固定化技術(shù)在燃料乙醇發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用與研究進(jìn)展

蔡鑫磊,黃益平,胡 猛,夏 苗,樊現(xiàn)超,孫瑋晨

(中建安裝集團(tuán)有限公司,江蘇 南京 210000)

我國(guó)是工業(yè)和人口大國(guó),近3年來(lái)年均石油消耗量超6億噸,其中70%以上的原油依賴于進(jìn)口,能源安全問(wèn)題亟需重視。生物燃料乙醇作為交通運(yùn)輸燃料已在全球范圍內(nèi)得到廣泛應(yīng)用,將燃料乙醇和汽油調(diào)和制成的E10乙醇汽油不僅能在不改動(dòng)汽車發(fā)動(dòng)機(jī)的前提下直接使用,還因調(diào)和后的燃料汽油中氧的增加,使燃燒更為充分,防止爆燃爆缸現(xiàn)象發(fā)生,并且可以有效減少有害氣的釋放,將污染物控制在環(huán)保等級(jí)要求之內(nèi),顯著降低環(huán)境污染[1-2]。

目前,我國(guó)燃料乙醇工業(yè)化仍以玉米、甘蔗、木薯和小麥等作物為主要原料,提取這類作物中的淀粉和糖,采用發(fā)酵技術(shù)制備得到工業(yè)級(jí)乙醇[3-5]。然而該方式發(fā)酵周期較長(zhǎng),且菌體耐受性受環(huán)境因素影響較大,使得工業(yè)乙醇產(chǎn)率低,這些技術(shù)問(wèn)題制約著工業(yè)燃料乙醇行業(yè)的快速發(fā)展。為有效解決以上問(wèn)題,燃料乙醇研究人員開始密切關(guān)注細(xì)胞固定化技術(shù)[6-7]。該技術(shù)源于酶固定化技術(shù),將游離的細(xì)胞通過(guò)物理或化學(xué)的方法限制在固定空間內(nèi)以達(dá)到細(xì)胞聚集的目的[8-10]。傳統(tǒng)的工業(yè)燃料乙醇發(fā)酵制備,往往采用游離的酵母細(xì)胞間歇發(fā)酵的方式對(duì)淀粉等物質(zhì)發(fā)酵[11]?？紤]到酵母細(xì)胞處于游離狀態(tài),體系內(nèi)細(xì)胞密度相對(duì)較低,發(fā)酵效果較差,且酵母回收時(shí)需進(jìn)行高速離心,容易對(duì)酵母細(xì)胞產(chǎn)生損傷,難以回收利用[12]。與傳統(tǒng)游離發(fā)酵相比,固定化發(fā)酵過(guò)程中酵母細(xì)胞被固定在一定空間范圍內(nèi),可極大地減少酵母細(xì)胞的流失,且單位體積內(nèi)酵母細(xì)胞多,對(duì)外界影響的抵抗力強(qiáng),發(fā)酵效果更佳[13-14]。此外,在產(chǎn)品分離過(guò)程中,固定化酵母更容易與發(fā)酵醪液分離,可大幅提高固定化酵母的重復(fù)利用率。

1 固定化技術(shù)分類

對(duì)燃料乙醇發(fā)酵的細(xì)胞固定化方法主要有5種,分別是吸附法、包埋法、膜隔離法、交聯(lián)法和絮凝法。

1.1 吸 附 法

吸附法的原理是將載體和酵母細(xì)胞通過(guò)靜電吸附或離子鍵作用力進(jìn)行結(jié)合,使酵母細(xì)胞固定在載體表面或內(nèi)部,形成一層或多層酵母細(xì)胞膜。吸附法要求載體對(duì)酵母細(xì)胞吸附能力較強(qiáng)且無(wú)毒害作用。固定化載體所能吸附細(xì)胞的總數(shù)目主要與溫度、pH、細(xì)胞以及載體特性等因素相關(guān)[15]。吸附法常用的載體有磷酸鈣膠、DEAE-纖維素、硅膠、硅藻土、陶瓷和塊狀甘蔗等[16-17]。

