基于多指標響應面法優(yōu)化土炒當歸炮制工藝*

楊柳，李永強，張芮萌，張馨月，鞠春梅，李艷杰

(1.長春中醫(yī)藥大學藥學院，長春 130117；2.延吉市醫(yī)院消化內(nèi)科，延吉 133000)

當歸性溫，味甘、辛，系傘形科多年生草本植物，以干燥根入藥[1]，具有補血、活血、止痛、潤腸的功效[2-3]。以甘肅省岷縣為主產(chǎn)地。陜西、四川、湖北、云南等省均有栽培，秋季采挖?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將其列為中品[4]。當歸的炮制古代就十分被重視，文獻記載較多?！秳缸庸磉z方》有炒當歸的記載，其后歷代文獻提及炮制方法有25種之多[5]。其中，生當歸、酒浸炒當歸、土拌炒當歸、油拌炒當歸與當歸炭等炮制品在臨床上應用廣泛[6-8]。炮制的目的在于改變藥性，擴大藥用范圍[9]。傳統(tǒng)的炮制理論認為“土炒入脾”，當歸土炒能增強入脾補血作用。臨床常用復方制劑如補脾益腸丸、草仙乙肝膠囊等是以土炒當歸用藥，然而《中華人民共和國藥典》(簡稱《中國藥典》)(2020年版)以及《吉林省地方炮制規(guī)范》(1986年版)并未收錄土炒當歸的炮制工藝及質(zhì)量標準[10]；雖然《全國中藥炮制規(guī)范》(1988年版)規(guī)定土炒當歸制法為“取當歸片，用伏龍肝細粉炒至表面掛土色，篩去多余土粉，取出放涼”[11]，《湖北省中藥飲片炮制規(guī)范》(2018年版)規(guī)定土炒當歸制法為“取凈當歸片，照土炒法炒至表面掛土色”[12]，但均過于籠統(tǒng)，并未見具體的炮制工藝技術參數(shù)。因此對于吉林省中藥生產(chǎn)企業(yè)而言，土炒當歸尚無明確標準可依。

通過文獻研究及飲片生產(chǎn)企業(yè)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，在土炒工藝中灶心土用量會影響其炒制品質(zhì)量，灶心土與當歸應混勻且覆蓋充分，使炒制均勻；炒制溫度過高、炒制時間過長飲片容易焦化而藥效降低，相反飲片炒制火候不足，影響整體效果。綜上，灶心土用量、炒制溫度和炒制時間等因素相互影響。因此筆者在單因素實驗的基礎上，利用Box-Behnken響應面法，將評價飲片質(zhì)量的外觀性狀與阿魏酸及揮發(fā)油等化學成分含量的客觀指標相結合，多指標、綜合評價各實驗因素的主效應，優(yōu)選出土炒當歸炮制工藝參數(shù)。通過對當歸土炒工藝開展深入研究，實現(xiàn)炮制工藝的規(guī)范化，以期為土炒當歸在藥食領域的開發(fā)與工業(yè)化大生產(chǎn)提供理論依據(jù)與實踐參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-2030型高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)，JT2001型分析天平(上海佑科儀表有限公司，感量：0.01 mg)，SK1200B型超聲波清洗儀(上海科導超聲儀器公司)，MS-5型多功能電熱炒貨機(常州市金壇邁斯機械有限公司)，AR-688型紅外線測溫儀(蘇州市?，攦x表有限公司)，SHB-Ⅲ型臺式循環(huán)水式真空泵(上海力辰儀器科技有限公司)等。

1.2藥品與試劑 當歸飲片購自長春宏檢大藥房，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學藥學院王哲副教授鑒定為傘形科植物當歸Angelicasinensis(Oliv.) Diels的根，并依據(jù)《中國藥典》(2020年版)一部當歸飲片項下檢測，符合相關規(guī)定；灶心土(批號：200401)購自安國市安興中藥飲片公司；阿魏酸對照品(批號：111730-201915，含量：99.4%)和當歸對照藥材(批號：121054-201308)均購自中國食品藥品檢定研究院；磷酸、乙腈、甲醇均為國產(chǎn)色譜純，購自山東禹王和天下新材料有限公司。

