殼寡聚糖對(duì)變異鏈球菌的抑制作用研究

胡馨月，張?jiān)芥?，袁京陽，齊卓群

1.蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院（蘭州 730030）；2.蘭州大學(xué)藥學(xué)院（蘭州 730030）

齲病作為危害范圍較廣、發(fā)病率較高的一種口腔疾病，已被世界衛(wèi)生組織列為人類重點(diǎn)防治的三大非傳染性疾病之一，是全球公共衛(wèi)生層面上的挑戰(zhàn)[1]，對(duì)齲病的預(yù)防一直是口腔醫(yī)學(xué)工作者關(guān)注和研究的重點(diǎn)。目前臨床常采取氟制品對(duì)齲病進(jìn)行預(yù)防。氟防齲的有效性已被證實(shí)，但關(guān)于其安全性的研究始終存在爭議。研究[2]發(fā)現(xiàn)，口腔環(huán)境中已出現(xiàn)耐氟菌株，因此氟應(yīng)用于防齲的有效性受到了挑戰(zhàn)。除此之外，氟濃度的選擇、氟制劑的穩(wěn)定性、氟的不良反應(yīng)[3]等問題還有待進(jìn)一步研究。齲病是感染性疾病，主要致病菌包括鏈球菌屬、乳桿菌屬和放線菌屬。研究[4]表明，變異鏈球菌與齲病有較大關(guān)聯(lián)，參與了早期牙菌斑的形成，是最重要的致齲細(xì)菌之一。青霉素、紅霉素、四環(huán)素等抗生素類藥物具有一定的抑菌防齲效果，但長期使用或?yàn)E用易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性并引起口腔及腸道菌群失調(diào)、微生態(tài)環(huán)境紊亂而導(dǎo)致其他疾病[5]。因此尋求安全有效的防齲物質(zhì)成為目前齲病防治研究的重點(diǎn)。殼寡聚糖（chitooligosaccharide，COS）是一種甲殼素衍生物，其來源豐富、提取方便，無刺激性和抗原抗體反應(yīng)，且不與體液反應(yīng)，具有生物可降解性和細(xì)胞親和性等優(yōu)良性能[6]。低分子量殼聚糖尤其是COS水溶性好、功能作用多樣、生物活性高，適用于醫(yī)藥保健領(lǐng)域。本研究旨在分析不同濃度COS在不同酸堿條件下對(duì)變異鏈球菌生長的影響，探討COS防齲的可能性。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

主要試劑：牛腦心浸出液（brain-heart infusion，BHI）培養(yǎng)基、COS、瓊脂（MW=500）（索萊寶科技有限公司，北京）；冰乙酸（富宇精細(xì)化工有限公司，天津）；氫氧化鈉（滬試公司，上海）。主要儀器：厭氧培養(yǎng)箱（Gene Science公司，美國）；氣浴恒溫?fù)u床（力辰公司，上海）；pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器公司，上海）；多功能酶標(biāo)儀（Tecan公司，瑞士）。菌株：變異鏈球菌 UA159（中國科學(xué)院，北京）。

1.2 方法

1.2.1 變異鏈球菌復(fù)蘇及傳代培養(yǎng) 將冷凍的變異鏈球菌從-20 ℃冰箱中拿出，解凍5 min。準(zhǔn)備10 mL滅菌EP管、滅菌BHI培養(yǎng)基。所有操作于生物安全柜中進(jìn)行。用接種環(huán)沾取一環(huán)變異鏈球菌菌液放于裝有4 mL BHI培養(yǎng)基的EP管中輕搖，即接種成功。將EP管放入轉(zhuǎn)速為100 r/min的氣浴恒溫?fù)u床中過夜培養(yǎng)，為第1次增菌。第2次增菌從過夜培養(yǎng)的10 mL EP管中沾取菌液進(jìn)行傳代，基本操作如前，在氣浴恒溫?fù)u床中振蕩12 h后得到完全恢復(fù)活性的變異鏈球菌。

