擬南芥種皮色素形成突變體的篩選與表型鑒定

李 娜 王瀟楠

（1. 鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，鄭州 450000；2. 開封市蔬菜科學(xué)研究所，開封 475003）

種子是被子植物的生殖器官［1］，種皮包被著由卵子形成的胚和胚乳。種皮的重要功能包括保護(hù)胚遠(yuǎn)離生物和非生物脅迫，在胚的發(fā)育過程中為胚提供營養(yǎng)，在種子萌發(fā)時(shí)提供水和氧氣，通過控制休眠來延遲種子的萌發(fā)等［2］。

種皮的顏色除作為形態(tài)指示性狀外，也常與植物品質(zhì)、脂肪酸含量等有關(guān)，目前利用模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）［3］開展種皮色素形成調(diào)控機(jī)理的研究已取得一定成果。擬南芥的種皮顏色主要由類黃酮的合成和積累決定，正常情況種子成熟和干燥階段種皮褐變是由黃酮類化合物，特別是原花青素的氧化引起的［4］。編碼和調(diào)控類黃酮生物合成中的某個(gè)酶或者蛋白質(zhì)基因突變，植物體內(nèi)類黃酮的積累量發(fā)生改變或者合成類黃酮的種類不同引起種皮顏色改變。研究表明類黃酮的生物合成主要受兩類基因的控制，一類是編碼生物合成途徑中所需的一些酶類的結(jié)構(gòu)基因，另一類是編碼一些轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控結(jié)構(gòu)基因時(shí)空表達(dá)的調(diào)控基因［5］。這兩類基因的突變，都會(huì)導(dǎo)致原花青素的合成和積累異常。在植物中，類黃酮除了提供鮮艷的花朵、水果、種子和葉片的色素外，在植物和微生物的信號(hào)傳遞［6］、一些物種的雄性可育［7］、調(diào)節(jié)活性氧水平［8］，抑制生長素運(yùn)輸［9］，防御作用［10］，信號(hào)共生有機(jī)體［11］和抵御UV 光傷害［12-13］過程中起關(guān)鍵性作用。越來越多的證據(jù)表明植物通過抗氧化劑黃酮類化合物積累，調(diào)節(jié)植物激素或活性氧（ROS）水平，間接提高植物非生物脅迫下抗性［14-15］。擬南芥透明種皮突變體在影響類黃酮合成的酶促步驟或轉(zhuǎn)錄調(diào)控中受損，在種皮顏色發(fā)生變化的同時(shí)也可能會(huì)影響其他生理表型的改變。擬南芥種皮顏色發(fā)生改變會(huì)導(dǎo)致種皮的厚度和質(zhì)量、種子的萌發(fā)率、植株對(duì)重力和生長素的應(yīng)答，以及對(duì)鹽和干旱的抗性發(fā)生相應(yīng)的變化［16-17］。因此研究類黃酮合成缺失突變體中影響植物其他結(jié)構(gòu)性狀的調(diào)控基因可為其他植物的檢測提供有用的分子靶點(diǎn)。本研究篩選1 個(gè)透明種皮突變體，詳細(xì)分析該突變體的表型，并鑒定導(dǎo)致tt4-1突變體突變的基因，為進(jìn)一步研究基因功能奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料和試劑

擬南芥野生型，包括columbia（Col-0）和Landsberg erecta（Ler）生態(tài)型；擬南芥Col-0 背景突變體tt4-1（突變體庫實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)制保存）。限制性內(nèi)切酶和Marker 購自TaKaRa 公司；KOD-Plus DNA 聚合酶購自TOYOBO 公司；普通TaqDNA 聚合酶由本實(shí)驗(yàn)室自制；設(shè)計(jì)引物使用Primer Premier 5.0 軟件，引物合成和測序由上海寶生生物技術(shù)有限公司完成。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101、pBI121 和pCAMBIA1391載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 植物培養(yǎng)和植株雜交

擬南芥播種與培養(yǎng)：干燥擬南芥種子加入0.1%升汞進(jìn)行表面消毒5～6 min，用滅過菌的雙蒸水沖洗5～7 次。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將表面消毒過的種子用尖頭滴管播種在含0.6%瓊脂的MS 固體培養(yǎng)基上，無菌封口后于冰箱中4 ℃春化3 d；再移至溫室（光/暗為16 h/8 h，光照溫度22 ℃，黑暗溫度18 ℃；光照強(qiáng)度150 μmol·m-2·s-1；相對(duì)濕度80%左右）培養(yǎng)。