梁磊等[18]采用塊狀甘蔗作為載體固定酵母細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)工業(yè)乙醇發(fā)酵,以達(dá)到利用甘蔗汁發(fā)酵生產(chǎn)工業(yè)乙醇的目的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:將甘蔗塊解凍、去木質(zhì)素處理后,酵母效能大幅度提高。當(dāng)甘蔗塊的填裝率為40%,固定發(fā)酵36 h時(shí),所產(chǎn)乙醇質(zhì)量濃度可達(dá)99.34 g/L,計(jì)算可得其發(fā)酵效率高達(dá)93.09%。

1.2 包 埋 法

包埋法是通過(guò)將酵母細(xì)胞固定在多孔物質(zhì)空間中以實(shí)現(xiàn)對(duì)酵母菌固定的方法,其最大優(yōu)點(diǎn)是操作方便,固定化后的細(xì)胞強(qiáng)度高。

酵母細(xì)胞一般被包裹在固定化載體內(nèi)部,通過(guò)載體的多孔結(jié)構(gòu)獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并不斷增殖[19]。包埋法可以將酵母細(xì)胞較為嚴(yán)密地固定在介質(zhì)內(nèi)部,且該技術(shù)較為成熟,固定化酵母可循環(huán)重復(fù)利用,在生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用。包埋法常用的固定材料通常分為兩類:一類是海綿、聚氨酯泡沫塑料、沸石以及多孔陶瓷等硬性材料,另一類是海藻酸鈉、瓊脂、卡拉膠、聚丙烯酰胺等凝膠材料[20]。

王珂[21]采用海藻酸鈉包埋酵母作為固定化粒子,在含[BMIN]Cl離子液體的培養(yǎng)基中進(jìn)行乙醇發(fā)酵。研究結(jié)果表明:固定化發(fā)酵所產(chǎn)生的乙醇質(zhì)量濃度高于游離發(fā)酵,且固定化酵母能重復(fù)使用至50次。

Chandel等[22]使用1 cm×1 cm野生甘蔗莖塊“原位”包埋VS3釀酒酵母進(jìn)行固定化,分批測(cè)試了野生甘蔗的酶水解產(chǎn)物的發(fā)酵。VS3游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞分批發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量分別為(19.45±0.55) g/L和(21.66±0.62) g/L。在分批重復(fù)發(fā)酵期間,固定化VS3細(xì)胞在第8個(gè)周期中表現(xiàn)出最大的乙醇產(chǎn)量(22.85±0.44) g/L,隨后在后續(xù)發(fā)酵周期中逐漸減少。

1.3 膜隔離法

膜隔離法的原理是使用無(wú)菌半透膜將需要的細(xì)胞限制在固定空間內(nèi),該半透膜可選擇性地允許基質(zhì)和產(chǎn)物通過(guò),酵母細(xì)胞則不允許通過(guò)[23]。膜隔離法的最大優(yōu)點(diǎn)是操作方便,通過(guò)選擇孔徑大小來(lái)提高物質(zhì)通過(guò)的選擇性,能有效控制底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散[12]。缺點(diǎn)是半透膜容易發(fā)生堵塞,傳質(zhì)容易受限,生產(chǎn)成本較高,因此該方法在燃料乙醇生產(chǎn)中應(yīng)用較少。

