內(nèi)生真菌簡青霉CEF-818 對棉花黃萎病的防治效果及機理

蒲丹丹，張亞林，白紅燕，魏峰，馮鴻杰，趙麗紅，顧愛星，朱荷琴，彭軍,*，馮自力*

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所/ 棉花生物學國家重點實驗室，河南 安陽 455000；2. 新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/ 教育部棉花工程研究中心，烏魯木齊 830052）

由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）引起的棉花黃萎病（cotton Verticillium wilt）是世界范圍內(nèi)主要的土傳性維管束真菌病害，被稱為棉花的“癌癥”[1]，嚴重影響棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì)，是我國棉花優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的主要障礙之一[2-3]，常年大面積發(fā)生[4]。 目前，輪作倒茬、抗病品種選育以及化學防治等是防治棉花黃萎病的主要措施。 但大麗輪枝菌寄主范圍廣、致病力強、變異快，且其微菌核在土壤中存活時間久，因而抗黃萎病棉花品種不易獲得[5]。 雖然化學防治對棉花黃萎病的防治效果強、穩(wěn)定性高，但嚴重影響人畜安全和生態(tài)可持續(xù)發(fā)展。 近年來，生物防治（簡稱為“生防”）以綠色環(huán)保、不易產(chǎn)生抗性、發(fā)展?jié)摿Υ蟮葍?yōu)勢被人們關(guān)注并且應(yīng)用于生產(chǎn)實踐[5]。 可用于防治植物病害的生防因子很多，包括拮抗微生物、抗生素和植物誘導子等[6]。 內(nèi)生真菌作為非常豐富的微生物資源，普遍存在于植物組織中，對植物的生長具有積極的影響。 在長期的協(xié)同進化過程中，與寄主植物形成了互惠共生的關(guān)系[7]。 目前，利用拮抗內(nèi)生真菌防治植物病害已有較多報道。趙沛等[8]從健康的棉花植株中分離得到內(nèi)生真菌腐皮鐮孢菌（Fusarium solani）菌株CEF-373，對棉花黃萎病有顯著的抑制效果。 張海軍等[9]研究發(fā)現(xiàn)，綠色木霉菌（Trichoderma viride）菌株GY20 可導致棉花枯萎病菌（F. oxysporumf. sp.vasinfectum）菌絲斷裂，顯著抑制棉花枯萎病。Barra-Bucarei 等[10]研究表明球孢白僵菌（Beauveria bassiana）處理番茄和辣椒的根部，能有效抑制灰霉病菌（Botrytiscinerea）引起的病害。牛毅等[11]自羽茅（Achnatherum sibiricum） 分離的內(nèi)生真菌Neotyphodium sibiricum、N.gansuensis和Epichloё gansuensis對新月彎孢霉（Curvularia lunata）、根腐離蠕孢（Bipolaris sorokiniana）和枝孢霉（Cladosporiumsp.）等病原真菌都具有一定的抑制作用。

目前，關(guān)于簡青霉（Penicillium simplicissimum）防治棉花黃萎病已有少量研究，如王玲飛[12]從健康的棉花中分離到的簡青霉菌株CEF-818 對棉花黃萎病有防治效果， 但作用機理尚不明確。將利用固體發(fā)酵方式制成的簡青霉CEF-818 生防菌劑應(yīng)用到農(nóng)業(yè)病害防治中的研究還未見報道。 因此，本研究以從健康棉花植株中分離得到的CEF-818 為研究對象，進一步研究該菌株代謝產(chǎn)物對大麗輪枝菌菌絲生長的影響，評估制成的生防菌劑對棉花黃萎病的防治效果，檢測其誘導棉花植株抗病性的能力，初步揭示該菌株防治棉花黃萎病的作用機理，以期為研制高效防治棉花黃萎病的微生物菌劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

拮抗內(nèi)生真菌簡青霉菌株CEF-818（菌株編號：CGMCC 8320）分離自健康棉花植株，屬于青霉屬的叉狀亞屬，可在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar,PDA）培養(yǎng)基上生長，其菌落表面呈淡灰綠色。 病原菌： 大麗輪枝菌強致病力菌株Vd080。 棉花品種：魯棉研21 號，耐黃萎病[13]。

