胭脂蘿卜花青素的穩(wěn)定性及抗氧化性研究

＊廖凌姍 田圣 陳杰 熊竹 黃輝勝 袁斌芳

（長江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院 重慶 408100）

現(xiàn)代社會，隨著生活水平的大幅提升，人們比以往更加重視身體健康。大量研究表明，花青素具有抗氧化、延緩衰老、改善視力、防癌抗癌等功效，近年來備受關(guān)注[1]。然而，花青素價格普遍較高，受益人群小。胭脂蘿卜種植面積大，花青素含量高，提取工藝成熟，因此，胭脂蘿卜花青素成本低廉，售價相對較低，深受消費(fèi)者青睞，市場潛力巨大。與其他來源的花青素一樣，胭脂蘿卜花青素也屬于類黃酮物質(zhì)，其基本結(jié)構(gòu)為2-苯基苯并吡喃酮型陽離子，以C6-C3-C6為骨架，穩(wěn)定性不高，在各種物理、化學(xué)因素的影響下化學(xué)結(jié)構(gòu)易發(fā)生改變而變質(zhì)[2]。本文以乙醇水溶液為提取液從胭脂蘿卜中分離出花青素，研究了自然光、溫度、pH、金屬離子等因素對其穩(wěn)定性的影響，同時考查了其抗氧化性能。

1.實(shí)驗(yàn)材料與方法

(1)材料與試劑

胭脂蘿卜、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品、ABTS、DPPH、過氧化氫、過硫酸鉀、抗壞血酸、硫酸亞鐵、溴甲酚紫、氟化鈉、磷酸氫二鈉、無水檸檬酸、鹽酸、氫氧化鈉、乙醇。

(2)儀器與設(shè)備

PT3502C型酶標(biāo)儀、U-3010型紫外-可見分光光度計、RE-3000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、LGJ-12型冷凍干燥機(jī)、PHS-3E型pH計、PTX-FA1205型全自動電子天平、Eurostar 20型機(jī)械攪拌器、HH-WO-5L型恒溫水浴鍋、BPG-9056A型鼓風(fēng)干燥箱、DZF-6020型真空干燥箱、2XZ-2型旋片式真空泵。

(3)實(shí)驗(yàn)方法

①胭脂蘿卜花青素的提取

將胭脂蘿卜切塊并打成漿狀，傾入層析柱中，加入體積比6:4的乙醇水溶液，靜置1h，打開活塞收集流出液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，-55℃冷凍干燥，得到胭脂蘿卜花青素粉末。

②胭脂蘿卜花青素中天竺葵素-3-O-葡萄糖苷含量的測定[3-4]

采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定胭脂蘿卜花青素中的主要成分天竺葵素-3-O-葡萄糖苷的含量。先將天竺葵素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品配制成不同質(zhì)量濃度的稀釋液，調(diào)節(jié)pH至3.0，測試吸光度；再配制不同質(zhì)量濃度的胭脂蘿卜花青素稀釋液，調(diào)節(jié)pH至3.0，測試吸光度；以系列質(zhì)量濃度梯度稀釋液最大吸收峰處（513nm）的吸光度為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)，并線性擬合成直線，得到標(biāo)準(zhǔn)直線；在標(biāo)準(zhǔn)直線上找出花青素稀釋液最大吸收峰處的吸光度所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度，并根據(jù)花青素稀釋液，按公式（1）計算花青素中天竺葵素-3-O-葡萄糖苷的含量。

式中，Cs為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度，mg/L；V為稀釋后花青素的體積，L；m為稱取的花青素質(zhì)量，g。

③胭脂蘿卜花青素的穩(wěn)定性研究[5]

A.自然光的影響。取10mL花青素樣液于比色管中，放于自然光照射處，每隔5～10天測定一次吸光度，連續(xù)測30天。B.溫度的影響。將10mL花青素樣液轉(zhuǎn)移至具塞試管中，分別于50℃、70℃、90℃下加熱1h、2h、3h、4h，測定吸光度。C.pH值的影響。利用檸檬酸、磷酸氫二鈉調(diào)節(jié)花青素樣液pH為2.0、4.0、6.0、8.0，于50℃下水浴加熱1h、2h、3h、4h，測定吸光度。D.金屬離子的影響。量取10mL花青素樣液于4支具塞試管中，分別加入1mmol/L的Zn2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+，調(diào)節(jié)pH至3.0，在50℃下加熱，加熱1h、2h、3h、4h，測定吸光度。