1.4 交 聯(lián) 法

交聯(lián)法的原理是通過(guò)雙官能團(tuán)或多官能團(tuán)的交聯(lián)劑與酵母細(xì)胞的表面基團(tuán)反應(yīng),使細(xì)胞相互連接形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以達(dá)到將酵母細(xì)胞固定化的目的。交聯(lián)法不需要載體,可以得到較高的細(xì)胞濃度。由于交聯(lián)法是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)形成的化學(xué)鍵相連接,固定化酵母細(xì)胞間結(jié)合力高,環(huán)境耐受程度較高,可承受溫度、pH的劇烈變化[23]。然而,由于交聯(lián)反應(yīng)過(guò)于劇烈,使得酵母細(xì)胞活性降低,無(wú)法再生,而且固化細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度較低。因此該方法在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用較少,常與其他固定化方法結(jié)合使用[24]。

祝英等[25]使用玉米糖化醪作為發(fā)酵底物,使用交聯(lián)法、瓊脂凝膠法、海藻酸鈣凝膠法和聚乙烯醇包埋法4種發(fā)酵培養(yǎng)手段對(duì)酵母進(jìn)行合理固定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:將4種固定化酵母用于分批和連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)工業(yè)乙醇中時(shí),交聯(lián)法的發(fā)酵效率要明顯低于其他3種方法,并且其穩(wěn)定性也相對(duì)較差。

1.5 絮 凝 法

絮凝法的原理是利用微生物間相互吸附的能力使細(xì)胞吸附形成絮凝顆粒,以此將酵母細(xì)胞固定化。該方法同樣不需要添加固定化載體,且其具有對(duì)酵母細(xì)胞的固定相對(duì)簡(jiǎn)單、細(xì)胞代謝能力強(qiáng)、傳質(zhì)阻力小以及細(xì)胞壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。另外,絮凝法操作簡(jiǎn)單,固定化過(guò)程中不需要添加其他化學(xué)物質(zhì),因此酵母細(xì)胞在整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中未受到外來(lái)物質(zhì)影響,有利于酵母細(xì)胞代謝目標(biāo)產(chǎn)物,且不影響酵母細(xì)胞壽命。絮凝顆粒內(nèi)部松散、傳質(zhì)阻力很小,因此絮凝顆粒存在剛性較差、易變性等問(wèn)題[26-27]。

Verstrepen等[28]認(rèn)為細(xì)胞絮凝的原因存在兩種可能:一種是由相鄰細(xì)胞表面存在的凝集素與甘露糖結(jié)合導(dǎo)致;另一種可能是由于細(xì)胞表面的多肽吸引作用或者疏水作用導(dǎo)致絮凝。伍彥華等[29]研究了自絮凝菌株的選育,以木薯為原料,比較了3株酵母SLS、SYA、SJY和一株自絮凝酵母FJY濃醪發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的性能,結(jié)果表明:4株酵母菌株中自絮凝菌株FYJ乙醇產(chǎn)量高,耗糖能力強(qiáng),發(fā)酵86 h后,乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到15.7%,總殘?zhí)?.35%,副產(chǎn)物產(chǎn)量比其他3株酵母菌株低20%。

2 固定化生物反應(yīng)器

目前,傳統(tǒng)的工業(yè)燃料乙醇發(fā)酵生產(chǎn)工藝開始向連續(xù)化發(fā)酵技術(shù)轉(zhuǎn)變,主要目的是在原有工藝基礎(chǔ)上將酵母固定化技術(shù)和連續(xù)發(fā)酵相結(jié)合,從而提高工業(yè)乙醇產(chǎn)出率,其中最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)就是生物反應(yīng)器的選擇和工藝參數(shù)的設(shè)定。

2.1 流化床反應(yīng)器

流化床反應(yīng)器的主要原理是通過(guò)流體流動(dòng)讓反應(yīng)體系中的固定層顆粒處于懸浮運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。根據(jù)反應(yīng)器應(yīng)用環(huán)境可將其分為兩類:固相加工和液相流體加工[30]。該反應(yīng)器的最大優(yōu)點(diǎn)是傳質(zhì)及傳熱效率高,便于連續(xù)操作。但該類反應(yīng)器對(duì)固液相要求相對(duì)苛刻,只能應(yīng)用在固定化載體與發(fā)酵液密度接近的兩相反應(yīng)中,其主要原因是發(fā)酵液密度過(guò)大會(huì)導(dǎo)致固定化細(xì)胞在整個(gè)反應(yīng)體系中上浮效果不理想,反應(yīng)不充分,出現(xiàn)乙醇產(chǎn)出率低的現(xiàn)象[21]。

