陸地棉株高相關(guān)基因GhGA20ox6 的克隆及功能初探

楊炳磊，許好標(biāo)，李黎貝，馮震，劉林，喻樹迅,4*

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，杭州 311300；2. 浙江農(nóng)林大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院，杭州 311300；3.江蘇聯(lián)發(fā)紡織股份有限公司，江蘇南通 226000；4.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，河南安陽 455000）

赤霉素（Gibberellin，GA）作為植物六大激素之一，是一類四環(huán)雙萜類植物激素，在植物的種子萌發(fā)、根冠伸長(zhǎng)、莖伸長(zhǎng)、葉片生長(zhǎng)、開花結(jié)果等過程中都發(fā)揮重要作用[1-2]。 在高等植物中，多種酶參與了多步驟酶促反應(yīng)的赤霉素生物合成和代謝過程，調(diào)控這些酶的編碼基因能有效地調(diào)節(jié)赤霉素的合成代謝速率。 參與赤霉素合成代謝的酶有很多種， 其中GA2-氧化酶（GA2-oxidase,GA2ox）是植物GA 降解過程中的關(guān)鍵酶，可以將植物體內(nèi)具有活性的GA、GA 前體及其中間產(chǎn)物分解失活，從而維持植物體內(nèi)活性GA 的動(dòng)態(tài)平衡[3-4]。GA3-氧化酶（GA3-oxidase,GA3ox）和GA20- 氧化酶（GA20-oxidase,GA20ox）作為植物活性赤霉素合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶，催化GA12和GA53轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘腉A1和GA4。 此外，GA3ox 和GA20ox 還受體內(nèi)活性GA 的負(fù)反饋調(diào)節(jié)[5-7]。 在植物體內(nèi)活性GA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中，赤霉素不敏感矮化基因GID1（gibberellin insensitive dwarf 1） 編碼赤霉素受體， 與赤霉素結(jié)合使DELLA 蛋白聚集到SCFSLY1復(fù)合物上， 從而使DELLA 蛋白被泛素化降解， 激活下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[8]。

植物赤霉素氧化酶家族屬于2OG-Fe（Ⅱ）氧化酶亞家族[9-10]。 目前，對(duì)模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana） 赤霉素合成與代謝通路的研究已經(jīng)比較深入，赤霉素代謝途徑的相關(guān)基因已經(jīng)被克隆鑒定[11-12]。 前人的研究表明，農(nóng)作物綠色革命與赤霉素代謝途徑的相關(guān)基因密切相關(guān)[13]。 在植物中，赤霉素能促進(jìn)莖的伸長(zhǎng)和植株增高。 在水稻中，沉默GA20ox 相關(guān)基因會(huì)影響水稻的莖稈長(zhǎng)度，導(dǎo)致水稻出現(xiàn)矮化表型[14]。 Plackett 等[15]在擬南芥沉默GA20ox1、GA20ox2和GA20ox3，發(fā)現(xiàn)植株出現(xiàn)矮化現(xiàn)象， 生長(zhǎng)發(fā)育受到影響。Mauriat 等[16]通過增強(qiáng)山楊幼苗赤霉素相關(guān)基因PttGID1.1和PttGID1.3的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)這些基因可以促進(jìn)幼苗體內(nèi)的活性赤霉素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而促進(jìn)山楊莖的伸長(zhǎng)。 Boonkaew 等[17]對(duì)高、矮椰子樹（Cocos nuciferaL.）中GA20ox同源基因CnGA20ox1和CnGA20ox2的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在不同株高的植株中GA20ox基因表達(dá)量存在顯著差異， 推斷GA20ox基因影響植株高度。目前，在蘋果[18]、荔波連蕊茶[19]、黃瓜[20]、大豆[21]等物種中也有關(guān)于赤霉素氧化酶基因的報(bào)道，表明GA20ox基因?qū)χ参锏纳L(zhǎng)發(fā)育存在重要的影響。

