhì)[26]，因此隨著細(xì)胞在微載體黏附并增殖達(dá)到一定融合率時(shí)，細(xì)胞工程肉構(gòu)建的重點(diǎn)將轉(zhuǎn)變?yōu)槲⑤d體-細(xì)胞球基質(zhì)的重塑。

2.3.1 無(wú)血清培養(yǎng) 培養(yǎng)基通常由水、葡萄糖、氨基酸、脂質(zhì)、生長(zhǎng)因子、維生素和無(wú)機(jī)鹽和微量元素組成，為了維持培養(yǎng)液穩(wěn)定的pH，還會(huì)加入pH緩沖系統(tǒng)[27]。此外，動(dòng)物血清經(jīng)常被添加到細(xì)胞培養(yǎng)液中，這是因?yàn)樗性S多細(xì)胞附著、生長(zhǎng)和增殖所需的因子和其它營(yíng)養(yǎng)成分[28]。大多數(shù)細(xì)胞的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法依賴(lài)于動(dòng)物血清，這些血清成分的確切性質(zhì)尚不清楚，存在眾所周知的弊端，包括成本高，供應(yīng)不穩(wěn)定，批次變化以及可能傳播性疾病等[28]。另外，從動(dòng)物供體制備血清用于細(xì)胞培養(yǎng)肉，本質(zhì)上是不可持續(xù)的，在動(dòng)物福利問(wèn)題和細(xì)胞肉“清潔”屬性的問(wèn)題上也是相悖的[29]。因此，在細(xì)胞培養(yǎng)肉的研發(fā)和生產(chǎn)中，無(wú)血清培養(yǎng)基比動(dòng)物血清更加符合對(duì)食品安全以及細(xì)胞培養(yǎng)肉中涉及動(dòng)物福利的要求。隨著這一問(wèn)題被越來(lái)越多地關(guān)注，目前開(kāi)發(fā)了用于多種細(xì)胞類(lèi)型的無(wú)血清培養(yǎng)液和培養(yǎng)方法，這些培養(yǎng)液不含動(dòng)物源成分，而是采用重組蛋白或植物來(lái)源蛋白，如酵母、大米、大豆和其它植物和微生物材料的水解物（酶解物或酸消化物），作為氨基酸、肽、維生素和微量元素的補(bǔ)充來(lái)源添加到培養(yǎng)液中，替代原來(lái)的動(dòng)物成分和有食品安全爭(zhēng)議的成分。近期有研究[30]報(bào)道一種用于多能干細(xì)胞的低成本無(wú)血清培養(yǎng)基被應(yīng)用在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的培養(yǎng)中，這種培養(yǎng)基通過(guò)添加單一組分在大米中表達(dá)的重組白蛋白，可以支持骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞高效擴(kuò)增，并且無(wú)血清培養(yǎng)的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞經(jīng)多次傳代仍能保持肌源性。天然來(lái)源的植物提取物也被建議用作細(xì)胞培養(yǎng)肉的血清替代物，如將1-磷酸鞘氨醇脂質(zhì)和富含氨基酸的蘑菇提取物作為血清培養(yǎng)基[27]。