擬南芥植株培養(yǎng)：選取生長狀態(tài)一致的擬南芥幼苗（生長至4片嫩葉時(shí)）從培養(yǎng)基中移栽至配置好的混合土（V（營養(yǎng)土）∶V（黑土）∶V（蛭石）=2∶1∶1）中，在培養(yǎng)室（光/暗16 h/8 h，光照溫度22 ℃，黑暗溫度18 ℃；光照強(qiáng)度120 μmol·m-2·s-1；相對(duì)濕度80%左右）培養(yǎng)。

擬南芥植株雜交：選新開放且花藥較多的花朵做父本，用雜交專用鑷子剝?nèi)ポ嗥盎ò瓴糠?；選未露白的花蕾做母本，保護(hù)好柱頭，剝?nèi)コ^外的所有部分。將處理好的父本的花藥涂抹在去雄的母本柱頭上，完成雜交并做標(biāo)記，然后去除母本其他花粉干擾，將授粉柱頭套袋處理，24 h 后取下袋子。

1.1.3 植物遺傳轉(zhuǎn)化

利用pTT4-pCAMBIA1391 載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101 感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性農(nóng)桿菌單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為1.2～1.6。擬南芥幼苗花序長至5～10 cm 高時(shí)，將花序浸沒在菌液中，每株浸花30 s，將浸花過的苗盆以塑料膜覆蓋保持濕度，避光放置16～24 h 后取出，正常培養(yǎng)5～7 d 后，重復(fù)浸染1次。

1.2 方法

1.2.1 透明種皮突變體的篩選

用化學(xué)誘變劑甲基磺酸乙酯（EMS）誘變Col-0野生型擬南芥種子，得到透明種皮突變體，種植自交繁殖，篩選得到突變體tt4-1（正常WT 的種子顏色為褐色）。將突變體與Col-0 野生型回交，F(xiàn)1代種下去收獲F2代，將F2代種子點(diǎn)于含0.6%瓊脂的MS 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2～3 d 根據(jù)下胚軸和子葉交界位置表現(xiàn)為黃色（野生型的則為褐色）的標(biāo)準(zhǔn)篩選突變體的純合體。

1.2.2 圖位克隆

1.2.2.1 突變體圖位克隆

以突變體tt4-1作為母本，擬南芥生態(tài)型Ler作為父本，兩者雜交獲得F1代種子，鑒定雜交成功的F1代植株，自交得到F2代，在F2代群體中選擇與突變體tt4-1表型一致的分離群體作為圖位克隆作圖群體。提取篩選植株的葉片DNA，利用已經(jīng)公布擬南芥5 條染色體的25 個(gè)SSLP 標(biāo)記為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，通過統(tǒng)計(jì)每對(duì)引物的重組率，判斷突變位點(diǎn)所在的染色體區(qū)間，進(jìn)行粗定位；確定突變位點(diǎn)所在染色體區(qū)間及其連鎖的側(cè)翼分子標(biāo)記后，擴(kuò)大作圖群體，設(shè)計(jì)新分子標(biāo)記進(jìn)行精細(xì)定位。按下面公式計(jì)算重組率：

重組率/%=（單交換個(gè)體總數(shù)量+2×雙交換個(gè)體總數(shù)量/2×樣品總數(shù)量）×100% （1）

1.2.2.2 DNA的提取及PCR檢測

采用文獻(xiàn)［18］方法提取擬南芥tt4-1突變體、突變體與Ler 野生型雜交鑒定的F2代植株葉片的基因組DNA。10 μL PCR 擴(kuò)增體系為5.0 μL 2×TaqMaster Mix（5 U·μL-1），引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，模板DNA1.0 μL，ddH2O 補(bǔ)至10 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，34 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳，EB 染色，BIORAD凝膠成像系統(tǒng)觀察照相。

1.2.3 構(gòu)建互補(bǔ)表達(dá)載體

構(gòu)建TT4pro-TT4pBI121 的表達(dá)載體，將載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法［19］浸染tt4-1突變體，收獲侵染后成熟的擬南芥種子，篩選純合的轉(zhuǎn)基因株系。