1.2.2 調(diào)節(jié)BHI培養(yǎng)基pH 初配得到BHI培養(yǎng)基經(jīng)精密pH計(jì)測得pH接近7.00，將BHI培養(yǎng)基分裝至4個(gè)50 mL EP管中，兩管用1 mol/L NaOH調(diào)至pH 7.50，剩余兩管用1%乙酸溶液調(diào)至pH 6.50。相同pH的液體培養(yǎng)基，一瓶用于溶解COS，一瓶用于96孔板中的對(duì)半稀釋，目的是使稀釋過程中BHI培養(yǎng)基的pH不被改變。

1.2.3 配制對(duì)半稀釋前含有COS的BHI培養(yǎng)基用天平稱取3.2 g COS分別溶于兩管pH為6.50、7.50裝有50 mL BHI的EP管中，超聲振蕩至完全溶解，得到一管pH為6.50、COS濃度為64 g/L的BHI培養(yǎng)基和一管pH為7.50、COS濃度為64 g/L的BHI培養(yǎng)基。

1.2.4 微孔濾膜過濾除菌 在生物安全柜中用0.22 μm孔徑濾菌膜濾過4管BHI培養(yǎng)基，避免調(diào)節(jié)pH后有雜菌污染培養(yǎng)基。

1.2.5 菌液稀釋 用酶標(biāo)儀測得第三代變異鏈球菌經(jīng)24 h培養(yǎng)的OD值，經(jīng)公式換算得出菌液濃度約為1×1012個(gè)/mL，經(jīng)對(duì)半稀釋后菌液濃度為1×106個(gè)/mL。

1.2.6 用96孔板進(jìn)行對(duì)半稀釋和細(xì)菌培養(yǎng) 以下操作在生物安全柜中進(jìn)行。將96孔板標(biāo)注好對(duì)應(yīng)濃度，COS組每個(gè)濃度做3個(gè)平行樣品，不同pH不同濃度的COS亞組另設(shè)不含COS的對(duì)照組。取pH 6.50的BHI培養(yǎng)基（不含COS）100 μL注入各組。另外吸取100 μL pH 6.50（64 g/L COS）的BHI培養(yǎng)基，注入第 1孔反復(fù)吸打混勻，再從第1孔中抽取100 μL注入第2孔，依次類推得到從左到右COS遞減的BHI培養(yǎng)基（此步驟不含對(duì)照組）。從右往左（低濃度至高濃度）用排槍向每孔再注入100 μL BHI培養(yǎng)基（不含COS），最終得到每孔為200 μL相應(yīng)pH、COS濃度的培養(yǎng)條件。取稀釋后濃度為1×106個(gè)/mL的變異鏈球菌菌液，向每孔中注入20 μL，然后將96孔板放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)（37℃，10%H2，10%CO2，80%N2）48 h。pH 7.50組別操作方法同上。

1.2.7 活菌的稀釋涂布平板法計(jì)數(shù) 將厭氧培養(yǎng)48 h的96孔板取出觀察，若空白對(duì)照組BHI培養(yǎng)基呈澄清棕色，則說明培養(yǎng)過程中無雜菌污染，可進(jìn)行下一步操作。將96孔板每孔（除空白對(duì)照組）中的培養(yǎng)液按102、104、106倍數(shù)稀釋，取稀釋后的菌液0.1 mL涂布在BHI固體平板上，每個(gè)濃度做3個(gè)平行樣品。將平板放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)（37 ℃，10%H2，10%CO2，80%N2）48 h，觀察菌落生長形態(tài)，最后取菌落數(shù)30～300固體平板進(jìn)行菌落形成計(jì)數(shù)?？咕钚愿叩陀眉?xì)菌生長抑制百分率（抑菌率）和菌落形成單位（colony forming units，CFU）評(píng)價(jià)。抑菌率=（A-B）/A×100%。A：對(duì)照組培養(yǎng)后平均菌落數(shù)，B：COS培養(yǎng)后平均菌落數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的定量資料以（）表示，對(duì)照組與COS組比較行t檢驗(yàn)，多濃度比較行方差分析，不同pH組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α除特別說明外均設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同pH條件COS對(duì)變異鏈球菌UA159生長的影響

pH 7.50條件下COS組各亞組的ln（CFU）值均較不含COS對(duì)照組低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；抑菌率隨COS濃度的增加而提高（表1）。pH 6.50條件下COS各亞組的ln（CFU）值均較不含COS對(duì)照組低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；抑菌率隨COS濃度的增加而提高（表 2）。