株高是作物育種和栽培管理中重要的目標(biāo)農(nóng)藝性狀之一。 植株過高易倒伏，從而使作物的產(chǎn)量降低； 適當(dāng)矮化的植株有較強(qiáng)的抗倒伏能力，可提高作物群體的光能利用率，從而提高作物產(chǎn)量[22-24]。 陸地棉（Gossypium hirsutumL.）包含A、D 兩個(gè)亞基因組，基因組序列已被公布[25-26]，可以利用生物信息學(xué)方法來分析陸地棉基因的功能。 目前研究發(fā)現(xiàn)，棉花GA20ox相關(guān)基因能促進(jìn)體內(nèi)活性赤霉素GA 的生成，可調(diào)節(jié)棉花耐鹽和耐旱性，并且調(diào)控纖維的起始和伸長(zhǎng)[27-29]，但對(duì)其在棉花株高發(fā)育中的作用的研究存在空缺。 因此，從分子水平上研究GA20ox 對(duì)陸地棉株高的影響具有重要的意義。 本研究從陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1 中克隆到1 個(gè)株高相關(guān)的基因GhGA20ox6，檢測(cè)其在陸地棉不同組織中的表達(dá)量，通過亞細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)基因擬南芥表型鑒定，初步分析其在棉花生長(zhǎng)發(fā)育中的分子功能以及表達(dá)模式，為今后對(duì)該基因的功能研究及利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理方式

陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1 種植于浙江農(nóng)林大學(xué)平山基地（杭州市臨安區(qū)），選取根、莖、葉、頂芽、萼片、開花后30 d 的胚珠、花、雄蕊和雌蕊進(jìn)行GhGA20ox6的組織特異性表達(dá)分析。

選用本氏煙 （Nicotiana benthamiana） 進(jìn)行GhGA20ox6基因的瞬時(shí)表達(dá)分析， 材料種植于浙江農(nóng)林大學(xué)人工氣候室，環(huán)境條件：光照16 h/黑暗8 h，溫度22 ℃，相對(duì)濕度為50%。

利用哥倫比亞型擬南芥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，材料種植于浙江農(nóng)林大學(xué)人工氣候室，氣候室條件設(shè)置：溫度25 ℃，光照16 h/ 黑暗8 h，相對(duì)濕度為50%。

1.2 載體與所用試劑

轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pBI121、pBINGFP4 保存于本實(shí)驗(yàn)室。 從上海唯地生物有限公司購(gòu)入大腸桿菌DH5α 感受態(tài)和農(nóng)桿菌 （Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101 感受態(tài)。RNA 提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公 司。 載 體pMD18-T、MightyAmp 高 保 真 酶、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA 片段純化試劑盒和熒光試劑TB GreenPremix Ex TaqTMII 購(gòu) 于Takara 公 司（中國(guó)大連）。 從上海源葉生物科技有限公司購(gòu)入2- 嗎啉乙磺酸、 乙酰丁香酮和1/2 MS 固體培養(yǎng)基，引物的合成及基因測(cè)序由杭州有康生物科技有限公司完成。 本研究所用引物序列見表1。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.3 RNA 的提取及cDNA 的合成

使用RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取1.1 中陸地棉TM-1 樣品的RNA，通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。

1.4 陸地棉GhGA20ox6 基因的克隆

利用已公布的擬南芥和水稻GA20ox 的蛋白序列作為參照，從CottonFGD（https://cottonfgd.org/）下載陸地棉全基因組數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建本地Blast 數(shù)據(jù)庫，搜索得到13 個(gè)候選基因；根據(jù)已公布的陸地棉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫分析得到在莖中表達(dá)量較高的GhGA20ox6基因， 通過GhGA20ox6-F和GhGA20ox6-R 這對(duì)引物， 從TM-1 莖中擴(kuò)增GhGA20ox6的編碼序列， 將得到的片段連接到pMD18-T 載體， 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α， 保存測(cè)序正確的單克隆菌液以供后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.5 GhGA20ox6 的生物信息學(xué)分析

