宏基因組測序技術(shù)在結(jié)核性腦膜炎診斷中的應用研究進展

石亞瑋，李鑫，武國德，石正洪

蘭州大學第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，蘭州 730000

近年，結(jié)核病的發(fā)病率和病死率仍較高。除了肺結(jié)核，結(jié)核分支桿菌復合群（Mycobacterium tuber‐culosis complex，MTBC）可感染肺外組織，導致肺外結(jié)核（extrapulmonary tuberculosis，EPTB）。結(jié)核性腦膜炎（Tuberculous meningitis，TBM）是最嚴重的一種EPTB，是目前結(jié)核病致殘或致死的主要原因［1］。TBM 占肺外結(jié)核的6.8%［2］。TBM 好發(fā)于兒童和免疫缺陷人群，但TBM 的傳染性低于活動性肺結(jié)核。因為早期明確診斷困難，TBM 患者的預后較差，治療后常存在嚴重的神經(jīng)功能缺損癥狀，病死率較高（成人50%，兒童20%）［1，3］。早期明確TBM 診斷，及時有效對癥治療是改善預后的關鍵。傳統(tǒng)的病原學檢測方法在結(jié)核病的診斷中均存在一定局限性。宏基因組二代測序（metagenomicNextGenerationSe‐quencing，mNGS）技術(shù)不依賴于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)，可直接對臨床樣本中的核酸進行高通量測序，在基因水平快速地檢測病原體，理論上可檢測出樣本中的所有病原體，適用于危急重癥和疑難感染的診斷。mNGS 的出現(xiàn)或許為TBM 的診斷提供了新思路?，F(xiàn)就mNGS在結(jié)核性腦膜炎診斷中應用的相關研究進展綜述如下。

1 臨床常用TBM診斷方法的優(yōu)缺點

1.1 腦脊液結(jié)核分枝桿菌檢測方法 是在細菌層面進行結(jié)合分枝桿菌病原體檢測，目前臨床常用TBM的細菌學檢測方法有腦脊液涂片AF染色和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)。目前國際上公認的TBM的診斷標準主要參照2010年由MARAIS 等［4］制定的復合標準。

腦脊液抗酸（Acid-Fast，AF）染色，也稱為Ziehl-Neelsen 染色，是目前臨床廣泛應用的結(jié)核分枝桿菌診斷方法，可作為明確診斷結(jié)核的第一步。不同于革蘭氏陽性桿菌和格革蘭氏陰性細菌，結(jié)核分枝桿菌具有獨特的細胞壁結(jié)構(gòu)，對革蘭氏染色具有抵抗力，細胞壁能夠耐酸性酒精脫色，這是結(jié)核分枝桿菌抗酸性的來源。腦脊液涂片AF 染色檢測結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌陽性可明確診斷為TBM。但AF 染色方法要求每毫升腦脊液中結(jié)核分枝桿菌載量在5 000～10 000 以上，但結(jié)核分枝桿菌作為一種胞內(nèi)菌，在腦脊液中的病原體載量很低，導致腦脊液涂片AF 染色診斷TBM 的陽性率只有10%～20%［3］。目前有多種改良染色方法在一定程度上提高了腦脊液涂片AF 染色診斷TBM 的靈敏度，但其檢出率仍然達不到臨床應用要求。

結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)是目前臨床診斷TBM 的金標準，診斷結(jié)核分枝桿菌的靈敏度較高（50%～60%）。結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)主要有液體培養(yǎng)法和固體培養(yǎng)法兩種。但兩種培養(yǎng)方法所需時間均較長，往往會延誤患者的病情診治時間，在TBM 早期診斷中的臨床應用價值有限［5］。

1.2 結(jié)核分枝桿菌分子生物學檢測方法 即擴增結(jié)核分支桿菌的遺傳物質(zhì)，目前臨床常用TBM的分子生物學檢測方法有聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）、利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測（Xpert MTB/RIF）技術(shù)和環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification LAMP）等，mNGS檢測也屬于分子生物學檢測技術(shù)中的一種。

PCR 是一種體外核酸擴增技術(shù)，可提取和擴增臨床標本中的遺傳物質(zhì)。PCR診斷結(jié)核分枝桿菌的靈敏度（55.8%～87.6%）［6］及特異度（94%～100%）［7］均較高，且診斷所需時間短，目前已用于TBM 的診斷中。但腦脊液中結(jié)核分枝桿菌的載量低限制了PCR的廣泛應用。