表1 pH7.50COS對(duì)變異鏈球菌UA159生長的影響（）

表1 pH7.50COS對(duì)變異鏈球菌UA159生長的影響（）

注：*P表示與對(duì)照組比較。

組別 n COS濃度/（g/L） ln（CFU） 抑菌率/% t P對(duì)照組 3 0 5.837±0.005 COS 1 g/L組 3 1 5.657±0.003 16.44±0.43 -53.800 ＜0.001*COS 2 g/L組 3 2 5.588±0.014 22.32±0.79 -24.600 ＜0.001*COS 4 g/L組 3 4 5.573±0.018 23.15±1.20 -17.849 ＜0.001*COS 8 g/L組 3 8 5.497±0.009 28.80±0.53 -38.477 ＜0.001*COS 16 g/L組 3 16 5.361±0.018 37.84±0.78 -41.223 ＜0.001*

表2 pH6.50COS對(duì)變異鏈球菌UA159生長的影響（）

表2 pH6.50COS對(duì)變異鏈球菌UA159生長的影響（）

注：*P表示與對(duì)照組比較。

組別 n COS濃度/（g/L） ln（CFU） 抑菌率/% t P對(duì)照組 3 0 5.836±0.028 COS 1 g/L組 3 1 5.243±0.025 44.75±2.74 -31.934 ＜0.001*COS 2 g/L組 3 2 5.043±0.028 54.77±0.47 -42.710 ＜0.001*COS 4 g/L組 3 4 4.862±0.038 62.26±0.74 -36.889 ＜0.001*COS 8 g/L組 3 8 4.272±0.093 78.99±1.69 -23.096 ＜0.001*COS 16 g/L組 3 16 3.898±0.035 85.60±0.88 -80.681 ＜0.001*

2.2 相同pH不同濃度COS對(duì)變異鏈球菌UA159生長的影響

經(jīng)48 h厭氧培養(yǎng)（37℃，10%H2，10%CO2，80%N2）后，在相同pH條件下，隨著COS濃度增長，COS組的ln（CFU）值逐漸降低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表 3）。

表3 相同pH不同濃度COS對(duì)變異鏈球菌UA159生長的影響

2.3 不同濃度和pH條件下COS對(duì)變異鏈球菌UA159生長的影響

經(jīng)48 h厭氧培養(yǎng)（37℃，10%H2，10%CO2，80%N2）后，在不同濃度和pH 6.5條件下COS各亞組較pH 7.5條件下COS各亞組的ln（CFU）值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表 4）。

表4 不同濃度和pH條件下COS各亞組CFU對(duì)數(shù)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)

3 討論

20世紀(jì)初氟化物在牙齒保護(hù)方面受到重視，并逐漸演變成牙膏、漱口水、氟保護(hù)漆等防齲保健用品的重要成分，其防齲的有效性不容置疑，但過高的氟水平會(huì)導(dǎo)致氟中毒[7]。氯己定（洗必泰）含漱液是一種抗菌譜廣的表面活性殺菌劑，臨床可用于齲病及牙周疾病的防治，但長期使用氯己定防治會(huì)出現(xiàn)牙齒、口腔黏膜著色和味覺異常。有研究[8]表明，氯己定的降解可能產(chǎn)生自由基和對(duì)氯苯胺，從而造成組織傷害。因此，尋找一種安全又有效的防齲藥物具有重要意義?；贑OS具有良好的抑菌性能和較強(qiáng)的生物相容性[9]，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了COS對(duì)齲病主要致病菌生長抑制作用的研究。