2.3.2 細(xì)胞外基質(zhì)重塑與組織再生 在肌肉再生過(guò)程中，組織中巨噬細(xì)胞的極化表型介導(dǎo)肌肉再生所需的免疫微環(huán)境。豬心臟脫細(xì)胞ECM 支架材料和臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞混合物，通過(guò)調(diào)節(jié)肌肉再生中巨噬細(xì)胞的M2 表型極化，為再生與修復(fù)過(guò)程介導(dǎo)了適宜的免疫微環(huán)境，這表明，在修復(fù)與再生過(guò)程中，細(xì)胞外基質(zhì)的重塑與組織再生往往是伴隨著密切相互作用的[31]。天然脫細(xì)胞組織來(lái)源的細(xì)胞外基質(zhì)支架材料，在模擬再生微環(huán)境方面表現(xiàn)出強(qiáng)大的天然優(yōu)勢(shì)，然而天然組織來(lái)源的脫細(xì)胞支架材料對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)肉來(lái)說(shuō)是不可持續(xù)的，并且也與細(xì)胞培養(yǎng)肉的初衷相悖。因此，細(xì)胞膜片技術(shù)和細(xì)胞聚合體技術(shù)等無(wú)支架技術(shù)，以及細(xì)胞外囊泡介導(dǎo)的無(wú)細(xì)胞再生系統(tǒng)等同樣在組織工程與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景。富含血小板的血漿與牙周膜干細(xì)胞生物膜片的混合物，可顯著增強(qiáng)骨再生部位的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生及沉積，為骨組織的修復(fù)提供了高度仿生的再生環(huán)境[32]。鈦+牙周膜干細(xì)胞膜片+羥基磷灰石的復(fù)合物促進(jìn)牙周再生，鈦納米管的加入有效提高牙周膜干細(xì)胞的初始黏附和擴(kuò)散，以及膠原的分泌[33]。細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生改善了組織工程中種子細(xì)胞的黏附、遷移和增殖，并有助于種子細(xì)胞實(shí)現(xiàn)原生組織中的空間排布方式[34]。無(wú)論在組織工程與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域還是細(xì)胞培養(yǎng)肉領(lǐng)域，細(xì)胞外基質(zhì)為改善移植的種子細(xì)胞生態(tài)位的生物相容性發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。然而，出于醫(yī)療或?qū)嶒?yàn)室研究目的的細(xì)胞外基質(zhì)重塑策略，可能不適合細(xì)胞培養(yǎng)肉對(duì)規(guī)?；糯蟮囊?。采用可食用、易于大規(guī)模制備的且低成本的原料構(gòu)建生物支架來(lái)還原天然細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境，將成為解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵途徑。