1.2.4 TT4基因在組織器官表達(dá)

將TT4的啟動(dòng)子片段與GUS 報(bào)告基因的編碼區(qū)融合，構(gòu)建pTT4-pCAMBIA1391 載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法［19］獲得野生型擬南芥轉(zhuǎn)化TT4-GUS 的轉(zhuǎn)基因植株，將篩選的陽性幼苗移栽到MS 基質(zhì)中培養(yǎng)。將采集植株的器官組織（根、莖、葉和花等）浸沒于GUS 染液中，避光條件下，37 ℃水浴染色4～5 h，然后依次用50%乙醇、75%乙醇、無水乙醇進(jìn)行脫色，直至葉綠素全部被脫去，觀察并照相。

1.2.5 突變體表型統(tǒng)計(jì)方法

1.2.5.1 種子大小比較

取同一時(shí)間收獲的顆粒飽滿的突變體tt4-1和WT 種子，分別取100 粒，用電子天平稱量種子的質(zhì)量，統(tǒng)計(jì)每粒種子的長度和寬度。每種材料分別取3份進(jìn)行測量。

1.2.5.2 生長周期表型觀察

種皮顏色和葉片顏色通過體視鏡觀察；抽薹時(shí)間從春化結(jié)束到第1朵花朵脫落果莢可見為止；果莢的長度通過Image J 軟件統(tǒng)計(jì)獲得，在擬南芥果莢成熟時(shí)期，取10 個(gè)左右位于主軸中部分段的果莢，放置在帶有標(biāo)尺的空白紙上拍照記錄，最后用Image J軟件逐個(gè)測量果莢長度。

1.2.5.3 萌發(fā)率的比較

將同批次收獲籽粒飽滿的突變體種子tt4-1和WT 種子用升汞洗過之后，4 ℃春化3 d，點(diǎn)到含0.6%瓊脂的MS 培養(yǎng)基中，放到光照材料室培養(yǎng)。從第2 天開始連續(xù)6 d 對(duì)萌發(fā)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，直至全部萌發(fā)為止（每次3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行3次試驗(yàn)）。

1.2.5.4 根發(fā)育表型分析

將突變體tt4-1和WT 的種子點(diǎn)種到0.8% MS培養(yǎng)基上，平板放在培養(yǎng)室豎直培養(yǎng)，使其根部能夠貼著培養(yǎng)基豎直生長。待根長至1 cm 左右時(shí)，挑選大小一致的苗整齊地分別擺放到含0.8%、1.0%、1.2%的瓊脂培養(yǎng)基中豎直培養(yǎng)，1 周后用體式顯微鏡觀察結(jié)果，記錄側(cè)根數(shù)量。

1.2.5.5 葉片表面溫度的遠(yuǎn)紅外成像和失水率測定方法

取在土中生長良好的、大小比較一致的3～4周的擬南芥幼苗（取苗的時(shí)間一般為中午12：00左右），迅速從土中連根取出幼苗，將WT和突變體整齊地?cái)[放到同一張干凈的紙上，用普通相機(jī)照相；然后放到遠(yuǎn)紅外儀器中，觀察拍照。將上述生長期幼苗從土中取出，剪掉根，放在干凈的稱量紙上，放到電子天平上稱量，計(jì)數(shù)。前30 min 每5 min 稱量一次，之后每隔30 min 稱量1 次。直到每次的稱量結(jié)果變化不明顯時(shí)停止稱量，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.5.6 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 24.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、處理；采用t檢驗(yàn)等差分析方法進(jìn)行試驗(yàn)組與對(duì)照組的顯著性差異分析（*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001）。

2 結(jié)果與分析

2.1 透明種皮突變體獲得

按1.2.1 方法篩選突變體純合體，觀察發(fā)現(xiàn)未成熟的突變體種子為綠色，WT 的為黃色；成熟的突變體的種子顏色為黃色，種皮薄而透明，WT 的為褐色（見圖1）。經(jīng)過多次繁殖和表型驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，黃種種皮表型能夠穩(wěn)定遺傳。

圖1 WT與突變體tt4-1成熟種子顏色Fig.1 Comparison of mature seed color between WT and mutant tt4-1

2.2 圖位克隆

2.2.1 突變體遺傳分析

通過突變體與Col-0 野生型回交的方法，得到回交F1代進(jìn)行表型驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)回交F1代的表型和Col-0 野生型一樣，說明tt4-1突變是隱性突變。突變體和WT 雜交，對(duì)子代表型分離比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，褐色種皮與透明種皮數(shù)量比例接近于3∶1，表明該突變基因?yàn)閱位螂[性突變。