利用MEGA 5.0 軟件，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[30]，自展值設(shè)為1 000，其他參數(shù)為默認(rèn)值。利用ExPASy[31]（https://web.expasy.org/protparam/）在線分析網(wǎng)站預(yù)測(cè)GhGA20ox6 蛋白的理化性質(zhì)，包括蛋白質(zhì)序列的長(zhǎng)度、等電點(diǎn)以及分子質(zhì)量。 將目的基因編碼的氨基酸序列利用DNA MAN 進(jìn)行序列比對(duì)分析。 利用SMART 在線網(wǎng)站（https://smart.embl-heidelberg.de/）預(yù)測(cè)GhGA20ox6 的保守結(jié)構(gòu)域。

1.6 GhGA20ox6 的表達(dá)分析

1.7 GhGA20ox6 蛋白的亞細(xì)胞定位

利用引物GhGA20ox6-SF 和GhGA20ox6-SR 將目的基因片段連接到帶有綠色熒光蛋白（green fluorescence protein,GFP）基因的載體上，將構(gòu)建好的過表達(dá)載體35S::GhGA20ox6-GFP轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101。 根據(jù)本氏煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法[32]，將農(nóng)桿菌菌液注射到培養(yǎng)20 d 的煙草葉片中，然后在黑暗條件下培養(yǎng)24 h，恢復(fù)光照繼續(xù)培養(yǎng)48 h，在LSM880 共聚焦顯微鏡（蔡司公司，德國(guó)）下觀察煙草葉片細(xì)胞中的GFP 信號(hào)[33]。

1.8 轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株篩選

將1.7 中的GV3101 農(nóng)桿菌菌液在28 ℃下培養(yǎng)至600 nm 處的吸光值（OD600）為1.2～1.6，5 000 r·min－1離心10 min 收集菌體，利用0.02%（體積分?jǐn)?shù)） 的Silwet-77 滲透液重懸至OD600為0.9，通過農(nóng)桿菌蘸花法[34]侵染去掉結(jié)莢角果的擬南芥45～60 s，暗處理培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)擬南芥至成熟，收獲T0種子。 在超凈工作臺(tái)中，將種子種植于含有卡那霉素的1/2 MS 固體培養(yǎng)基上，放置于4 ℃培養(yǎng)箱春化48 h，然后取出放置于人工氣候室（光照16 h/ 黑暗8 h），保證擬南芥正常生長(zhǎng)，待到長(zhǎng)出真葉后移栽到土壤。 生長(zhǎng)2 周后提取DNA 檢測(cè)陽性植株。重復(fù)上述種植操作，直至篩選到T3純合單株， 選擇3 個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因株系L1、L2 和L3， 移苗后18 d 和30 d 對(duì)這3 個(gè)株系進(jìn)行表型鑒定。 移苗后18 d，取轉(zhuǎn)基因擬南芥莖部用于檢測(cè)分析GhGA20ox6下游基因GID1a、GID1b和GID1c的表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhGA20ox6 基因的序列分析

GhGA20ox6位于D 亞組9 號(hào)染色體上，開放閱讀框長(zhǎng)度為1 155 bp， 編碼384 個(gè)氨基酸殘基，包括2 個(gè)內(nèi)含子和3 個(gè)外顯子。 GhGA20ox6蛋白包含1 個(gè)DIOX_N 結(jié)構(gòu)域（位于第63～172氨基酸）和1 個(gè)2OG-Fe（Ⅱ）氧化酶結(jié)構(gòu)域（位于第228～323 氨基酸，圖1）。利用ExPASy 在線軟件預(yù)測(cè)GhGA20ox6 蛋白的分子質(zhì)量為42.32 ku，等電點(diǎn)為6.37。 篩選鑒定出13 個(gè)陸地棉GhGA20ox基因，系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)GhGA20ox6與GhGA20ox5、GhGA20ox8、GhGA20ox13所編碼的氨基酸序列具有較高相似性，位于同一個(gè)分支上（圖2）。對(duì)這13 個(gè)候選基因編碼的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，其編碼產(chǎn)物均有與GA 底物結(jié)合的高度保守基序LPWKET，其中7 個(gè)編碼產(chǎn)物有與結(jié)合2- 酮戊二酸相關(guān)的保守基序NYYPXCQKP（圖3）[35]。