④胭脂蘿卜花青素的抗氧化活性研究[6]

A.ABTS?+清除能力的測定

將7mmol/L的ABTS水溶液和12.25mmol/L的K2S2O8水溶液按體積比5:1混合，避光放置12h得ABTS?+溶液。用無水乙醇稀釋ABTS?+溶液至吸光度為0.7左右，作為工作液。將50μL樣液1000μL工作液混合，在室溫下避光保存7min，轉(zhuǎn)移至ELISA板。對照組用抗壞血酸水溶液代替樣品。ABTS?+的特征吸收波長在734nm處，測定吸光度。ABTS?+清除率（SA）按公式（2）進(jìn)行計算。

式中，Ac為50μL無水乙醇加入1000μL ABTS?+工作液的吸光度；As為50μL樣液加入1000μL ABTS?+工作液的吸光度。

B.DPPH?清除能力的測定

移取200μL樣液于一具塞試管中，加入現(xiàn)配等體積的0.6mmol/L DPPH?乙醇溶液，避光存放30min，引入ELISA板。對照組用抗壞血酸水溶液代替樣品。DPPH?的特征吸收波長在517nm處，測定吸光度。DPPH?清除率（SA）按照公式（3）進(jìn)行計算。

式中，Ac為200μL無水乙醇與200μL DPPH?的吸光度；As為200μL樣液的吸光度。

C.OH?清除能力的測定

將0.4mL 0.5g/L溴甲酚紫乙醇溶液、將0.5mL 0.1mol/L鹽酸溶液、1.0mL 5mmol/L FeSO4溶液、0.5mL H2O2溶液依次傾入10mL具塞試管中，搖勻，稀釋至刻度，置于30℃水浴中反應(yīng)8min，取出后立即加入0.2mL 0.1% NaF溶液終止反應(yīng)。對照組用抗壞血酸水溶液代替樣品。OH?的特征吸收波長在420nm處，測定吸光度。OH?清除率（SA）按照公式（4）進(jìn)行計算。

式中，As為反應(yīng)液與待測樣品混合后的吸光度；A為反應(yīng)液的吸光度；A0為溴甲酚紫、鹽酸混合液的吸光度。

2.結(jié)果與討論

(1)胭脂蘿卜花青素中天竺葵素-3-O-葡萄糖苷含量的測定

對pH3.0的樣液進(jìn)行全波段掃描，得到可見光吸收光譜，如圖1所示。最大吸收峰出現(xiàn)在513nm處，峰值為0.909。花青素粉質(zhì)量為0.05g，稀釋后體積為100mL。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)直線（圖2）和公式（1）計算出花青素中天竺葵素-3-O-葡萄糖苷含量為26.8%。

圖1 pH3.0胭脂蘿卜花青素可見光吸收光譜

圖2 天竺葵素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)直線

(2)胭脂蘿卜花青素穩(wěn)定性研究

①自然光的影響。室溫環(huán)境中，自然光照下暴露30天，樣液中的花青素不斷降解，吸光度隨之發(fā)生改變，變化趨勢如圖3所示。從圖3可以看出樣液的吸光度隨著時間的推移逐漸下降，30天后下降了69.7%。說明花青素對自然光非常敏感，長期儲存需要密封、避光。

圖3 自然光對胭脂蘿卜花青素的影響

②溫度的影響。花青素的穩(wěn)定性與溫度及加熱時間的關(guān)系如圖4所示。結(jié)果顯示，花青素受溫度影響較大，相同的加熱時間，加熱溫度為90℃時，花青素的降解率最高，加熱溫度為50℃時，花青素的降解率最低；加熱溫度為70℃時，花青素降解速率最??；相同加熱溫度下，加熱時間越長，花青素降解率越高。在90℃下加熱4h，降解率達(dá)47.3%；在70℃下加熱4h，降解率為39.9%，在50℃下加熱4h，降解率為38.6%。

圖4 溫度對胭脂蘿卜花青素的影響

③pH值的影響。將花青素樣液的pH值分別調(diào)至2.0、4.0、6.0和8.0，測試其吸光度，發(fā)現(xiàn)pH值為6.0和8.0時，最大吸收峰的位置移動到了532nm和580nm處，說明花青素的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。圖5為花青素在50℃下pH值為2.0和4.0的酸性環(huán)境中加熱，吸光度隨時間的變化曲線。加熱4h后，pH值為2.0和4.0的樣液的吸光度分別下降了4.7%和27.2%。結(jié)果顯示，花青素在堿性環(huán)境中極不穩(wěn)定，在酸性較強(qiáng)的環(huán)境下穩(wěn)定性較高，應(yīng)存放在酸性環(huán)境中。

