黃化對牡丹枝條解剖結(jié)構(gòu)及不定根發(fā)生的影響

解夢雨，徐 珂，王心怡，汪 琦，孫 悅，袁 濤

（北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點試驗室，國家花卉工程技術(shù)研究中心，城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京試驗室，園林環(huán)境教育工程研究中心，林木花卉遺傳育種教育部重點試驗室，北京 100083）

牡丹(Paeonia sect.Moutan)為芍藥科(Paeonia‐ceae)芍藥屬(Paeonia)牡丹組植物統(tǒng)稱，是我國的傳統(tǒng)名花，全國各地均有栽培。牡丹花朵碩大、色彩艷麗，代表著百姓心中對美好和幸福生活的向往，因而廣泛栽植于園林中用于觀賞，此外還可用于食用、藥用。

目前牡丹常見的育苗方式中，播種主要用于油用、藥用和砧木育苗，觀賞品種多采用無性繁殖，但牡丹嫁接、分株和壓條的繁殖系數(shù)較小，扦插繁殖的生根率較低，市場上新、優(yōu)品種苗木供不應(yīng)求，也極大地限制了其推廣應(yīng)用。

提高壓條和扦插生根率、生根質(zhì)量的研究主要集中在土壤基質(zhì)選擇、生長調(diào)節(jié)劑以及枝條處理等，這些技術(shù)的促根作用在中華金葉榆(Ulmus pumila)、茶樹(Camellia sinensis)、玫瑰(Rosa rugosa)和衛(wèi)矛(Euonymus alatus)等很多木本植物均較為明顯[1-4]。枝條黃化處理是植物繁殖的一項古老技藝，可有效提高核桃(Juglans regia)、榛(Corylus hetero?phylla)和蘋果(Malus pumila)等木本植物的生根率[5-7]。黃化是植株或植株部分在完全沒有光照的情況下生長發(fā)育的過程[8]，常見的操作方式有在枝條上貼黑膠等遮光物局部黃化、枝條基部堆土的自然黃化或?qū)⒄曛仓曛糜诤诎抵谐榘l(fā)新梢從而獲得黃化的枝條等[9-11]。黃化處理的枝條會出現(xiàn)厚壁組織不發(fā)達、枝條木質(zhì)化程度降低等變化，在四倍體 刺 槐 (Robinia pseudoacacia)、黃 櫨 (Cotinus cog?gygria)中均觀察到該現(xiàn)象[12-13]，但其促進生根的機制仍缺乏深入研究，且黃化處理對牡丹枝條解剖結(jié)構(gòu)以及不定根生根的影響也研究較少。

本文對2個牡丹品種‘洛陽紅’‘黃金翠’的當(dāng)年生枝條基部覆土黃化后，結(jié)合枝條環(huán)剝和IBA(in‐dole-3-butyric acid，吲哚丁酸)處理，探究黃化處理對牡丹枝條解剖結(jié)構(gòu)、不定根生根率和根系質(zhì)量的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試材為牡丹品種‘洛陽紅’和‘黃金翠’，2019年秋季購于菏澤艷裝牡丹科技開發(fā)有限公司。株齡4年，植于北京市昌平區(qū)白浮村。2020年秋季平茬，僅保留枝條基部1～2個芽。2021年春季，平茬處理的母株從基部萌發(fā)新枝，正常養(yǎng)護管理及病蟲害防治，選取莖粗和高度較為一致的健壯、無病蟲害當(dāng)年生枝條用于試驗。

1.2 試驗方法

采用多因素隨機區(qū)組試驗，共4個處理，每個處理重復(fù)3次，每個重復(fù)15個枝條。

枝條處理：2021年4月10日，在‘洛陽紅’‘黃金翠’新枝基部覆土，厚度8～10 cm，確保枝條基部遮光以自然黃化，以此為黃化處理；枝條基部不覆土為對照處理。2021年6月3日即黃化處理50 d后，對黃化處理和對照枝條進行如下處理：在距離枝條基部2～4 cm處，繞枝條環(huán)剝周長的2/3，環(huán)剝寬度為1 cm。環(huán)剝后，在傷口部位涂抹500 mg/L的IBA溶液，處理完畢后所有試驗枝條覆土8～10 cm。