趙玲等[31]以木薯淀粉糖化醪為發(fā)酵原料,采用海藻酸鈣包埋的固定化酵母細(xì)胞和流化床反應(yīng)器進(jìn)行乙醇發(fā)酵。在反應(yīng)器離子填充率為30%,發(fā)酵底物初糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%～17%,發(fā)酵時(shí)間為9 h條件下進(jìn)行反應(yīng)。發(fā)酵結(jié)束后成熟醪中乙醇體積分?jǐn)?shù)為9.5%左右,殘余還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)不高于11%,乙醇生產(chǎn)能力穩(wěn)定在5.17～5.9 g/(L·h)。在發(fā)酵底物初糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24.53%,發(fā)酵時(shí)間11 h條件下,成熟醪中乙醇體積分?jǐn)?shù)為12.1%,殘余還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.91%,乙醇生產(chǎn)能力控制在6.08 g/(L·h)。

2.2 填充床反應(yīng)器

填充床生物反應(yīng)器主要是將固定化介質(zhì)填充進(jìn)反應(yīng)器內(nèi)部制成穩(wěn)定床層并通入底物溶液進(jìn)行反應(yīng)。該反應(yīng)器的主要優(yōu)點(diǎn)在于返混小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單和機(jī)械磨損率低等[21,23],適用于各種不同形狀的固定化載體和沒(méi)有固體顆粒、黏度不高的底物溶液。該反應(yīng)器的不足在于在操作過(guò)程中無(wú)法對(duì)固定化介質(zhì)進(jìn)行更換,因此會(huì)出現(xiàn)風(fēng)溝、氣溝等現(xiàn)象,且存在傳質(zhì)及傳熱效果較差等問(wèn)題。

Liu等[32]以過(guò)期大米為發(fā)酵原料,采用棉纖維吸附固定化酵母,使用具有多層填充床固定結(jié)構(gòu)和多分支循環(huán)路徑的320 t中試反應(yīng)器代替典型的圓柱形固定反應(yīng)器進(jìn)行乙醇發(fā)酵。固定化酵母完成發(fā)酵后的乙醇體積分?jǐn)?shù)和發(fā)酵效率均值分別為12.46%和83.72%,分別比游離細(xì)胞發(fā)酵高0.45%和3.2%。該發(fā)酵重復(fù)32批次,結(jié)果表明該發(fā)酵方式具有良好的重復(fù)性和長(zhǎng)期穩(wěn)定性。

2.3 氣升式反應(yīng)器

氣升式反應(yīng)器是由鼓泡式反應(yīng)器演化改進(jìn)而來(lái),氣源是該反應(yīng)器的主要?jiǎng)恿ρb置。其原理是依靠純液體和含氣泡液體之間的密度差來(lái)完成特定路徑的流動(dòng),氣體通過(guò)流動(dòng)循環(huán)來(lái)完成物質(zhì)間的反應(yīng)[33]。該反應(yīng)器有兩個(gè)主要的液體池,通入氣體部分為升氣管,不通入氣體部分為降液管[34]。其主要優(yōu)點(diǎn)是節(jié)能環(huán)保,且反應(yīng)器自身可明顯降低內(nèi)部剪切應(yīng)力,對(duì)固定化細(xì)胞基本不會(huì)產(chǎn)生任何破壞。