Xpert MTB/RIF 技術(shù)和LAMP 技術(shù)都是新型核酸擴增技術(shù)（nucleic acid amplification tests ，NAATs），檢測所需時間較短，目前已逐漸應用于TBM 的早期診斷中。2013 年世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦將Xpert MTB/RIF 技術(shù)作為TBM 診斷的首選初始檢測方法，但Xpert MTB/RIF 技術(shù)對腦脊液樣本的要求高，包括腦脊液的樣本量以及細菌負載量等，都在一定程度上限制了其在臨床工作中的應用。

1.3 結(jié)核分枝桿菌免疫學檢測方法 結(jié)核分枝桿菌可致患者體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗原，刺激T 淋巴細胞分泌γ 干擾素。γ-干擾素釋放試驗（interferon-gam‐ma release assays，IGRAs）可通過檢測γ 干擾素，判斷是否存在結(jié)核分枝桿菌感染［8］。腺苷脫氨酶（Ad‐enosine deaminase，ADA）檢測和阿拉伯糖甘露糖脂（Lipoarabinomannan，LAM）檢測均是基于免疫學的檢測方法，但目前臨床應用較少，其對結(jié)核分枝桿菌的診斷效能也較差。

TBM 明確診斷困難的原因主要有：①TBM 的臨床癥狀以及腦脊液檢查、影像學檢查等各種輔助檢查結(jié)果，都與病毒性腦膜炎、隱球菌性腦膜炎（Cryp‐tococcus Neoformans Meningitis，CNM）等中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病相似［9］。甚至，患者可出現(xiàn)TBM、隱球菌性腦膜炎的雙重感染，增加確診難度［10］。②腦脊液標本需通過腰椎穿刺有創(chuàng)操作獲取，導致部分患者明確診斷困難。同時，結(jié)核分枝桿菌的生長需要高濃度的氧氣，且生長速度特別慢，而腦脊液是一種相對無菌的體液，導致腦脊液中結(jié)核菌的載量非常低［11］。③多數(shù)TBM 由結(jié)核分枝桿菌引起，但部分病例為牛分枝桿菌等非結(jié)核分枝桿菌病原體致病［12］。④TBM 的臨床癥狀不典型，部分患者在未明確診斷的時候已進行試驗性治療［13］。

2 mNGS在TBM診斷中的應用

2.1 mNGS在TBM診斷中的優(yōu)勢及局限性

2.1.1 mNGS在TBM診斷中的優(yōu)勢

2.1.1.1 無偏倚檢測 mNGS 可對目前所有已知的病原微生物（病毒、細菌、真菌及寄生蟲）總DNA或RNA 進行無偏倚和全覆蓋的檢測［14］，可用于臨床表現(xiàn)不典型的TBM、混合感染以及臨床中難以確診但高度懷疑神經(jīng)系統(tǒng)感染的病例中。TBM 有時會同時合并其他病原體感染，而mNGS 的無偏倚檢測的特性能夠在檢測結(jié)核分枝桿菌的同時，檢出病毒、隱球菌、其他不常見細菌等病原體。一項關于mNGS 在AIDS 患者疑診中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的研究［15］中發(fā)現(xiàn)，在一例檢測前初步診斷為TBM 的患者中，最終發(fā)現(xiàn)合并曲霉菌感染。此外，除結(jié)核分枝桿菌外，牛結(jié)核分支桿菌等其他結(jié)核分枝桿菌屬病原體也可引起TBM［16］。國內(nèi)也有相關的報道，張芙蓉等［17］采用mNGS 診斷了1 例合并血管炎的TBM。錢喬喬等［18］用mNGS診斷一般檢測手段難以確診的兒童TBM 5例。