枝條處理部位形態(tài)與解剖結(jié)構(gòu)觀察：分別于2021年4月20日、5月12日以及6月2日，拍照記錄‘洛陽紅’‘黃金翠’枝條處理部位形態(tài)并取樣。取樣時，剪取距離枝條基部2～4 cm處的莖段，每次各處理剪取3個。將樣品迅速拿回實驗室切割為長0.5 cm的莖段，保存至FAA溶液(90 mL 50%酒精；5 mL 38%甲醛；5 mL冰醋酸；5 mL甘油)，48小時后放入甘油FAA混合液(50 mL甘油；50 mL FAA)中保存60 d，石蠟切片法制片。切片機(RM2235，徠卡)切片，切片厚度為12～14μm，番紅-固綠(麥克林)染色，中性樹膠封片，在SOPTOP光學(xué)顯微鏡(40×，OD400UHW-P)下觀察、拍照。

1.3 田間管理與指標(biāo)測定

定期檢查以保證枝條基部覆土厚度，常規(guī)水肥及除草、松土管理。2021年9月27日，除去枝條基部的覆土，統(tǒng)計一級根、二級根（圖3所示）數(shù)量，測量一級根根長、根直徑等指標(biāo)并計算每一級根上二級根平均數(shù)量，將這5個指標(biāo)視為根系質(zhì)量。計算生根率，包括一級根生根率(生根枝條數(shù)量/處理枝條總數(shù)量)、二級根生根率(二級根生根枝條數(shù)量/處理枝條總數(shù)量)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2019和SPSS 22進行整理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枝條外觀形態(tài)

5月12日觀察到‘洛陽紅’‘黃金翠’黃化處理部位的枝條顏色偏白、莖皮肉質(zhì)(圖1，D)；20 d后，黃化處理部位的顏色轉(zhuǎn)為近黑褐色、紅褐色(圖1，B、F)，黃化部位的節(jié)間長度相比對照部位的枝條明顯變長(圖1，E、F)，且在部分‘洛陽紅’黃化枝條基部觀察到不定根(圖1，C)。對照枝條始終偏綠色，莖皮未肉質(zhì)化，也未觀察到不定根(圖1，A、E)。

圖1 黃化處理的‘洛陽紅’‘黃金翠’枝條外觀Figure 1 Etiolation-treated shoots appearance of′Luoyang Hong′and ′Huangjin Cui′

2.2 枝條解剖結(jié)構(gòu)

‘洛陽紅’‘黃金翠’枝條的橫切面由表皮、皮層和維管柱3部分組成(圖2)。最外層表皮細(xì)胞呈長方形且排列緊密。表皮以內(nèi)維管柱以外為皮層，靠近表皮的數(shù)層細(xì)胞為厚角組織，向內(nèi)為薄壁組織。牡丹枝條次生生長后，木栓層發(fā)生于皮層以內(nèi)靠近韌皮部的區(qū)域，木栓層細(xì)胞栓質(zhì)化后為死細(xì)胞，沒有胞間隙。維管柱由外向內(nèi)分別為韌皮部、維管形成層、木質(zhì)部和髓。

圖2 黃化處理的‘洛陽紅’‘黃金翠’枝條解剖結(jié)構(gòu)(40×)Figure 2 Etiolation-treated shoots anatomical structure of′Luoyang Hong′and ′Huangjin Cui′(40×)

處理10 d后，枝條黃化部位的皮層細(xì)胞中的細(xì)胞核逐漸消失，但仍可見部分皮層細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核，此時枝條木質(zhì)化程度較低；對照和黃化部位差異較小(圖2，A、B、C、D)。

處理30 d后，枝條黃化部位的皮層細(xì)胞中細(xì)胞核基本消失，厚角組織發(fā)育明顯，木栓層細(xì)胞發(fā)育明顯約2～3層；木質(zhì)部加厚且染色逐漸變深(圖2，E、F、G、H)；此時與對照枝條開始呈現(xiàn)差異，黃化部位的韌皮部增厚明顯(圖2，F(xiàn)、H)。

處理50 d后，黃化部位和對照枝條的解剖結(jié)構(gòu)差異已非常明顯。對照枝條木栓層外的皮層較厚，表皮和皮層細(xì)胞呈現(xiàn)較完整的狀態(tài)，厚角組織細(xì)胞壁再次增厚，木栓層細(xì)胞約5～6層，木栓層細(xì)胞栓質(zhì)化嚴(yán)重且晶狀簇體積累明顯(圖2，I、K)。黃化部位木栓層外的皮層細(xì)胞變得松散，連同表皮與木栓層有分離跡象，近脫落，木栓層細(xì)胞約6～7層，整齊地平行圓周排列，木栓層細(xì)胞栓質(zhì)化較輕且晶狀簇體積累不明顯；木栓層內(nèi)的皮層細(xì)胞排列疏松、細(xì)胞間隙較大、薄壁細(xì)胞增多(圖2，J、L)。此時在‘黃金翠’枝條的黃化部位中觀察到不定根，不定根起源于維管形成層且已經(jīng)突破表皮(圖2，M)。