張慶文等[35]以玉米粉為原料,使用一種15 L改進(jìn)型氣升式外環(huán)流反應(yīng)器進(jìn)行乙醇發(fā)酵,發(fā)酵48 h后,測(cè)得的乙醇體積分?jǐn)?shù)高達(dá)12.8%,取樣測(cè)得殘?zhí)琴|(zhì)量濃度為3.8 g/L,與普通型氣升環(huán)流反應(yīng)器相比,發(fā)酵效率得到極大的提升。

2.4 攪拌釜反應(yīng)器

攪拌釜反應(yīng)器是較為傳統(tǒng)的生物化學(xué)反應(yīng)器,該類反應(yīng)器通過(guò)機(jī)械攪拌對(duì)攪拌釜內(nèi)部物質(zhì)進(jìn)行充分?jǐn)嚢?以達(dá)到反應(yīng)目的。雖然反應(yīng)器存在攪拌裝置,混合較為充分,反應(yīng)比較徹底,但由于整個(gè)過(guò)程為機(jī)械攪拌,因此當(dāng)反應(yīng)過(guò)程中攪拌產(chǎn)生的剪切力過(guò)大時(shí),會(huì)對(duì)體系內(nèi)固化的細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成一定影響,導(dǎo)致固定化細(xì)胞外泄[21,33]。

季更生等[36]以30 g/L葡萄糖和15 g/L木糖為原料,將兩者混合均勻后作為發(fā)酵底物加入到1.5 L的全混釜生物反應(yīng)器中,對(duì)1株樹干畢赤酵母馴化菌株進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵反應(yīng),得出二級(jí)連續(xù)發(fā)酵對(duì)還原糖的利用率比一級(jí)發(fā)酵高6%的結(jié)論。

2.5 膜式反應(yīng)器

膜式反應(yīng)器的原理是將乙醇發(fā)酵與膜的滲透汽化進(jìn)行耦合,此類反應(yīng)器由于膜的比表面積相對(duì)較大,因此在整個(gè)工藝過(guò)程中催化效率也相對(duì)較高。但是膜反應(yīng)器在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生濃差極化、膜污染等問(wèn)題,進(jìn)而導(dǎo)致傳質(zhì)效率下降、膜孔堵塞,不利于生產(chǎn),因此該類反應(yīng)器中的膜需要定時(shí)清洗和維護(hù)[37]。

丁文武等[38]采用硅橡膠膜(PDMS)滲透汽化與酵母細(xì)胞固定床耦合發(fā)酵連續(xù)化生產(chǎn)乙醇,該系統(tǒng)能大幅度降低乙醇對(duì)細(xì)胞的抑制作用,提高乙醇產(chǎn)率。該系統(tǒng)經(jīng)378.5 h連續(xù)穩(wěn)定運(yùn)行,下游產(chǎn)品產(chǎn)率最大為32%,總通量最大值為690 g/(m2·h),計(jì)算得其分離因子為7.2,分離效果較好。該系統(tǒng)PDMS膜投入使用后,發(fā)酵液內(nèi)乙醇質(zhì)量濃度由間歇發(fā)酵時(shí)的70 g/L降至43 g/L,大大減輕了乙醇對(duì)細(xì)胞的發(fā)酵作用。通過(guò)將PDMS膜與酵母固定床耦合,有效提高了生產(chǎn)效率,乙醇體積產(chǎn)率和葡萄糖發(fā)酵效率分別是游離連續(xù)發(fā)酵的2.1倍和2.5倍。

3 共固定化技術(shù)