PDA（平板）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、水1 L，自然pH；馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基 （potato dextrose broth， 液體， 也稱為“PDB 培養(yǎng)液”）：除不加瓊脂外，其他物質(zhì)添加同PDA 培養(yǎng)基， 自然pH。 察氏培養(yǎng)基（Czapek’s medium，液體，也稱為“察氏培養(yǎng)液”）：硝酸鈉2 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.02 g、七水硫酸鎂0.5 g、蔗糖30 g、磷酸氫二鉀1.31 g、蒸餾水1 L，自然pH。

1.2 CEF-818 對大麗輪枝菌抑制效果的檢測

采用對峙培養(yǎng)法[14]檢測CEF-818 對Vd080菌絲生長的影響。 利用PDA 培養(yǎng)基活化Vd080和CEF-818，在25 ℃恒溫箱中暗培養(yǎng)7 d。 然后用滅菌后的打孔器在菌落邊緣取直徑為6 mm 的菌餅 （下文中的Vd080 和CEF-818 菌餅均按此方法制備）， 在PDA 平板培養(yǎng)基底部劃直線，在兩端分別接Vd080 菌餅和CEF-818 菌餅， 兩端間隔40 mm， 以只接Vd080 菌餅的PDA 平板培養(yǎng)基為對照，每個處理設(shè)5 次重復。 在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)15 d， 觀察并測量菌落半徑，計算抑制率（I）。抑制率計算公式：I＝（r1－r2）/r1×100%， 式中r1和r2分別為對照和處理中Vd080菌落半徑增長量（mm）。

采用對扣培養(yǎng)法[8]檢測CEF-818 揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對Vd080 菌絲生長的影響。 將Vd080 菌餅和CEF-818 菌餅分別接種到PDA 平板培養(yǎng)基中央，對扣密封；以菌株Vd080 和空白PDA 平板培養(yǎng)基對扣培養(yǎng)為對照，每個處理設(shè)5 次重復。 在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)15 d，采用十字交叉法測量Vd080 菌落半徑，計算抑制率。

采用圓盤濾膜培養(yǎng)法[12]檢測CEF-818 非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對Vd080 菌絲生長的影響。將滅菌后的玻璃紙單層平鋪到PDA 平板培養(yǎng)基中，挑取CEF-818 菌餅，放置到PDA 平板培養(yǎng)基中央，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)10 d 后， 挑取Vd080 菌餅， 放置到去除玻璃紙的PDA 平板培養(yǎng)基中央， 以空白PDA 平板培養(yǎng)基接種Vd080菌餅為對照，每個處理設(shè)5 次重復。 在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)15 d，然后利用十字交叉法測量Vd080 菌落半徑，計算抑制率。

1.3 CEF-818 對棉花黃萎病的溫室防治效果檢測

1.3.1灌根接種法。 挑取CEF-818 菌餅（制備方法同1.2） 放置在PDB 培養(yǎng)液中， 在轉(zhuǎn)速180 r·min－1、25 ℃的搖床中培養(yǎng)7 d， 得到CEF-818 液體菌種。先用4 層無菌紗布過濾CEF-818 液體菌種，再用孔徑0.22 μm 的微孔濾膜器過濾，獲得CEF-818 濾液，備用。 將蛭石、沙子、營養(yǎng)土按體積比3︰2︰1 混合均勻后裝入營養(yǎng)紙缽（高10 cm，直徑6 cm，下同）中，裝土量為營養(yǎng)紙缽體積的80%。 將棉種在45 ℃水中浸泡10 h，每缽播8 粒種子，以6 個營養(yǎng)紙缽為1 個處理，每個處理設(shè)3次重復。 播種后，待棉種全部出苗，每個營養(yǎng)紙缽定苗5 株，置于日光溫室中培育，待棉苗第1 片真葉初現(xiàn)時，每缽接種50 mL CEF-818 濾液（原液，未經(jīng)濃縮）即濾液灌根處理，每缽接種50 mL PDB 培養(yǎng)液即PDB 灌根對照（CK）。 3 d 后接種Vd080 孢子懸浮液 （孢子含量1×107mL－1的察氏培養(yǎng)液），每缽10 mL。