‘洛陽紅’與‘黃金翠’的枝條解剖結(jié)構(gòu)差異始終較?。辉邳S化處理50 d后，‘洛陽紅’和‘黃金翠’對照枝條的木栓層內(nèi)皮層厚度約為175、200μm，薄于黃化部位的375、350 μm；‘洛陽紅’和‘黃金翠’對照枝條的韌皮部厚度約為150、175μm，薄于黃化部位的350、300μm；木質(zhì)部厚度分別約為600、650 μm，薄于黃化部位中的 750、800 μm(圖 2，I、K、J、L)。

2.3 不定根發(fā)生情況

枝條經(jīng)環(huán)剝和500 mg/LIBA處理后約115 d，2個品種的不定根發(fā)生情況如下：

由表1，經(jīng)黃化處理的‘洛陽紅’和‘黃金翠’枝條的生根指標(biāo)均優(yōu)于對照枝條，生根率明顯提高，其中‘黃金翠’的一級根生根率為97.8%；2個品種的一級根平均數(shù)量、二級根平均數(shù)量、每一級根上二級根平均數(shù)量、一級根平均根長和根直徑比對照也相應(yīng)提高，其中黃化處理的‘洛陽紅’枝條的一級根平均根長和根直徑分別為11.04 cm、1.93 mm，顯著高于對照枝條。

表1 黃化處理對‘洛陽紅’‘黃金翠’不定根發(fā)生的影響Table 1 The effect of etiolation treatment on adventitious rooting of′Luoyang Hong′and ′Huangjin Cui′

‘洛陽紅’和‘黃金翠’枝條生根表現(xiàn)差異明顯，‘黃金翠’不論是否黃化處理，生根指標(biāo)均優(yōu)于‘洛陽紅’?！S金翠’黃化枝條的一級根生根率、二級根生根率、一級根平均數(shù)量、二級根平均數(shù)量、每一級根上二級根平均數(shù)量、一級根平均根長和根直徑在2個品種的各處理中均表現(xiàn)為最佳(圖3)。

圖3 ‘洛陽紅’‘黃金翠’枝條生根Figure 3 Rooted shoots of′Luoyang Hong′and′Huangjin Cui′

3 討論

本試驗中，2個牡丹品種黃化處理部位的枝條形態(tài)變化明顯，莖皮肉質(zhì)化、節(jié)間變長，與黃櫨(Coti?nus coggygria)、柚木(Tectona grandis)等植物枝條經(jīng)黃化處理后呈現(xiàn)的外部形態(tài)變化類似[13-14]。然而2個牡丹品種黃化部位的莖干顏色先偏白色、黃化處理50 d后加深為近黑褐色、紅褐色，還未見其他植物中有類似的報道，這一現(xiàn)象是否有普遍性及其誘發(fā)原因，尚需進一步研究。

黃化處理后的枝條解剖結(jié)構(gòu)出現(xiàn)厚壁組織發(fā)育減慢、皮層增厚、薄壁細(xì)胞增多以及木栓層發(fā)育延遲等現(xiàn)象[13,15-16]，L.A.Biasi[17]認(rèn)為上述解剖結(jié)構(gòu)變化有利于枝條上不定根發(fā)生。本試驗中，‘洛陽紅’和‘黃金翠’枝條黃化部位與對照相比，木栓層外組織松散、木栓層發(fā)育延遲、木栓層內(nèi)皮層增厚以及皮層細(xì)胞疏松且薄壁細(xì)胞增多，枝條木質(zhì)化程度降低，黃化作用使組織保持幼嫩性從而有利于根原基的分化和生長[18]。試驗中，首先在‘洛陽紅’和‘黃金翠’黃化枝條上觀察到不定根，黃化處理啟動了根原基發(fā)生，縮短了生根時間。從黃化處理50 d后的解剖結(jié)構(gòu)看，處理部位的木質(zhì)部和韌皮部更厚，推測維管形成層細(xì)胞在黃化處理后更加活躍，故而向外產(chǎn)生了更多韌皮部，向內(nèi)產(chǎn)生更多木質(zhì)部細(xì)胞，維管形成層正是‘黃金翠’不定根發(fā)生部位，因此維管形成層活躍更有利于不定根的發(fā)生。朱耀軍[19]認(rèn)為牡丹的不定根與莖的維管連接發(fā)生在根原基自維管形成層形成后穿入皮層時間前后，皮層中薄壁細(xì)胞參與維管橋的形成，因此認(rèn)為該試驗中發(fā)現(xiàn)的木栓層內(nèi)的皮層薄壁細(xì)胞增多可以為不定根發(fā)端提供良好環(huán)境。黃化處理部位的木栓層栓質(zhì)化程度較輕，木栓層外組織松散，可減小不定根突破皮層的阻力。本試驗發(fā)現(xiàn)，盡管‘黃金翠’和‘洛陽紅’的解剖結(jié)構(gòu)近似，然而‘黃金翠’不論是否黃化，生根率和生根質(zhì)量始終優(yōu)于‘洛陽紅’，由此認(rèn)為本試驗中2個牡丹品種間的生根難易與其枝條解剖結(jié)構(gòu)相關(guān)不大，今后可深入研究牡丹無性繁殖過程中生根的影響因子。