2.2.2 突變體粗細(xì)定位結(jié)果

按1.2.1 方法篩選1 800 植株作為基因定位的群體，按照1.2.2.1 和1.2.2.2 方法進(jìn)行圖位克隆。表1～2分別是突變基因粗、細(xì)定位的結(jié)果。

表1 突變基因的粗定位結(jié)果Table 1 The primary mapping results of the mutant gene

2.2.3 突變基因測序結(jié)果

在MAH20的BAC上挑選了一些基因并進(jìn)行測序。結(jié)果如圖2A 所示，突變體tt4-1在At5G13930基因的DNA 序列的第1 299 位發(fā)生了堿基C 突變?yōu)閴A基T，導(dǎo)致TT4基因在第324位氨基酸由甘氨酸突變?yōu)楣劝彼幔ㄒ妶D2B）。構(gòu)建TT4pro-TT4pBI121的表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法浸染tt4-1，收獲浸染后成熟的擬南芥種子，篩選純合的轉(zhuǎn)基因株系，互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證恢復(fù)褐色種皮的表型（圖2C）。以上試驗(yàn)證明tt4-1突變體透明種皮的表型是由TT4基因突變所致。

表2 突變基因細(xì)定位結(jié)果Table 2 The fine positional mapping statistical results of the mutant gene

圖2 突變基因測序結(jié)果及突變基因的鑒定A.測序序列比對(duì)結(jié)果（紅色圓圈標(biāo)注的即為發(fā)生突變的堿基）；B.AT5G13930 編碼的正常氨基酸序列和發(fā)生突變的氨基酸（紅色圓圈標(biāo)注為正常的氨基酸，黑色箭頭所指為發(fā)生改變的氨基酸，即甘氨酸（Gly，G）突變?yōu)楣劝彼幔℅lu，E）；C.WT，tt4-1突變體和pTT4：：TT4-GFP tt4-1基因回補(bǔ)種子顏色比較，突變基因確為TT4Fig.2 Sequencing results of mutant gene and identification of mutated gene A.The sequencing and results of blas（tWith the red circle that mutations for bases）；B.The sequence of normal amino acid and the mutations of amino acids of AT5G13930（With the red circle for normal amino acids，black arrow for the change of the amino acids），and Glycine（Gly，G）mutates to glutamate（Glu，E）；C.The Seed Coat Pigmentation of WT，tt4-1 and pTT4：：TT4-GFP tt4-1，and the mutated gene was indeed TT4

2.3 TT4基因的組織器官表達(dá)模式分析

為分析TT4在擬南芥不同時(shí)期、不同器官中的表達(dá)情況。將TT4的啟動(dòng)子片段與GUS 報(bào)告基因的編碼區(qū)融合，構(gòu)建pTT4-pCAMBIA1391 載體（見圖3），獲得野生型擬南芥轉(zhuǎn)化TT4-GUS 的轉(zhuǎn)基因植株，將篩選的陽性幼苗移栽到MS 基質(zhì)中培養(yǎng)。GUS 染色結(jié)果如圖4 所示。從圖中可以看出，TT4基因在擬南芥幼苗根、莖、葉和花中均有表達(dá)。

圖3 TT4組織表達(dá)載體構(gòu)建A.TT4啟動(dòng)子序列圖譜；B.pCAMBIA1391載體圖譜；C～D.TT4啟動(dòng)子序列的pCAMBIA1391載體的構(gòu)建及雙酶切驗(yàn)證Fig.3 Construction of tissue expression vector of TT4 A.TT4 promoter sequence map；B.pCAMBIA1391 vector map；C-D.Construction of pCAMBIA1391 vector with TT4 promoter sequence and verification of double digestion

圖4 TT4基因的組織表達(dá)定位情況A.擬南芥生長7 d 時(shí)轉(zhuǎn)基因幼苗中TT4 基因的組織表達(dá)；B～F.子葉及莖（B）、根毛區(qū)（C）、根成熟區(qū)（D）、根尖及分生區(qū)（E）和花（F、G）中TT4基因的組織表達(dá)情況Fig.4 Expression pattern and Tissue and organ localization of TT4 gene A.Tissue expression of TT4 gene in transgenic seedlings of Arabidopsis thaliana grown for 7 d；B-F.Tissue expression of TT4 gene in cotyledon and stem（B），root hair zon（eC），root mature zon（eD），root tip and meristem（E）and flowe（rF，G）