2.3.3 構(gòu)建生物支架材料，還原天然細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境 在3D 支架材料上接種細(xì)胞是許多現(xiàn)有和假設(shè)的細(xì)胞培養(yǎng)肉生物過(guò)程的關(guān)鍵步驟。細(xì)胞培養(yǎng)肉生物質(zhì)的體外形成，是基于種子細(xì)胞在三維空間下的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌與積累。支架材料對(duì)細(xì)胞間氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝產(chǎn)物的排出起著至關(guān)重要的作用，需要考慮支架材料對(duì)細(xì)胞的黏附性、生物相容性以及其本身的生物力學(xué)特性、機(jī)械強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。組織培養(yǎng)支架材料控制著細(xì)胞培養(yǎng)肉生物質(zhì)的外部幾何形狀和生物質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞類(lèi)型及分布，并對(duì)生物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和質(zhì)地產(chǎn)生直接影響[35-37]。在細(xì)胞培養(yǎng)肉支架材料研發(fā)的初始設(shè)計(jì)階段，盡管支架材料技術(shù)在再生醫(yī)學(xué)和組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用已十分廣泛，然而，用于細(xì)胞培養(yǎng)肉的支架材料還面臨著一系列的獨(dú)有的限制。例如，為了滿(mǎn)足細(xì)胞培養(yǎng)肉的食品屬性和規(guī)?；a(chǎn)的要求，應(yīng)用在細(xì)胞培養(yǎng)肉中的支架材料在具備良好生物相容性的同時(shí)還需兼顧可食用、低成本及易批量制備等創(chuàng)新屬性，這對(duì)新型材料的研發(fā)和原料的篩選工作帶來(lái)更多的挑戰(zhàn)。富含植物蛋白的多糖水凝膠支架已被用于細(xì)胞培養(yǎng)肉支架材料的研究中，如結(jié)冷膠和瓊脂糖凝膠混合大豆和豌豆蛋白制備的支架材料，對(duì)C2C12 成肌細(xì)胞系表現(xiàn)出良好的生物相容性和細(xì)胞分布，可在未來(lái)細(xì)胞培養(yǎng)肉工業(yè)中的細(xì)胞封裝型支架材料領(lǐng)域表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[37]。使用明膠和豆?jié){制備復(fù)合支架，對(duì)共培養(yǎng)的C2C12 成肌細(xì)胞系和3T3-L1 前脂肪細(xì)胞系表現(xiàn)出良好的生物相容性，通過(guò)層疊接種這兩種細(xì)胞，形成了含有肌肉樣層和脂肪樣層的培養(yǎng)肉，表達(dá)肌球蛋白的肌樣層和富含脂肪的脂肪樣層被夾在中間以形成含脂肪的肌肉組織。這種支架材料為肌肉樣質(zhì)地的多汁細(xì)胞肉的開(kāi)發(fā)提供了思路[38]。紋理大豆蛋白作為可食用的多孔蛋白質(zhì)基生物材料，可以支持牛骨骼肌細(xì)胞的附著和增殖，實(shí)現(xiàn)了基于細(xì)胞-支架材料的肌生成和ECM 沉積的升高，并具備牛肉的風(fēng)味和感官特性，這為工程化構(gòu)建3D 牛骨骼肌培養(yǎng)肉提供了新的思路[39]。采用花生拉絲蛋白作為支架材料體外培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞，可以在花生拉絲蛋白上黏附，獲取同時(shí)含有動(dòng)物蛋白和植物蛋白的培養(yǎng)肉制品，從而形成具有豐富蛋白質(zhì)組成的培養(yǎng)肉制品[40]。大蔥脫細(xì)胞支架材料具有適當(dāng)?shù)谋砻嫘蚊?，這一天然結(jié)構(gòu)引導(dǎo)C2C12 成肌細(xì)胞分化成排列的肌管的微結(jié)構(gòu)。這為細(xì)胞培養(yǎng)肉提供了一種簡(jiǎn)單且低成本的基質(zhì)[41]。基于天然衍生生物聚合物的支架材料，如纖維蛋白、膠原蛋白、透明質(zhì)酸等，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被廣泛研究和應(yīng)用，這些材料不僅具有高度生物相容性，還具有支持細(xì)胞黏附的特性[37，42]。然而，高昂的成本限制了這些聚合物在細(xì)胞培養(yǎng)肉中大規(guī)模應(yīng)用的可能性。另一方面，這些能夠更好模擬體內(nèi)環(huán)境的聚合物材料，在小體積或者較薄的生物質(zhì)培養(yǎng)中能夠?qū)崿F(xiàn)營(yíng)養(yǎng)灌注和細(xì)胞附著，然而，人工毛細(xì)血管往往是被忽略的重要環(huán)節(jié)，尤其是在大體積的細(xì)胞支架聚合物上[36，43-44]。人工毛細(xì)血管可使培養(yǎng)液中的各種營(yíng)養(yǎng)因子有效擴(kuò)散至聚合物內(nèi)部，滋養(yǎng)深層的細(xì)胞，同時(shí)也是代謝終產(chǎn)物去除的通道。缺乏毛細(xì)血管的聚合物將帶來(lái)細(xì)胞新陳代謝的局限性，并最終阻礙細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)的形成。因此，未來(lái)細(xì)胞培養(yǎng)肉大塊生物質(zhì)的支架材料設(shè)計(jì)中，細(xì)胞代謝通道的設(shè)計(jì)或者成管腔細(xì)胞共培養(yǎng)體系的加入是值得深入探究的方向。

2.4 組織工程技術(shù)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)肉質(zhì)構(gòu)的改善應(yīng)用