本研究結(jié)果顯示，在相同pH條件下，COS組菌落計(jì)數(shù)均小于不含COS的對(duì)照組，且二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明小分子量COS（MW=500）對(duì)變異鏈球菌的生長有明確抑制作用。抑菌率計(jì)算結(jié)果表明，抑菌率隨COS濃度的增加而提高，說明其對(duì)變異鏈球菌生長的抑制作用在一定范圍內(nèi)具有濃度依賴性。對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行橫向?qū)Ρ确治?，即相同濃度COS不同pH的COS亞組，pH較低組菌落計(jì)數(shù)較pH較高組少，說明COS對(duì)變異鏈球菌的抑制作用在酸性環(huán)境下更顯著。COS生物相容性良好且不良反應(yīng)較少[10]，結(jié)合以上研究，COS或許可為齲病預(yù)防提供一種新思路。

鞠鐸等[11]研究發(fā)現(xiàn)，抑菌濃度的COS對(duì)變異鏈球菌的粘附能力具有明顯的抑制作用。結(jié)合牙菌斑生物膜的形成原因[12]，筆者猜測COS對(duì)變異鏈球菌的生長產(chǎn)生明顯抑制作用的原因與其粘附能力的降低相關(guān)。變異鏈球菌的粘附能力降低，使其不易在獲得性唾液薄膜上定植，從而難以形成抵御外界環(huán)境干擾的牙菌斑生物膜，最終達(dá)到預(yù)防齲病的目的。由于口腔菌群產(chǎn)酸能導(dǎo)致牙釉質(zhì)脫礦，促使齲病進(jìn)展，本研究就酸堿條件對(duì)COS抑制變異鏈球菌生長的作用展開了進(jìn)一步研究。

Chapelle等[13]研究發(fā)現(xiàn)，COS具有聚陽離子型電解質(zhì)的特性，是一種帶正電荷的小分子物質(zhì)。筆者推測，COS在酸性環(huán)境下抑菌效果更好，可能由于其本身的電荷特性增加了溶解度。COS防齲應(yīng)用于口腔環(huán)境長期處于酸性的基礎(chǔ)疾病患者具有一定前景。針對(duì)一些具有基礎(chǔ)疾病的口腔pH值變化較大患者，COS口腔環(huán)境呈酸性，pH平均值約為6.65[14]。臨床上可以根據(jù)這類患者的具體情況來合理用藥，以預(yù)防齲病。有研究[15]顯示，化療后有超過50%患者口腔pH值會(huì)下降，口腔頜面創(chuàng)傷患者口腔環(huán)境處于酸性狀態(tài)（pH=4.0～5.7）[16]，而pH值下降后微生物的感染率、口腔并發(fā)癥發(fā)生率較高[17]。本研究對(duì)臨床上存在并發(fā)癥患者使用COS制品進(jìn)行口腔保健具有一定參考意義。本研究亦存在不足之處，例如在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上有待更加完善，未能將COS的抑菌效果同臨床常用抑菌藥物氯己定[18]作對(duì)比。另外，由于COS屬于甲殼素類天然多糖類高分子化合物的降解物，其降解物包括分子量更高的殼聚糖等物質(zhì)，在同類實(shí)驗(yàn)材料的選擇上可以擴(kuò)大范圍。Chaudhry等[19]報(bào)道，殼聚糖和COS對(duì)MCF-7、HepG2、HeLa-6和 3T3細(xì)胞具有一定毒性。值得注意的是，臨床上幾乎未見以COS為主要成分的齲病預(yù)防產(chǎn)品，其產(chǎn)品主要分布于抗炎抗菌、抗氧化、抗高血壓及用作藥物的載體等醫(yī)藥領(lǐng)域[20]，COS具體防齲途徑還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，COS等甲殼素類衍生品來源廣泛、價(jià)格低廉，在一定條件下，其抑菌作用較好且不良反應(yīng)較少，在齲病預(yù)防保健品的制備方面具有一定的潛力。