2.4 突變體表型分析

2.4.1 種子大小比較

結(jié)果顯示突變體的種子百粒質(zhì)量和野生型相比顯著降低（*P＜0.05），長度短且寬（見表3）。突變體的種子形狀更接近于圓形，而WT的則為橢圓形（見圖5）。

表3 WT與突變體tt4-1的種子大小及質(zhì)量比較Table 3 Comparison of seed traits between WT and mutant tt4-1

圖5 WT與突變體tt4-1的種子形狀比較Fig.5 Comparison of seed shape between WT and mutant tt4-1

2.4.2 生長周期表型觀察

在種植培養(yǎng)的過程中突變體tt4-1與WT 在整個(gè)生長周期中表現(xiàn)出許多不同的表型（見圖6）。觀察發(fā)現(xiàn)，tt4-1的葉片在生長過程中與WT相比稍微發(fā)黃，尤其是在前期，表現(xiàn)的比較明顯；tt4-1抽薹的時(shí)間比WT 要提前1 周左右，種子成熟時(shí)間也隨之提前；植株成熟之后，相對(duì)于WT 來說tt4-1的植株矮小，但分支比較多；成熟的突變體果莢短小，粗短，顏色稍微發(fā)黃。

圖6 正常生長狀態(tài)下WT與突變體tt4-1的表型比較A.土壤中生長3周的植株葉片；B.土壤中生長5周的擬南芥苗；C.成熟植株；D.未成熟果莢Fig.6 The phenotype analysis between WT and mutant tt4-1 under normal growth condition A.Three weeks of plant growth in the Soil；B.Five weeks of plant growth in the Soil；C.Mature plants；D.Immature fruit pod

2.4.3 萌發(fā)率的比較

對(duì)突變體tt4-1、WT 種子進(jìn)行萌發(fā)率試驗(yàn)分析。結(jié)果表明突變體tt4-1比WT 萌發(fā)早，萌發(fā)率高且差異顯著（見圖7）。說明種皮顏色的改變可能影響種子的休眠和萌發(fā)期間對(duì)水分吸收。

圖7 正常生長狀態(tài)下WT與突變體tt4-1的萌發(fā)率Fig.7 The germination rate between WT and mutant tt4-1 under normal growth condition

2.4.4 根發(fā)育表型分析

觀察生長期間tt4-1突變體根發(fā)育情況發(fā)現(xiàn)，與WT 相比，tt4-1突變體表現(xiàn)主根較短，側(cè)根較多（見圖8A）。增加瓊脂濃度能部分抑制tt4-1突變體的側(cè)根生長發(fā)育，側(cè)根數(shù)目隨培養(yǎng)基硬度增加而減少（見圖8B）。

圖8 MS培養(yǎng)基中WT與突變體tt4-1的側(cè)根比較A.含0.8%瓊脂的MS培養(yǎng)基中的根生長情況；B.瓊脂濃度分別為0.6%、0.8%、1.0%、1.2%培養(yǎng)基培養(yǎng)的側(cè)根數(shù)目統(tǒng)計(jì)分析Fig.8 Comparison of lateral roots between WT and mutant tt4-1 in MS medium A.The root growth in 0.8% MS culture；B.The number analysis of lateral root cultured in medium when agar concentrations were 0.6%，0.8%，1.0%and 1.2%respectively

2.4.5 突變體tt4-1 與WT 葉面溫度和失水率的測定

通過遠(yuǎn)紅外技術(shù)可以觀察到突變體tt4-1的溫度比WT的溫度要低2～3 ℃，說明突變體比WT的氣孔開度大（見圖9A）。蒸騰作用會(huì)散失水分，使葉片表面的溫度降低，氣孔開度越大，水分散失越多，溫度就越低。因此接著測定突變體和WT的葉片失水率，圖9B結(jié)果顯示突變體與野生型相比葉片失水率顯著高，這和突變體葉面低溫表型的結(jié)果一致。

圖9 WT與突變體tt4-1的葉面溫度和失水率的比較A.WT和tt4-1在土壤中生長2周葉片表面溫度差；B.WT和tt4-1正常生長2周的葉片失水率統(tǒng)計(jì)分析Fig.9 Comparison of leaf temperature and Water loss rate between WT and mutant tt4-1 A.The difference of WT and tt4-1 on surface temperature of two weeks seedlings；B.Water loss rate analysis of WT and tt4-1 under normal growth condition