2 方法與結果

2.1土炒當歸樣品制備 取當歸飲片200 g，按照設計的工藝條件，用電熱炒貨機炒制，紅外線測溫儀測定鍋體溫度，平行制備所需樣品。具體操作方法為：將灶心土細粉適量，置鍋內(nèi)，以文火將土炒至松散，加入當歸飲片，相應溫度的文火炒制，取出，將多余土粉篩去，晾涼，即得。

2.2土炒當歸質(zhì)量評分規(guī)則 外觀性狀是判斷炮制品是否符合傳統(tǒng)經(jīng)驗指標的基礎，但《全國中藥炮制規(guī)范》(1988年版)僅以土炒當歸飲片的外觀性狀來判斷其炮制程度，不夠客觀。參考《中國藥典》(2020年版)將揮發(fā)油和阿魏酸作為評價當歸飲片質(zhì)量的指標性成分，其作用與當歸主要功效一致：當歸中有機酸類活性成分阿魏酸，具有抗血小板聚集、抗血栓形成、保肝利膽、抗氧化等作用[13]；當歸揮發(fā)油的主要成分藁本內(nèi)酯和正丁烯基苯酞具有緩解氣管和腸平滑肌痙攣、抑制血小板聚集作用[14]。因此，本研究擬以外觀性狀、阿魏酸與揮發(fā)油含量作為評價土炒當歸炮制程度的質(zhì)控指標。

2.2.1外觀性狀評分規(guī)則 結合《全國中藥炮制規(guī)范》(1988年版)對土炒當歸炮制程度的要求，以及通過飲片生產(chǎn)企業(yè)調(diào)研，本實驗擬對土炒當歸從表面、斷面顏色及氣味等方面進行評分。每項根據(jù)炒制情況給予1～5分，將以上三項評分求和即為外觀性狀得分，以評分高者為佳。土炒后的當歸表面呈棕黃色，并均勻掛土，斷面為土黃色，具有當歸固有香味及土香氣者為最優(yōu)，記為15分。具體得分規(guī)則見表1。

表1 土炒當歸外觀性狀得分規(guī)則

2.2.2綜合得分評價指標 為使實驗結果全面反映土炒當歸質(zhì)量，本研究對外觀性狀分值與含量測定分值各賦予了相應的權重。設定加權綜合評分滿分100分，外觀性狀、阿魏酸含量及揮發(fā)油含量權重系數(shù)分別為30%，35%，35%，以質(zhì)量控制指標所在組中最高值為參照將數(shù)據(jù)進行歸一化處理，公式為Y=(Y1/Y1max)×30+(Y2/Y2max)×35+(Y3/Y3max)×35。其中，Y為加權綜合評分值；Y1～Y3分別為某批次土炒當歸外觀性狀、阿魏酸含量及揮發(fā)油含量；Y1max～Y3max分別為其外觀性狀、阿魏酸含量及揮發(fā)油含量的最高值。

2.3阿魏酸含量測定

2.3.1陰性對照品溶液的制備 以70%甲醇作為陰性對照品溶液。

2.3.2對照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸對照品適量，使用70%甲醇溶解于棕色量瓶中，配制成12.3 μg·mL-1的溶液，即得。

2.3.3供試品溶液的制備 精密稱取土炒當歸粉末(過篩孔內(nèi)徑0.355 mm藥篩)約0.2 g，置于具塞錐形瓶中，移取70%甲醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，并加熱回流30 min。放冷后，以70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，將上清液濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4色譜條件 色譜柱：Shimadzu InertSustain C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.085%磷酸溶液(17：83)；檢測波長316 nm；柱溫35 ℃；進樣量10 μL；流速為1.0 mL·min-1；理論板數(shù)按阿魏酸峰計應不少于5000。陰性對照品、阿魏酸對照品及土炒當歸供試品高效液相色譜圖見圖1。

圖1 陰性對照品、阿魏酸對照品和供試品的高效液相色譜圖

2.3.5線性關系考察 精密移取12.3 μg·mL-1阿魏酸對照品溶液，加入70%甲醇稀釋成1.23，2.46，4.92，7.38，9.84，12.30 μg·mL-1溶液。按照“2.3.4”項下色譜條件注入高效液相色譜儀測定，并記錄峰面積。將對照品溶液濃度(X，μg·mL-1)設為橫坐標、峰面積(Y)設為縱坐標，繪制標準曲線，得到線性回歸方程Y=45 011.76X-2 763.83(r=0.999 9)。結果顯示，阿魏酸濃度在1.23～12.30 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積之間的線性關系良好。