1.3.2基質(zhì)接種法。 在10 g 麥麩培養(yǎng)物中，按料水質(zhì)量比1︰0.5 加入清水， 混合均勻后裝入200 mL 培養(yǎng)瓶中，121 ℃滅菌30 min，待冷卻后，按培養(yǎng)物濕質(zhì)量的5%接種CEF-818 液體菌種（CEF-818 液體菌種制備方法同1.3.1）， 在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)7 d， 然后將培養(yǎng)物自然風干，制成CEF-818 固體菌劑，備用。將蛭石、沙子、營養(yǎng)土（體積比3︰2︰1）混合均勻后，按3%（質(zhì)量分數(shù)，下同）接種CEF-818 固體菌劑，混合均勻后裝入營養(yǎng)紙缽作為固體菌劑基質(zhì)處理組；將上述蛭石、沙子、營養(yǎng)土混合物按3%接種無菌培養(yǎng)基質(zhì)，混合均勻后裝入營養(yǎng)紙缽作為無菌培養(yǎng)基質(zhì)對照組。 將棉種在45 ℃水中浸泡10 h，每缽播8 粒種子，以6 個營養(yǎng)紙缽為1 個處理，每個處理設(shè)3 次重復。 播種后，置于日光溫室中培育，待棉苗第1 片真葉初現(xiàn)時接種Vd080 孢子懸浮液（孢子含量1×107mL－1的察氏培養(yǎng)液）， 每缽10 mL。

1.3.3棉苗的培育及病害調(diào)查和計算方法。 上述處理后的棉苗放置在溫度20～32 ℃的日光溫室中培育，在接種Vd080 孢子懸浮液后25 d，參照趙麗紅等[15]5 級分級標準進行黃萎病發(fā)生情況調(diào)查，計算病情指數(shù)和防治效果。 計算公式：DI＝∑（Ni×i）/（N×4）×100，式中DI為病情指數(shù)，i為病級數(shù)值，Ni為i級病株數(shù)，N為調(diào)查總株數(shù)；E＝（DI0－DI1）/DI0×100%， 式中E為防治效果，DI0和DI1分別為對照和處理的病情指數(shù)。

1.4 CEF-818 對棉花黃萎病的大田防治效果檢測

1.4.1肥料撒施法。 CEF-818 固體菌劑制備方法同1.3.2，在棉花黃萎病病圃中進行田間防治效果檢測試驗，設(shè)計種植小區(qū)，2 行為1 個處理，每個處理設(shè)3 次重復，每行長2.8 m，行距0.55 m，株距20 cm。 在播種魯棉研21 號時，在每行種溝中均勻撒施5 g 的CEF-818 菌劑或無菌培養(yǎng)物作為固體菌劑處理和無菌培養(yǎng)基質(zhì)對照。 播種后60 d 調(diào)查棉花黃萎病發(fā)生情況。 病情的分級標準、病情指數(shù)和防治效果的計算同1.3.3。

1.4.2浸種接種法。 CEF-818 濾液制備方法同1.3.1。 以消毒后的魯棉研21 號棉種在CEF-818濾液中浸泡10 h 為濾液浸種處理， 以PDB 培養(yǎng)液浸種10 h 為PDB 浸種對照， 將處理后的魯棉研21 號種子種植在棉花黃萎病病圃中， 種植小區(qū)設(shè)計同1.4.1， 于播種后60 d 調(diào)查棉花黃萎病的發(fā)生情況。 病情的分級標準、病情指數(shù)和防治效果的計算同1.3.3。

1.5 CEF-818 對棉種出苗和棉苗生長的影響

試驗設(shè)計及棉花的種植和培育方法同1.3.2，播種后5 d 統(tǒng)計處理組和對照組的出苗數(shù)并計算出苗率；出苗后20 d，分別在處理組和對照組隨機取15 株棉苗，測量棉苗的株高、根長、地上部鮮物質(zhì)質(zhì)量、地下部鮮物質(zhì)質(zhì)量。