圖1 GhGA20ox6 結(jié)構(gòu)域分析Fig. 1 Conserved domains of GhGA20ox6

圖2 陸地棉、水稻和擬南芥GA20ox 的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of GA20ox in upland cotton, rice and A. thaliana

圖3 13 個(gè)陸地棉GA20ox 的氨基酸序列比對(duì)分析Fig. 3 The amino acid sequences alignment of 13 GA20ox in upland cotton

2.2 GhGA20ox6 基因的空間表達(dá)模式分析

進(jìn)一步研究GhGA20ox6的組織表達(dá)特異性發(fā)現(xiàn)，GhGA20ox6在莖中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，而在胚珠與花中的表達(dá)量較低（圖4），據(jù)此推測(cè)GhGA20ox6在莖的生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮功能。

圖4 GhGA20ox6 基因在陸地棉不同器官中的相對(duì)表達(dá)量Fig. 4 Relative expression levels of GhGA20ox6 in different organs in upland cotton

2.3 GhGA20ox6 蛋白亞細(xì)胞定位分析

在WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）在線軟件上進(jìn)行GhGA20ox6 蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示其定位在細(xì)胞膜。 在本氏煙葉片細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)GhGA20ox6 與GFP （綠色熒光蛋白，green fluorescent protein）融合蛋白，結(jié)果顯示僅細(xì)胞膜有明亮的綠色分布（圖5 A～C），而單獨(dú)表達(dá)GFP 蛋白的細(xì)胞中綠色熒光在細(xì)胞膜與細(xì)胞核均有分布（圖5 D～F），表明GhGA20ox6 蛋白是1個(gè)膜定位蛋白。

圖5 GhGA20ox6 在本氏煙中的亞細(xì)胞定位Fig. 5 Subcellular localization of GhGA20ox6 in N. benthamiana

2.4 GhGA20ox6 基因在擬南芥中的功能驗(yàn)證

同時(shí)種植野生型和3 個(gè)T3轉(zhuǎn)基因擬南芥株系（每個(gè)株系各50 株），發(fā)現(xiàn)野生型擬南芥在移苗后22 d 開始抽薹， 平均抽薹時(shí)間為移苗后25 d； 轉(zhuǎn)GhGA20ox6基因擬南芥在移苗后18 d開始抽薹，平均抽薹時(shí)間為移苗后20 d，早于野生型（圖6 和表2）。 轉(zhuǎn)GhGA20ox6基因擬南芥株系的平均株高約為31 cm， 極顯著高于野生型擬南芥（24 cm），蓮座葉數(shù)量也極顯著增加（表2）。GhGA20ox6和GID1基因在莖中的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果（圖7）顯示：轉(zhuǎn)基因擬南芥中的GhGA20ox6高水平表達(dá)，符合35S 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因轉(zhuǎn)入的情況；相對(duì)于野生型，轉(zhuǎn)基因擬南芥中GID1a、GID1b、GID1c基因的表達(dá)量也均極顯著上升。說明GhGA20ox6基因可增強(qiáng)GID1基因的表達(dá)，促進(jìn)莖的生長(zhǎng)。

圖6 野生型擬南芥和轉(zhuǎn)GhGA20ox6 基因擬南芥的表型Fig. 6 Phenotypes of wild type and transgenic%Arabidopsis

圖7 轉(zhuǎn)基因擬南芥中GhGA20ox6 和GID1 基因的表達(dá)水平Fig. 7 Expression level of GhGA20ox6 and GID1%genes in transgenic Arabidopsis%lines

表2 野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥相關(guān)表型Table 2 Phenotypes of wild type and transgenic plants