3 討論

通過正向遺傳學(xué)篩選突變體方法［20］獲得種皮透明突變體tt4-1，利用圖位克隆技術(shù)，將突變鎖定在5號(hào)染色體的分子標(biāo)記MAH20和它附近的一些BAC 上，通過對(duì)該區(qū)間內(nèi)的基因進(jìn)行篩選和測序，初步推測At5g13930基因突變?；パa(bǔ)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)植物種皮恢復(fù)褐色，驗(yàn)證突變基因確為TT4基因。TT4基因（At5g13930）編碼查爾酮合酶，催化4-香豆酰-Co（1 分子）和丙二酰-CoA（3 分子）縮合形成查爾酮（又稱苯基苯乙烯酮，Chalcone），是類黃酮合成途徑的第1步反應(yīng)，也是類黃酮合成途徑的重要限速酶［21］，因此TT4基因突變后類黃酮合成缺失引起擬南芥種皮色澤變黃。

類黃酮作為次級(jí)代謝產(chǎn)物參與植物抗氧化、生長發(fā)育以及響應(yīng)生物和非生物脅迫等多種生理過程，編碼查爾酮合酶的TT4基因突變導(dǎo)致類黃酮合成障礙，突變體tt4-1較野生型生理表型有所不同。與WT相比，tt4-1的種子萌發(fā)快且高。有研究［22］認(rèn)為野生型抑制種子萌發(fā)可能并不是由于色素過量積累，而是因?yàn)樵ㄇ嗨囟嗑畚锉换ㄇ嗨卮妫瑥亩黾恿酥仓陮?duì)四唑鹽的滲透作用。tt4-1突變體因?yàn)轭慄S酮合成缺失，推測突變體種子的萌發(fā)行為可能與種子對(duì)四唑鹽有較強(qiáng)的滲透能力有關(guān)［23］。對(duì)種子萌發(fā)過程中的內(nèi)源抑制劑（脫落酸）或外源刺激物（水或氧氣）的強(qiáng)滲透性或許可以解釋為什么tt4-1突變體的休眠期較短。突變體萌發(fā)率高的具體機(jī)制有待于下一步深入研究。tt4-1突變體的側(cè)根和根毛較WT 多，這與Chapman等［24］用活性氧ROS 響應(yīng)探針檢查到類黃酮缺失突變體因ROS積累，增加側(cè)根原基中山奈酚的水平，刺激側(cè)根出苗的結(jié)果一致。Buer 等［16］研究發(fā)現(xiàn)類黃酮缺失突變體根部合成的黃酮產(chǎn)物減少，而生長素的極性運(yùn)輸卻有所增加。因此推測TT4基因的突變改變類黃酮的生物合成和生長素的運(yùn)輸，tt4-1突變體根尖有向地性延遲，同時(shí)影響擬南芥根對(duì)重力和光的響應(yīng)，出現(xiàn)主根少，側(cè)根和根毛較野生型增多的現(xiàn)象。Nakabayashi等［14］研究認(rèn)為擬南芥中自由基清除劑類黃酮可以減輕擬南芥的抗氧化和抵抗干旱脅迫。類黃酮合成障礙tt4-1突變體葉片氣孔開度大，失水率高，抗脅迫能力差，推測其為了適應(yīng)外界復(fù)雜環(huán)境，抽薹開花結(jié)果早，盡早繁衍后代有關(guān)［25］，這與我們觀察到tt4-1突變體抽薹早，果莢小的表型一致。本研究首次克隆出TT4基因，鑒于其屬于擬南芥類黃酮前期生物合成基因，試驗(yàn)檢測TT4基因在植株幼苗、根、莖、葉和花器官中均有組織表達(dá)。下一步將構(gòu)建TT4超表達(dá)載體深入研究此基因的功能和類黃酮缺失tt4-1突變體在各種脅迫條件下的調(diào)控機(jī)制。

作為類黃酮缺失突變體之一的tt4-1突變體的研究，不僅有助于揭示類黃酮在植物中重要作用，而且對(duì)TT4基因的功能研究具有重要的意義。本試驗(yàn)獲得的tt4-1突變體為進(jìn)一步研究TT4基因與種皮顏色調(diào)控的關(guān)系提供了新的遺傳材料，也為深入研究此基因參與調(diào)控植物脅迫和種皮發(fā)育的可能機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。