2.3.6方法學考察 按“2.3.3”項下方法制成供試品溶液，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，所得阿魏酸峰面積RSD為0.39%，表明儀器有良好的精密度；取同一批土炒當歸粉末，制備6份供試品溶液，注入高效液相色譜儀，測得阿魏酸峰面積RSD為1.35%，表明該方法重復性良好；取同一供試品溶液，于0，2，4，8，12，24 h分別進樣，記錄色譜圖，計算得阿魏酸峰面積RSD為1.32%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；精密稱取已知含量的土炒當歸粉末(阿魏酸含量為0.51 mg·g-1)約0.1 g，共6份，分別倒入錐形瓶中，各精密加入阿魏酸對照品溶液(濃度為12.3 μg·mL-1)4 mL，按照“2.3.3”項下方法制成供試品溶液，并注入高效液相色譜儀，依法測定，計算得平均加樣回收率為101.302，RSD 1.99%，符合《中國藥典》(2020年版)規(guī)定。

2.4揮發(fā)油含量測定 按照《中國藥典》(2020年版)通則2204揮發(fā)油測定法(乙法)依法測定。

2.5炒制工藝單因素考察 根據(jù)表2所設計的工藝條件安排實驗，每組實驗平行3次，取平均值。以外觀性狀、阿魏酸和揮發(fā)油含量數(shù)據(jù)“歸一化”后的加權綜合評分為響應值，采取單因素實驗考察灶心土用量(A)、炒制溫度(B)和炒制時間(C)等對當歸土炒工藝的影響。單因素實驗結果見表2。

表2 炒制條件單因素考察實驗結果

2.5.1灶心土用量 如圖2所示，固定炒制溫度和炒制時間，響應值隨灶心土用量的增加整體呈現(xiàn)的趨勢是先增加后不變。當灶心土用量為0.30倍時達到最大值，隨即僅有微小變化。原因是灶心土應與當歸混合均勻且覆蓋充分；相反，灶心土用量過少，會使產(chǎn)品邊緣炒焦。因此，選取0.30倍量作為響應面實驗中灶心土用量的中心點。

2.5.2炒制溫度 如圖2所示，固定灶心土用量與炒制時間，在110～150 ℃范圍內(nèi)，響應值隨炒制溫度的升高而升高，外觀性狀更加符合《全國中藥炮制規(guī)范》(1988年版)規(guī)定。當溫度升至150 ℃以上時，其響應值明顯下降。原因可能是當歸所含阿魏酸及揮發(fā)油類成分穩(wěn)定性較差、經(jīng)高溫炒制后，其成分分解或揮發(fā)而使含量降低，且炒制品表面顏色加深、散發(fā)出炒焦的氣味。因此，選取150 ℃作為響應面實驗中炒制時間的中心點。

圖2 灶心土用量、炒制時間及炒制溫度對綜合評分的影響

2.5.3炒制時間 如圖2所示，固定灶心土用量及炒制溫度，響應值隨炒制時間的延長整體呈現(xiàn)出先增加后減小的趨勢，當炒制時間為8 min時達到最大值。高溫下長時間的炒制會造成阿魏酸和揮發(fā)油的分解或揮發(fā)，影響炮制效果。因此，選取8 min為響應面實驗中炒制時間的中心點。

2.6響應面法實驗設計與最佳工藝優(yōu)選

2.6.1響應面法實驗設計 在單因素實驗基礎上，依據(jù)Box-Behnken design中心組合設計原理，經(jīng)Design Expert 8.0.6版軟件設計出3因素3水平實驗方案見表3。選擇灶心土用量(A)、炒制溫度(B)和炒制時間(C)作為考察因素，對所得供試品進行外觀性狀打分，并測定阿魏酸及揮發(fā)油含量，設置各個指標的權重，得出加權綜合評分(Y)為響應值，優(yōu)化土炒當歸的最佳炮制工藝。