圖5 pH值對胭脂蘿卜花青素的影響

④金屬離子的影響。在pH3.0的樣液中加入1mmol/L的金屬離子，50℃下加熱4h，間隔1h測試一次吸光度。金屬離子對花青素穩(wěn)定性的影響趨勢如圖6所示。顯然，不同的金屬離子對花青素穩(wěn)定性的影響有一定的差異，Zn2+和Mg2+能提高花青素的穩(wěn)定性；含Ca2+的樣液的吸光度變化曲線與花青素樣液的吸光度變化曲線重合，表明Ca2+的存在對花青素的穩(wěn)定性幾乎沒有影響；而Fe2+則會促進(jìn)花青素的降解，導(dǎo)致其降解速度加快。

圖6 金屬離子對胭脂蘿卜花青素的影響

(3)胭脂蘿卜花青素抗氧化活性研究

①ABTS?+清除能力的測定。利用ABTS與K2S2O8反應(yīng)生成藍(lán)綠色的ABTS?+，加入具有抗氧化活性的樣品，ABTS?+質(zhì)量濃度降低，溶液顏色變淺，吸光度發(fā)生改變。圖7是不同質(zhì)量濃度的花青素和抗壞血酸清除ABTS?+曲線。花青素清除ABTS?+的IC50為25mg/L，抗壞血酸為21mg/L，且在低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，花青素清除ABTS?+的能力高于抗壞血酸，說明兩者清除ABTS?+的能力差異不大。

圖7 不同濃度的胭脂蘿卜花青素和抗壞血酸清除ABTS?+曲線

②DPPH?清除能力的測定。DPPH?在有機(jī)溶劑中能穩(wěn)定存在，其乙醇溶液為深紫色，將抗氧化活性物質(zhì)顏色變淺，吸光度產(chǎn)生變化。圖8為不同質(zhì)量濃度的花青素和抗壞血酸清除DPPH?曲線。花青素清除DPPH?的IC50為9mg/L，抗壞血酸為9.5mg/L；在低質(zhì)量濃度區(qū)間，花青素清除DPPH?的能力稍高于抗壞血酸，在高質(zhì)量濃度區(qū)間，抗壞血酸清除DPPH?的能力高于花青素；花青素對DPPH?有較強(qiáng)的清除能力，質(zhì)量濃度為25mg/L時，DPPH?清除率達(dá)86.0%。

圖8 不同濃度的胭脂蘿卜花青素和抗壞血酸清除DPPH?曲線

③OH?清除能力的測定。雙氧水與硫酸亞鐵反應(yīng)生成OH?，遇溴甲酚紫顯黃色，添加抗氧化活性物質(zhì)，顏色變淡，吸光度發(fā)生變化。圖9為不同質(zhì)量濃度的花青素和抗壞血酸清除OH?曲線?；ㄇ嗨厍宄齇H?的IC50為12mg/L，抗壞血酸為17mg/L；在整個質(zhì)量濃度區(qū)間，花青素清除OH?的能力均高于抗壞血酸；花青素對OH?有較強(qiáng)的清除能力，質(zhì)量濃度為25mg/L時，OH?清除率達(dá)81.3%。

圖9 不同質(zhì)量濃度的胭脂蘿卜花青素和抗壞血酸清除OH?曲線

3.結(jié)論

胭脂蘿卜花青素的穩(wěn)定性受自然光影響較大，在自然光照下室溫存放30天后吸光度下降了69.7%?；ㄇ嗨氐姆€(wěn)定性受溫度影響較大，熱穩(wěn)定性不夠高，在90℃下加熱4h，降解率達(dá)47.3%。花青素在堿性環(huán)境中化學(xué)結(jié)構(gòu)易發(fā)生改變，在酸性較強(qiáng)的環(huán)境下穩(wěn)定性較高，應(yīng)存放在酸性環(huán)境中。Zn2+和Mg2+能提高花青素的穩(wěn)定性，Ca2+對花青素的穩(wěn)定性幾乎沒有影響，F(xiàn)e2+會引起花青素加速降解?；ㄇ嗨氐捏w外抗氧化活性較高，表現(xiàn)出較強(qiáng)的自由基清除能力，對于ABTS?+、DPPH?、OH?的IC50分別為25mg/L、9mg/L、12mg/L，與抗壞血酸相當(dāng)。