由于細(xì)胞培養(yǎng)肉的種子細(xì)胞來(lái)源于生產(chǎn)牲畜產(chǎn)品的相同動(dòng)物，因此理論上可以在體外環(huán)境下創(chuàng)造出完全復(fù)制所有肉類(lèi)特征的表型，包括在風(fēng)味、外觀(guān)、質(zhì)地和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值方面。實(shí)際上，細(xì)胞培養(yǎng)肉在這些方面正處在與傳統(tǒng)肉無(wú)限接近漫長(zhǎng)進(jìn)程中的起點(diǎn)位置。盡管有研究在嘗試使用脂肪組織補(bǔ)充肌肉組織，并增強(qiáng)蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，特別是肌紅蛋白和肌球蛋白及肌動(dòng)蛋白[5]，然而，距離與傳統(tǒng)肉具有類(lèi)似質(zhì)構(gòu)和口感的細(xì)胞培養(yǎng)肉的產(chǎn)生還有很長(zhǎng)的路要走。日本大阪大學(xué)構(gòu)建了肌腱凝膠，并與肌細(xì)胞纖維形成連續(xù)連接，肌腱作為促進(jìn)肌肉組織成熟的重要結(jié)構(gòu)，通過(guò)這種肌腱凝膠集成生物打印系統(tǒng)形成的生物質(zhì)，具備誘導(dǎo)成為排列的成熟肌肉纖維的潛力[45]。生物3D 打印技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)種子細(xì)胞在固化后的生物墨水中的有序空間排布，這種排布高度還原了原生組織的自然狀態(tài)，因此，生物3D 技術(shù)可以作為提升細(xì)胞培養(yǎng)肉質(zhì)構(gòu)和口感的有效途徑。另外，生物3D 打印技術(shù)在組織工程與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已被廣泛的研究，如何實(shí)現(xiàn)這些技術(shù)在細(xì)胞培養(yǎng)肉領(lǐng)域的轉(zhuǎn)化和大規(guī)模應(yīng)用以及相應(yīng)大型生物打印機(jī)的設(shè)計(jì)和建造，則是一項(xiàng)充滿(mǎn)挑戰(zhàn)的命題。

3 總結(jié)與展望

總之，細(xì)胞培養(yǎng)肉技術(shù)是一項(xiàng)具有巨大潛力的技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)肉作為一種替代動(dòng)物蛋白質(zhì)的新來(lái)源，它能夠緩解傳統(tǒng)肉類(lèi)生產(chǎn)中的相關(guān)動(dòng)物福利、環(huán)境和公共健康問(wèn)題，包括溫室氣體 排放，土地和水的使用，抗生素耐藥性，食物傳播人畜共患疾病等。然而，這項(xiàng)技術(shù)仍處于起步階段，面臨著技術(shù)完善和社會(huì)認(rèn)知的挑戰(zhàn)。在技術(shù)層面，細(xì)胞培養(yǎng)肉行業(yè)最需要解決的問(wèn)題是降低成本，消除與傳統(tǒng)肉類(lèi)的價(jià)格障礙，這需要多學(xué)科領(lǐng)域共同研究來(lái)解決。在社會(huì)層面，最重要和最艱巨的挑戰(zhàn)是實(shí)現(xiàn)消費(fèi)者對(duì)養(yǎng)殖肉類(lèi)的接受。這涵蓋了食物吸引力的不同方面，如外觀(guān)、味道、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、質(zhì)地、口感等。由于這種食物的新穎性，因此需要更多的研究來(lái)彌補(bǔ)這些方面的空白。

組織工程技術(shù)在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被廣泛研究和應(yīng)用，已有多種源于組織工程技術(shù)的醫(yī)療器械產(chǎn)品進(jìn)入成熟的批量生產(chǎn)階段并造福于人類(lèi)健康。由于細(xì)胞培養(yǎng)肉的食品屬性與醫(yī)療器械產(chǎn)品的醫(yī)用屬性之間的固有差異，利用組織工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)肉的規(guī)?；慨a(chǎn)還面臨著諸多挑戰(zhàn)，然而，隨著國(guó)家有關(guān)部門(mén)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)肉監(jiān)管政策法規(guī)的出臺(tái)以及未來(lái)的市場(chǎng)消費(fèi)需求，勢(shì)必會(huì)成為推動(dòng)組織工程技術(shù)在細(xì)胞培養(yǎng)肉領(lǐng)域廣泛研究并應(yīng)用的重要推動(dòng)力。