2.1.1.2 診斷靈敏度高 腦脊液中結(jié)核分枝桿菌的負荷量通常較低，限制了其他檢測方法的應用，而mNGS的高靈敏度是顯著區(qū)別于其他檢測手段的優(yōu)勢。一項關于mNGS在TBM診斷中的可行性分析研究［19］中，共納入23例（12例明確診斷，11例臨床診斷）患者，最終mNGS 檢測結(jié)果為18 例結(jié)核分枝桿菌陽性，mNGS 診斷TBM 的靈敏度78.26%、特異度100%，與傳統(tǒng)檢測方法結(jié)合后檢出率提高到95.65%。一項前瞻性多中心研究［20］對213 例中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病中擬診為TBM 的44 例（6 例明確，38 例可能）患者進行研究，發(fā)現(xiàn)腦脊液Xpert MTB/RIF 陽性率為16.13%（5/31），mNGS 陽性率為27.27%（12/44）；mNGS和Xpert MTB/RIF聯(lián)合陽性率為29.55%（13/44），且所有腦脊液樣本的抗酸染色和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果均為陰性，但是Xpert MTB/RIF技術(shù)和mNGS檢測的一致性有待進一步研究。最新一項前瞻性研究［21］顯示，mNGS 診斷疑似TBM的敏感度58.8%（20/34）、特異度為100%（16/16），而確診患者中，mNGS 診斷的敏感度為63.6%（14/22），傳統(tǒng)檢測方法聯(lián)合mNGS診斷TBM的敏感度高達82.4%（28/34）。一項研究［22］共納入肺外標本結(jié)核分枝桿菌涂片染色陰性的疑似患者208 例，結(jié)果mNGS 檢測結(jié)果陽性45 例；在各種肺外結(jié)核中mNGS 檢測TBM 的陽性率最高；AUC 值是各種檢測方法中最高（0.79）；其中33 例患者mNGS 檢測陽性而其他檢測（包括細菌培養(yǎng)和Xpert MTB/RIF 技術(shù)）檢測陰性?？顾崛旧珯z測陽性說明結(jié)合分枝桿菌的病原體載量高，在抗酸染色涂片陰性的患者檢出結(jié)核分枝桿菌陽性，說明mNGS 診斷結(jié)核分枝桿菌靈敏度較高?？傊琺NGS 對TBM 的診斷價值較高，且mNGS 聯(lián)合其他檢測方法能夠提高其診斷效能。

2.1.1.3 檢測周期短 mNGS檢測周期為2～3天，與細菌培養(yǎng)相比，明顯縮短了臨床診斷時間。一項研究［26］中對結(jié)核分支桿菌培養(yǎng)、Xpert MTB/RIF 以及mNGS 技術(shù)所需要的時間進行了對比，Xpert MTB/RIF檢測所需時間平均為2 h，而結(jié)核桿菌培養(yǎng)需要時間為2～3周，培養(yǎng)結(jié)果為陰性的甚至需要更長的時間，一般在2個月左右。

2.1.1.4 檢測結(jié)果不受抗結(jié)核藥物等的影響 傳統(tǒng)檢測手段多依賴于標本中活菌的存在，所以檢出率在使用抗結(jié)核藥物的情況下有一定程度的降低。YAN 等［23］共納入51 例HIV 陰性患者，其中45 例被診斷為TBM（38 例明確、5 例很可能及2 例可能），6例為非TBM，以最終診斷為參考標準，腦脊液mNGS檢查對TBM 診斷敏感度、特異度分別為84.44%（38/45，69.94%～93.01%）、100%（6/6，51.68%～100%），mNGS的診斷敏感度（84.4%）明顯高于抗酸染色檢查、細菌培養(yǎng)（22.2%，P= 0.000）、PCR（24.4%，P= 0.000）和Xpert MTB/RIF 技術(shù)（40%，P= 0.000）。該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，檢測前是否使用抗結(jié)核藥物對mNGS的檢測結(jié)果沒有影響。其將患者分為檢測前進行過抗結(jié)核藥物治療組和未進行抗結(jié)核藥物治療組，結(jié)果顯示兩組mNGS 陽性結(jié)果分別為51 例（52.94%）與129 例（62.79%），兩組檢出率之間無統(tǒng)計學差異。并與其他檢測方法進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)進行細菌培養(yǎng)的抗結(jié)核藥物治療組的陽性結(jié)果有0 例，未進行抗結(jié)核藥物治療的有25 例（19.51%）；進行Xpert MTB/RIF 的抗結(jié)核藥物組的陽性結(jié)果有12 例（23.53%），未進行抗結(jié)核藥物治療組的有54例（41.86%）。

臨床目前對mNGS對TBM的診斷效能尚存在一定爭議。可能原因為：①納入標準不同，有些研究以疑診TBM 為標準，有些研究以其他檢測方法確定診斷的TBM 為標準；②研究對象不同，有些研究選取HIV 陰性的病例，有些是將AIDS 病人涵蓋其中的，而AIDS 患者作為TBM 的高發(fā)人群，納入范圍廣的在一定程度上降低了檢出率；有些研究是在綜合醫(yī)院選取研究對象，有些則是從結(jié)核病?？漆t(yī)院進行；③最終診斷標準不同，多數(shù)研究的診斷標準為CRS（composite reference standard），但也有例外，比如有些研究并未將抗結(jié)核治療效果的評價作為診斷的參考，此外，大多數(shù)研究對于mNGS的檢測結(jié)果沒有進行進一步的驗證（PCR），直接將mNGS 檢出結(jié)核分支桿菌的病例認為是TBM；④研究樣本量較小等。