黃化處理促進植物內(nèi)源生長素運輸及外源生長素的吸收轉(zhuǎn)化，有利于生長素在嫩枝基部積累，有促進不定根發(fā)生、提高生根率的作用[20]。黃化處理啟動生根后可繼續(xù)影響其后根系的生長發(fā)育指標(biāo)。如黃化處理提高了楸樹(Catalpa bungei)‘豫楸1號’、血皮槭(Acer griseum)、桃(Prunus persica)‘新疆毛桃’、歐榛(Corylus avellana)和平榛(C.heterophylla)等木本植物的扦插生根率[21-24]，提高了蘋果(Malus pumila)扦插和橄欖(Canarium album)壓條繁殖中不定根生根數(shù)量、根長，并加快了不定根發(fā)生時間[7,25]。孫文全[20]認(rèn)為黃化處理能提高插條對外源生長素的敏感性；B.K.Maynard等[26]在樺葉鵝耳櫪(Carpinus betulus)扦插繁殖中發(fā)現(xiàn)黃化處理改變了插條對IBA的敏感性；本試驗僅涉及1個IBA濃度，因此牡丹枝條黃化后對生長素的敏感性尚需進一步驗證。

IBA處理和枝條環(huán)剝對牡丹不定根有促進作用，紫斑牡丹高空壓條繁殖時結(jié)合環(huán)剝和IBA處理，生根率約70%[27]。曾端香等[28]將‘銀粉金鱗’‘藍田玉’等5個牡丹品種黃化后的嫩枝進行扦插，生根率從20.0%～91.0%不等，其中‘銀粉金鱗’生根率最高，為91.0%，平均生根數(shù)量和根長分別為4.1條、4.9 cm。本研究中，‘黃金翠’和‘洛陽紅’枝條黃化處理后生根率和生根質(zhì)量均優(yōu)于對照，一級根生根率達97.8%和88.9%，遠(yuǎn)高于紫斑牡丹(P.rockii)高壓繁殖生根率，雖與‘銀粉金鱗’扦插生根率相近，但根系質(zhì)量明顯提高。本試驗中，當(dāng)年生牡丹新枝基部約10 cm被土層覆蓋，這樣的環(huán)境給不定根營造了更好的生根條件和更大的生根范圍，黃化處理加快了生根，早發(fā)生的根系在當(dāng)年有更長的生長期，進而黃化枝條的生根率和根系質(zhì)量均明顯提高。根系質(zhì)量影響生根苗的移栽成活率，試驗中2個牡丹品種的一、二級根平均生根數(shù)量、根長和根直徑增加可以更好地吸收土壤中的水分和養(yǎng)分，促進地上部分的生長，也利于種苗移栽。

4 結(jié)論

不定根發(fā)生對牡丹壓條和扦插繁殖十分重要，本試驗2個牡丹品種‘洛陽紅’和‘黃金翠’枝條在黃化處理后，黃化部位的木栓層發(fā)育延遲、皮層薄壁細(xì)胞增多，枝條木質(zhì)化程度降低，不定根首先在黃化部位出現(xiàn)，再結(jié)合枝條環(huán)剝和500 mg/LIBA處理，一級根生根率分別達到88.9%和97.8%，根系質(zhì)量也明顯優(yōu)于對照，因此枝條黃化處理對牡丹的高效繁殖有積極的作用，今后可擴大試驗范圍，研究不同牡丹品種群間枝條黃化處理效率的差異，及黃化處理時間、枝條造傷方法及不同濃度、不同種類生長素對枝條的生根和種苗移栽成活率的影響。