1.6 葉片活性氧含量的檢測

魯棉研21 號棉苗種植方式同1.3.2， 接種Vd080 孢子懸浮液后2 d， 利用3,3-二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzine, DAB）組織染色法檢測棉花葉片中活性氧的產(chǎn)生和積累，選長勢相近的棉花取6 片真葉用無菌水清洗后放到離心管中，在離心管中加入適量的DAB（1 g·L－1）染液，避光染色8 h，倒掉染液后，加入適量95%（體積分數(shù)）乙醇溶液，將其放置在沸水中水浴2 min，去除葉綠素后，繼續(xù)在離心管中加入無水乙醇放置到沸水中水浴直至葉片綠色完全脫去。 然后將葉片浸泡在70%（體積分數(shù)）的甘油中，最后利用體式顯微鏡（Leica M165FC，德國）觀察。

1.7 CEF-818 誘導棉花胼胝質(zhì)積累的檢測

魯棉研21 號棉苗種植方式同1.3.2， 接種Vd080 孢子懸浮液后2 d，選長勢相近的棉花，取6 片真葉用無菌水清洗后放到離心管中， 在離心管中加入適量乙醇- 乙酸（體積比3︰1）固定液固定2～3 h，脫去葉綠素；去除固定液后，將葉片分別浸泡于70%（體積分數(shù)，下同）和50%的乙醇中2 h 后，用無菌水浸泡過夜；用無菌水漂洗葉片2～3 次后， 將葉片浸泡于10%（質(zhì)量分數(shù)）的NaOH 溶液中處理1～2 h，使葉片透明；去除NaOH 溶液，將葉片用無菌水漂洗3～4 次后放到0.01%（質(zhì)量分數(shù)）的苯胺藍染液中避光染色3～4 h，染色結(jié)束后，在熒光顯微鏡（Nikon 80i，日本）下觀察胼胝質(zhì)沉積情況。

1.8 CEF-818 誘導棉花防御相關(guān)基因表達的檢測

1.8.1棉花葉片中總RNA 的提取。魯棉研21 號棉苗種植和接種方式等同1.3.1， 在接種Vd080后24 h、48 h、72 h 取棉花葉片進行總RNA 的提取，采用RNAprep Pure Plant Kit（天根生化科技（北京）有限公司，北京）提取棉花葉片中RNA，用NanoDrop 2000 檢測RNA 濃度，并將RNA 的質(zhì)量濃度調(diào)到100 mg·L－1備用。

1.8.2cDNA 第1 鏈的合成。 利 用HiScriptⅢ1st Strand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，具體操作步驟參照說明書， 最后將得到的cDNA稀釋8～10 倍，－80 ℃保存。

1.8.3檢測基因的表達量。 用SYBR Green 為染料進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR），檢測棉花葉片中防御相關(guān)過氧化物酶（peroxidase,POD）基因POD、苯丙氨酸氨裂合酶（phenylalanine ammonia-lyase,PAL）基因PAL和病程相關(guān)蛋白（pathogenesis-related protein, PR protein）基因PR10的表達量， 以棉花中高度保守的基因ubiquitin為內(nèi)參基因， 所用特異性引物序列如表1[16]。 qRT-PCR反應(yīng)體系：10 μmol·L－1上下游引物各0.4 μL，2×PerfectStart TM Green qPCR SuperMix 10 μL，cDNA 2 μL， 用 無 核 酸 酶 水（nuclease-free water）補足至20 μL；反應(yīng)條件：94 ℃預變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共45 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。每個處理重復3 次，采用2－駐駐Ct法計算基因相對表達量。

表1 防御相關(guān)基因的特異性引物Table 1 Specific primers of related resistance genes

1.9 檢測棉苗根中Vd080 定植量

魯棉研21 號棉苗種植和菌株接種方式等同1.3.2，在接種Vd080 孢子懸浮液后4 d 取棉苗根部，提取棉花根部總RNA 后反轉(zhuǎn)錄為cDNA（方法同1.8），以棉花中高度保守的基因ubiquitin為內(nèi)參基因，大麗輪枝菌的β-tubulin基因為檢測基因（正向引物序列為AACAACAGTCCGATGGATAATTC，反向引物序列為GTACCGGCTCGAGATCG），qRT-PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同1.8.3。 采用2－駐駐Ct法對基因的相對表達量進行分析，確定Vd080 在棉花根部的定植量。

1.10 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Microsoft Office Excel 2019 整理處理試驗數(shù)據(jù)， 利用軟件IBM SPSS Statistics 26.0 對試驗數(shù)據(jù)進行差異性分析，利用軟件Origin 2018制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株CEF-818 對大麗輪枝菌的抑制效果