共固定化技術(shù)的最大特點(diǎn)是能在同一載體內(nèi)部同時(shí)嵌入2種或2種以上的酶或細(xì)胞,從而建立一個(gè)共固定化發(fā)酵體系。這種共固定化體系能將2種不同細(xì)胞的功能同時(shí)發(fā)揮出來(lái),以達(dá)到提高乙醇產(chǎn)率的目的[39]。該類技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是將混合發(fā)酵和固定化技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合,兼具發(fā)酵和固定雙重屬性[40-41],可有效縮短生產(chǎn)周期、提高生產(chǎn)率。使用不同原料生產(chǎn)燃料乙醇時(shí),不同原料水解后的糖化液中不僅含有葡萄糖,還可能含有半乳糖、阿拉伯糖、麥芽糖、乳糖和木糖等多種糖分,使用單一的微生物很難將其完全代謝利用[42-43]。而利用共固定化技術(shù)使用多種細(xì)菌或真菌協(xié)同發(fā)酵能夠有效提高底物的利用效率。共固定化技術(shù)所用方法與上述固定化方法基本相同,有吸附法、包埋法和交聯(lián)法等。共固定化技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)是能夠合理地將固定化優(yōu)勢(shì)與多種酶或細(xì)胞的功能相結(jié)合,從而提高其選擇性[40]。與傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)相比,共固定化技術(shù)具有發(fā)酵時(shí)間短、乙醇產(chǎn)率高、可連續(xù)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn),可以幫助企業(yè)節(jié)能降耗,大幅度降低燃料乙醇生產(chǎn)成本。

周志明等[44]選用海藻酸鋁凝膠作為反應(yīng)體系的載體,選用木薯淀粉為反應(yīng)原料,將酵母細(xì)胞和糖化酶共固定化發(fā)酵,通過(guò)同步糖化發(fā)酵的方式來(lái)制取工業(yè)乙醇。研究表明:在整個(gè)反應(yīng)體系中影響轉(zhuǎn)化的主要因素有凝膠填充率、糖化酶添加量和發(fā)酵溫度等。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化反應(yīng)工藝,優(yōu)化后的工藝參數(shù)為凝膠填充率50%、糖化酶添加量300 U/g、發(fā)酵溫度37 ℃、pH 4.0～4.5、料液質(zhì)量比1∶2,當(dāng)醪液中乙醇體積分?jǐn)?shù)為13.4%時(shí),其淀粉利用率達(dá)到峰值90.2%。

Altuntas[45]通過(guò)對(duì)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌和葡萄糖苷酶進(jìn)行共固定化來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇,結(jié)果表明:該反應(yīng)體系中98%的底物已轉(zhuǎn)化,乙醇產(chǎn)率高達(dá)7.6 g/(L·h)。Lee等[46]采用DEAE-玉米秸稈材料吸附釀酒酵母和樹干畢赤酵母進(jìn)行共固定化,發(fā)酵海帶水解物生產(chǎn)乙醇,結(jié)果表明:水解物中葡萄糖和木糖完全轉(zhuǎn)化為乙醇,乙醇的產(chǎn)率為0.126 g/(L·h),比單獨(dú)使用樹干畢赤酵母發(fā)酵海帶水解物的乙醇產(chǎn)率高2.7倍。

4 結(jié) 論

細(xì)胞固定化技術(shù)的發(fā)展為傳統(tǒng)乙醇發(fā)酵行業(yè)帶來(lái)了全面的技術(shù)革新。眾多研究成果表明:固定化酵母相較于游離酵母具有明顯優(yōu)勢(shì)。雖然固定化酵母發(fā)酵乙醇具有發(fā)酵效率高、乙醇產(chǎn)率高和附加值高等優(yōu)點(diǎn),但固定化載體易結(jié)垢、發(fā)酵過(guò)程中的雜菌污染等問(wèn)題也制約著固定化酵母在燃料乙醇發(fā)酵生產(chǎn)中的大規(guī)模應(yīng)用。因此,今后可從構(gòu)建具有良好發(fā)酵和吸附性能的酵母菌株、開發(fā)易于糖和乙醇通過(guò)的固定化載體、構(gòu)建同步糖化發(fā)酵的共固定體系等方面進(jìn)行深入研究。隨著固定化技術(shù)在燃料乙醇領(lǐng)域的深入研究及應(yīng)用,固定化技術(shù)將有效地推動(dòng)燃料乙醇工業(yè)生產(chǎn)的快速發(fā)展。