3 討論

GA20ox 對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)性起著重要的作用，是植物體內(nèi)活性赤霉素合成的關(guān)鍵酶。 GA20ox 具有2OG-Fe（Ⅱ）氧化酶結(jié)構(gòu)域，屬于2OG-Fe（Ⅱ）雙加氧酶[36]。 GA20ox 在赤霉素合成的第三階段發(fā)揮作用，催化C20-GA 分子生成C19-GA 分子， 經(jīng)過13- 羥基化以及13- 非羥基化這2 個(gè)途徑生成GA5和GA12， 然后通過赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育[37]。目前，在白毛楊[38]、水稻[14]等物種中關(guān)于過表達(dá)GA20ox使轉(zhuǎn)基因植株變高的研究較多，表明GA20ox 能促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)以及莖的生長(zhǎng)。

擬南芥ga5突變體由于缺失AtGA20ox基因出現(xiàn)半矮化的表型[39]。 過表達(dá)AtGA20ox基因可以提高擬南芥中活性赤霉素的含量， 使植株變高、開花提前[40]。 Monna 等[41]通過圖位克隆方法，發(fā)現(xiàn)水稻半矮化基因（semi-dwarfing gene）sd1（OsGA20ox2）編碼GA20ox，水稻sd1突 變 體 呈現(xiàn)矮化表型。GhGA20ox6基因與OsGA20ox2基因的同源性較高， 推測(cè)可能行使相同的功能。本研究通過從陸地棉材料TM-1 中克隆得到1 個(gè)赤霉素氧化酶基因GhGA20ox6， 利用本地blast找到13 個(gè)GA20ox基因，經(jīng)過多重序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)GhGA20ox6 蛋白序列具有與GA 底物結(jié)合的高度保守基序、與結(jié)合2-酮戊二酸有關(guān)的保守序列， 并且GhGA20ox6基因在TM-1 不同器官中的表達(dá)量差異較明顯，在莖中表達(dá)量較高，推測(cè)GhGA20ox6基因主要在莖中發(fā)揮功能。

目前，GA20ox基因?qū)w維生長(zhǎng)發(fā)育的影響研究報(bào)道較多，GhGA20ox1的過表達(dá)能促進(jìn)棉花體內(nèi)赤霉素的合成，影響赤霉素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，進(jìn)而促進(jìn)棉花纖維的伸長(zhǎng)，對(duì)纖維的品質(zhì)改良有現(xiàn)實(shí)意義。 Xiao 等[42]通過測(cè)定陸地棉突變體中GhGA20ox1以及GhGA20ox2的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，其在胚珠中的表達(dá)量較高，推測(cè)這2 個(gè)基因影響纖維發(fā)育的起始階段。 López-Cristoffanini 等[43]研究水稻ga20ox突變體發(fā)現(xiàn)， 突變體節(jié)間的活性GA 水平明顯低于正常型，導(dǎo)致節(jié)間長(zhǎng)度縮短。棉花GA20ox基因?qū)γ藁ㄖ旮咝誀畹膬?nèi)在機(jī)理尚不明確，為進(jìn)一步探究GhGA2ox6對(duì)陸地棉生長(zhǎng)的影響，本研究通過轉(zhuǎn)基因擬南芥試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)GhGA20ox6表達(dá)量的上升， 導(dǎo)致下游赤霉素受體基因GID1的表達(dá)量也上升， 株高增加， 推測(cè)GhGA20ox6參與棉花莖的生長(zhǎng)發(fā)育，影響株高，為進(jìn)一步研究赤霉素調(diào)控棉花株高提供了初步依據(jù)。

4 結(jié)論

從陸地棉材料TM-1 莖中克隆得到Gh-GA20ox6，編碼產(chǎn)物定位于細(xì)胞膜，在TM-1 莖中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，異源過表達(dá)該基因能顯著提高擬南芥株高。GhGA20ox6還能促進(jìn)轉(zhuǎn)基因擬南芥中赤霉素受體基因GID1的表達(dá)， 推測(cè)GhGA20ox6對(duì)株高性狀具有重要作用。 至于赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑如何調(diào)控植物株高的分子機(jī)制，有待于進(jìn)一步研究。