對峙培養(yǎng)結(jié)果 （圖1A、B） 表明： 經(jīng)菌株CEF-818 處理的試驗組，菌株Vd080 菌落半徑增加6.7 mm；未經(jīng)菌株CEF-818 處理的對照組，菌株Vd080 菌落半徑增加20.7 mm。 菌株CEF-818對菌株Vd080 的抑制率為67.63%。

對扣培養(yǎng)菌落生長測定結(jié)果 （圖1C、D）表明： 經(jīng)菌株CEF-818 揮發(fā)性代謝產(chǎn)物處理后，菌株Vd080 菌落半徑增加11.9 mm； 對照組菌株Vd080 菌落半徑增加28.4 mm。 菌株CEF-818 的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對菌株Vd080 的抑制率為58.10%。

圓盤濾膜培養(yǎng)結(jié)果（圖1E、F）表明：經(jīng)菌株CEF-818 非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物處理的試驗組，菌株Vd080 菌落半徑增加0.00 mm； 對照組菌株Vd080 菌落半徑增加33.3 mm。 菌株CEF-818 的非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對菌株Vd080 的抑制率為100.00%。

圖1 CEF-818 在對峙培養(yǎng)（A、B）、對扣培養(yǎng)（C、D）和圓盤濾膜培養(yǎng)（E、F）下對大麗輪枝菌Vd080 菌落生長的影響Fig. 1 Effects of CEF-818 on colony growth of V.dahliae Vd080 under the confront culture (A, B),plate-to-plate culture (C, D) and exudate filtering culture (E, F)

2.2 菌株CEF-818 對棉花黃萎病的溫室防治效果

根據(jù)接種Vd080 孢子懸浮液后25 d 的發(fā)病情況觀察， 在2 種處理方式下，CEF-818 處理的棉花黃萎病的發(fā)病程度均較輕，變黃和枯萎的棉花葉片數(shù)量較少， 而對照組棉花葉片大量枯萎、凋落（圖2）。

圖2 棉花內(nèi)生真菌CEF-818 處理和對照的棉花黃萎病發(fā)生情況比較Fig. 2 Comparison of Verticillium wilt occurrence between CEF-818 treatments and relative controls

灌根接種法病情調(diào)查結(jié)果表明，濾液灌根處理的棉花病株率和病情指數(shù)均顯著低于PDB 灌根對照，對棉花黃萎病的防治效果為45.84%。 基質(zhì)接種法病情調(diào)查結(jié)果表明，固體菌劑基質(zhì)處理與無菌培養(yǎng)基質(zhì)對照相比，顯著降低了棉花的發(fā)病率和病情指數(shù)，對棉花黃萎病的溫室防治效果為69.77%（表2）。

表2 不同處理下棉花黃萎病發(fā)生情況和CEF-818 的溫室防治效果Table 2 Cotton Verticillium wilt incidence of different treatments and control effects of CEF-818 in the greenhouse

2.3 菌株CEF-818 對棉花黃萎病的田間防治效果

肥料撒施試驗結(jié)果表明，固體菌劑基質(zhì)處理和無菌培養(yǎng)基質(zhì)對照相比，顯著降低棉花發(fā)病率和病情指數(shù)， 對棉花黃萎病的田間防治效果為63.73%。 浸種接種試驗結(jié)果表明，CEF-818 濾液浸種處理的棉花病株率和病情指數(shù)均顯著低于PDB 浸種對照，對棉花黃萎病的田間防治效果為53.96%（表3）。

表3 不同處理下棉花黃萎病發(fā)生情況和CEF-818 的田間防治效果Table 3 Cotton Verticillium wilt incidence of different treatments and control effects of CEF-818 in the field

2.4 菌株CEF-818 對棉種出苗和棉苗生長的影響

固體菌劑基質(zhì)處理和無菌培養(yǎng)基質(zhì)對照棉種的出苗率分別為91.14%和74.47%（表4），表明菌株CEF-818 對棉種的出苗可起顯著促進作用。 結(jié)果還表明，CEF-818 對棉苗的株高和地上部鮮物質(zhì)質(zhì)量有顯著的促進效果，對根長和地下部鮮物質(zhì)質(zhì)量的促進效果不顯著。