2.1.2 mNGS 在TBM 診斷中的局限性 ①背景菌或污染問題：污染微生物序列是腦脊液檢測的主要問題。由于mNGS 技術(shù)高度的靈敏度，很容易檢出無關的來自外界環(huán)境或者試劑的微生物，有時甚至難以與責任病原體區(qū)分；同時，宿主來源的遺傳物質(zhì)或人體正常寄生菌也會在測序過程中被檢出，導致真正的病原體序列所占比例往往很小。在非常低生物量的樣本（如CSF）中，測序試劑的污染物就會發(fā)生過度擴增。當CSF 樣本中幾乎不存在生物量時，PCR擴增步驟中使用的引物會一次又一次地放大環(huán)境污染物的最小數(shù)量，從而增加最終數(shù)據(jù)集中污染物的比例代表性。mNGS 檢出率最高的污染菌是Propionibacterium acnes，Acidovorax KKS102 和擬短桿菌（Brevundimonas subvibri-oides）［23］。②病原學數(shù)據(jù)庫不完善：mNGS 技術(shù)雖然可以無差別地將樣本中的所有遺傳物質(zhì)檢測出來，但是最終結(jié)果是將特異性DNA 或RNA 片段在病原學數(shù)據(jù)庫中進行對比而得出的，只有所選數(shù)據(jù)庫中包含已知生物的同源性序列才能被識別。所以，在mNGS 檢測結(jié)果為陰性時，并不能完全排除是某一新病原體導致的感染的可能性。③測序成本高：測序所需實驗室條件要求高，一般的實驗室不具備操作條件，高通量測序技術(shù)產(chǎn)生非常大的數(shù)據(jù)集，例如，基于Illumina的mNGS 旨在為每個樣本生成5～2 000 萬個100～150 nt 核苷酸序列，處理這些海量數(shù)據(jù)需要的很強的技術(shù)支持。④操作要求嚴格：包括標本的獲取、運輸、保存等各個步驟，稍有不慎，都將對測序結(jié)果產(chǎn)生影響，例如若在進行檢測之前CSF 樣本就已經(jīng)在室溫下儲存或冷藏多天，病原體的核酸（尤其是RNA）可能已經(jīng)降解，mNGS 可能產(chǎn)生假陰性結(jié)果。⑤檢測結(jié)果解讀程度不一：mNGS 無法判斷所檢出的病原體是否正在生長或復制，如有時可以在腦脊液中檢出EB 病毒，但EB 病毒可能只是潛伏在腦脊液中的病原體而非此次發(fā)病的責任病原體，此時對于檢測結(jié)果的解讀需要慎重。

2.2 如何提高mNGS 在TBM 中的診斷效能 為提高結(jié)合分枝桿菌的檢出率，mNGS 的臨床操作中應注意：①對結(jié)果的判讀上，由于結(jié)核分枝桿菌在腦脊液中載量很小，且腦脊液相對無菌，結(jié)核菌對生長條件要求較高，很難作為一種污染菌存在，所以在結(jié)果為陽性的時候，診斷為TBM 的可靠性還是很高的，可以在一定程度上降低特異序列數(shù)的界線范圍，或許是提高檢出率的一種方法。②增加腦脊液標本量，可能對檢測結(jié)果有一定的影響［24］。③盡量以首次腰椎穿刺獲取的腦脊液作為檢測對象，雖然其中的機制尚未闡明，但已有研究表明第一次腰椎穿刺獲得的腦脊液陽性率最高［23］。④患有TBM 時，腦脊液中白細胞的升高，導致宿主白細胞DNA 成為主要的背景遺傳物質(zhì)的來源，在檢測過程中，可以通過一系列方式減少背景DNA 的存在，以提高結(jié)核分枝桿菌的檢出率［12］。⑤重復多次檢測，若條件允許，必要時可對腦脊液行多次mNGS 檢測，以提高病原體的檢出率。⑥提高測序深度（即單個樣本獲得的單個序列數(shù)量），由于腦脊液樣本具有較低的病原體負載量和（或）大量的人類序列（如腦脊液中增高的白細胞）或環(huán)境背景污染，增加測序深度是提高靈敏度的潛在解決方案。

綜上所述，TBM 的細菌學檢測方法有腦脊液涂片AF染色和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，分子生物學檢測方法有PCR、Xpert MTB/RIF 技術(shù)和LAMP 技術(shù)等，免疫學檢測方法有IGRAs、ADA、LAM 檢測等，其用于TBM的早期診斷均有一定不足。mNGS用于TBM 診斷的靈敏度、特異度均較高，且具有無偏倚檢測、可檢測混合感染、靈敏度高、檢測周期短、檢測結(jié)果不受抗結(jié)核藥物影響等優(yōu)點。