表3 因素水平

2.6.2模型方程的建立及顯著性檢驗 按表4安排響應面實驗得1～17號土炒當歸樣品，并進行綜合評分。運用Design Expert 8.0.6版軟件對實驗結果進行響應面分析，以加權綜合評分(Y)對各影響因素(A、B、C)進行二次多項回歸及擬合，得到各因素與響應值的擬合方程：Y=94.00-0.050A-9.50B+1.10C-0.17AB+0.015AC-3.34BC-1.94A2-10.87B2-3.80C2，R2=0.993 8。對模型采用F檢驗進行方差分析。由表5方差分析結果顯示，回歸模型F=124.26(P<0.000 1)，差異有統(tǒng)計學意義，說明模型的殘差可能是隨機誤差產(chǎn)生的；炮制溫度、炮制時間差異有統(tǒng)計學意義，灶心土用量差異無統(tǒng)計學意義；交互項BC、二次項A2、B2、C2為顯著項，交互項AB、AC為不顯著項；該模型的失擬項P=0.072 3>0.05，無顯著性，說明該模型擬合較為合理，實驗相對誤差較小。以上數(shù)據(jù)顯示，該模型能反映土炒當歸炮制過程中各因素與響應值之間的實際關系，并較好地對炮制工藝參數(shù)進行分析與預測。

表4 響應面法實驗設計與評分結果

表5 回歸模型方差分析結果

2.6.3響應面圖分析 依據(jù)Box-Behnken design擬合出的回歸方程，分析灶心土用量、炮制溫度與炮制時間其中任意兩個因素與響應值的三維響應面圖及等高線圖(圖3)，采用Design Expert 8.0.6版軟件的響應化功能對實驗結果進行回歸模型預測。得到最佳工藝條件：灶心土用量為飲片量的0.30倍、炒制溫度為140.16 ℃、炒制時間9.44 min?？傇u歸一值的最大值為96.54分。結合藥廠生產(chǎn)實際操作的可行性，最終選擇灶心土用量為0.30倍，炒制溫度為135～145 ℃，炒制時間10 min。

圖3 不同因素對土炒當歸綜合評分影響的三維響應面圖及等高線圖

2.7炮制工藝驗證 取同一批次當歸飲片500 g，灶心土用量為0.30倍、炒制溫度為140 ℃、炒制時間10 min制備土炒當歸，平行制備3批樣品。結果見表6，可知，土炒當歸的實測值(97.37分)與總評歸一化預測值(96.54分)相接近，說明該工藝條件穩(wěn)定可行。

表6 驗證實驗結果

3 討論

當歸作為一種藥食兩用的中藥，有益氣、活血、調(diào)經(jīng)、增強免疫力等功效。傳統(tǒng)的炮制理論認為“土炒入脾”，采用土炒方法，當歸入脾補血作用增強，緩和油潤，使補血而不滑腸。本研究發(fā)現(xiàn)，當歸經(jīng)土炒后，阿魏酸與揮發(fā)油含量均有不同程度的降低，與傳統(tǒng)炮制理論吻合。

本研究采用多指標、綜合評價的方法優(yōu)化土炒當歸的炒制工藝。在單因素實驗中，炒制溫度、炒制時間對阿魏酸和揮發(fā)油含量影響較大。在響應面法優(yōu)選最佳工藝實驗中，所建立擬合方程R2=0.993 8，回歸模型F=124.26(P<0.000 1)，該模型擬合度高，能反映土炒當歸炮制過程中各因素與響應值之間的實際關系，并較好地對當歸炮制工藝參數(shù)進行分析與預測。實驗結果顯示，炒制溫度和炒制時間為顯著因素，灶心土用量差異無統(tǒng)計學意義，3種因素對其影響主次順序為：炒制溫度>炒制時間>灶心土用量。最佳工藝為：將灶心土細粉(用量為飲片量的0.30倍)置于鍋內(nèi)，以140.16 ℃炒至松散，加入飲片，炒制9.44 min，取出，篩去多余土，晾涼。模型總評歸一化預測值96.54分，經(jīng)炮制工藝驗證實測值為97.37分，實測值與預測值的相對誤差較小，說明該工藝條件穩(wěn)定可行。

在小試研究所提出的工藝參數(shù)基礎上，結合中試生產(chǎn)實際，對工藝進行相應的調(diào)整，所優(yōu)選出的土炒當歸炮制工藝穩(wěn)定、具體可控，可為土炒當歸的工業(yè)化生產(chǎn)以及土炒當歸在藥食兩用領域進一步開發(fā)提供理論依據(jù)及參考。