表4 CEF-818 菌劑處理對棉花出苗率和生物量的影響Table 4 Effect of CEF-818 on seedling emergence rate and biomass of cotton

2.5 菌株CEF-818 誘導棉花的活性氧爆發(fā)

棉花葉片中活性氧鏡檢結(jié)果 （圖3） 顯示：CEF-818 固體菌劑處理的棉花葉片中的褐色沉淀較多，而無菌培養(yǎng)基質(zhì)對照的棉花葉片中褐色沉淀較少。這表明CEF-818 誘導了棉花葉片中的活性氧爆發(fā)。

圖3 接種Vd080 后2 d CEF-818 誘導棉花葉片中的活性氧爆發(fā)Fig. 3 Induction of oxidative burst in cotton leaves by CEF-818 at 2 d after inoculation of Vd080

2.6 菌株CEF-818 誘導棉花胼胝質(zhì)積累

接種大麗輪枝菌Vd080 孢子懸浮液后2 d，對棉花葉片中胼胝質(zhì)的鏡檢結(jié)果（圖4）顯示，經(jīng)CEF-818 固體菌劑處理的棉花葉片中胼胝質(zhì)（藍色熒光）的積累量較多，而無菌培養(yǎng)基質(zhì)對照棉花葉片中胼胝質(zhì)的積累量較少。這表明，CEF-818誘導了棉花葉片中胼胝質(zhì)的積累。

圖4 接種Vd080 后2 d CEF-818 誘導棉花葉片中胼胝質(zhì)積累情況Fig. 4 Induction of callose accumulation in cotton leaves by CEF-818 at 2 d after inoculation of Vd080

2.7 菌株CEF-818 對棉花防御相關(guān)基因表達量的影響

棉花葉片中防御相關(guān)基因POD、PAL和PR10的表達量檢測結(jié)果 （圖5） 表明， 接種CEF-818 誘導棉花葉片中POD、PAL、PR10顯著上調(diào)表達。其中：PR10在接種Vd080 孢子懸浮液后48 h 表達量最高， 是對照的1.5 倍；PAL和POD在接種Vd080 孢子懸浮液后24 h 表達量最高，分別是對照的2.09 倍、1.94 倍。

圖5 CEF-818 誘導棉花防御相關(guān)基因的表達檢測結(jié)果Fig. 5 Expression detection of defense-related genes induced by CEF-818 inoculation in cotton

2.8 菌株CEF-818 對Vd080 在棉花中定植的影響

棉苗根部的Vd080 定植量檢測結(jié)果 （圖6）顯示， 對照組中Vd080 的定植量顯著高于處理組，是處理組的3.61 倍，表明CEF-818 能夠抑制Vd080 對棉苗的侵染，從而減少Vd080 在棉苗中的定植量。

圖6 接種后4 d 棉花根部Vd080 的定植量Fig. 6 Colonization level of Vd080 in cotton root at 4 d after its inoculation

3 討論

利用有益微生物和微生物代謝產(chǎn)物有效地預防和控制植物病害，具有防治成本低、不易產(chǎn)生抗性、資源豐富、環(huán)保安全的特點[17]。目前，對棉花黃萎病的拮抗微生物防治研究較多的是芽孢桿菌 （Bacillusspp.）、 假單胞菌（Pseudomonas）和木霉（Trichodermaspp.）等[18]，Zabihullah 等[19]在冀棉11 中分離到1 株解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）489-2-2 可抑制Vd080 菌 絲的生長， 對棉花黃萎病的溫室防治效果可達60.31%；宋曉妍等[20]篩選到木霉菌株SMF5 可分泌細胞壁降解酶， 對棉花黃萎病具有強抑制作用。 本研究以從健康的棉花中分離得到的簡青霉CEF-818 為研究對象，分析其對棉花黃萎病的防治效果。 目前，棉花內(nèi)生真菌簡青霉在棉花黃萎病防治應(yīng)用中的報道較少，Li 等[21]研究發(fā)現(xiàn)多種大麗輪枝菌拮抗真菌，其中對棉花黃萎病具有防治效果的生防真菌包括簡青霉CEF-818，但其作用機理尚未明確。將簡青霉CEF-818 利用固體發(fā)酵方式制成微生物菌劑應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中還未見有報道，因此，本研究具有現(xiàn)實研究意義。

本研究室內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)，CEF-818 非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對Vd080 菌絲生長的抑制率為100.00%，揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對Vd080 菌絲生長的抑制率為58.10%。關(guān)于微生物揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對病原菌的抑制作用已有較多報道，這些揮發(fā)性物質(zhì)可作為抗生素直接抑制病原菌菌絲的生長[22-23]；但只有當揮發(fā)性物質(zhì)含量足夠高時，才能對病原菌產(chǎn)生拮抗作用，在實際生產(chǎn)應(yīng)用中很難實現(xiàn)[24]。 因此，在后續(xù)的研究中， 需要進一步探明CEF-818 抑菌物質(zhì)的主要成分， 為該菌株的合理利用提供依據(jù)。

在溫室和大田環(huán)境條件下，CEF-818 固體菌劑基質(zhì)處理對棉花黃萎病的防治效果分別為69.77%和63.73%。 植物內(nèi)生真菌在健康植物組織中的存活，受諸多外界環(huán)境因子的影響，如溫度、雨水、光照等[25]。因此，推測可能是受外界較多的不可控因素影響，將其作為微生物菌劑應(yīng)用到棉花大田時抑菌活性和入侵植物的能力可能會降低，從而對其田間防治效果造成影響。 這也是CEF-818 作為微生物菌劑在研發(fā)應(yīng)用上需要攻克的難題之一。

生防的機理包括抗生素效應(yīng)、重寄生、競爭、捕食、交叉保護和誘導抗病性等[15]，目前關(guān)于CEF-818 對病原菌的作用機理研究較少。 本研究采用的CEF-818 為簡青霉真菌， 在PDA 平板培養(yǎng)基中的生長速率比大麗輪枝菌菌株快； 因此，初步推測，在溫室和田間預接種CEF-818 固體菌劑后，在大麗輪枝菌侵染棉花植株之前，CEF-818可能會迅速占領(lǐng)棉苗根部的位點，阻礙大麗輪枝菌的入侵，從而降低棉花黃萎病的發(fā)病率。 此外，生防菌防治植物病害可誘導植物產(chǎn)生抗病性，從而增強植物對病原菌的抗性；活性氧作為一種信號分子，在誘導植物抗病性檢測中具有重要作用[26]。 本研究中，接種CEF-818 固體菌劑可誘導棉花葉片中活性氧爆發(fā)和胼胝質(zhì)積累，還能夠誘導棉花植株中防御相關(guān)基因POD、PAL和PR10的上調(diào)表達。 其中：PAL編碼苯丙氨酸代謝途徑第一個酶、限速酶，也是第一個被鑒定的植物“防御基因”[27-28]；POD基因的編碼產(chǎn)物參與木質(zhì)素的合成， 而木質(zhì)素是維管組織細胞壁的主要成分，是抵抗病原菌侵入和擴展的重要防衛(wèi)物質(zhì)[29]；PR10基因編碼的植物病程相關(guān)蛋白在植物生長發(fā)育階段和應(yīng)激外界逆境環(huán)境時發(fā)揮重要作用[30]。綜上，CEF-818 能夠誘導植物對黃萎病的抗性，但本研究僅初步探索了相關(guān)機理，對其更深層次的防御機理及相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導途徑還待進一步研究。

4 結(jié)論

棉花內(nèi)生真菌簡青霉CEF-818 的非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物和揮發(fā)性代謝產(chǎn)物均能夠有效抑制大麗輪枝菌Vd080 菌絲的生長，CEF-818 固體菌劑對棉花黃萎病的溫室和田間防治效果分別為69.77%和63.73%； 此外，CEF-818 可誘導棉花葉片活性氧爆發(fā)和胼胝質(zhì)的積累，還可誘導防御相關(guān)基因PAL、POD和PR10的上調(diào)表達， 并可抑制大麗輪枝菌在棉苗中的定植。 因此，CEF-818主要通過直接抑制病原菌的生長和誘導植物產(chǎn)生抗性，來達到防治棉花黃萎病的目的。 本研究結(jié)果還表明，CEF-818 對棉花黃萎病有顯著的防治效果， 具有開發(fā)成防治棉花黃萎病菌劑的價值。