DNA分子標(biāo)記技術(shù)在菊花種質(zhì)資源中的應(yīng)用研究

高雅迪，張振豪，王一帆，劉慧婕，沈晨佳，王慧中，馮尚國

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院浙江省藥用植物種質(zhì)改良和質(zhì)量監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311121)

菊花(ChrysanthemummorifoliumRamat.)為菊科(Compositae)菊屬(ChrysanthemumL.)多年生花卉，在花卉界被譽(yù)為世界兩大花卉育種奇觀之一[1].菊花是我國的傳統(tǒng)名花，具有極高的經(jīng)濟(jì)和觀賞價(jià)值，其多姿多彩的形態(tài)和豐富的文化內(nèi)涵深受我國人民的喜愛，至今有不少地方仍保留著在秋季舉辦菊展的傳統(tǒng).我國菊花栽培具有悠久的歷史，分布廣泛，品種多樣，清朝《廣群芳譜》所記載的菊花品種就有300～400種.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)收集保存了3 000多個(gè)菊花品種的5 000多份種質(zhì)資源，成為中國菊花種質(zhì)資源保存中心.醫(yī)學(xué)研究表明，菊花含有揮發(fā)油、菊甙、氨基酸、黃酮類、多種維生素和微量元素，對大腸桿菌、福氏痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制作用，具有止痢、降壓、降脂、消炎、明目、強(qiáng)身的作用[2-4].另外，菊花還具有散風(fēng)清熱、平肝明目、清熱解毒的功效，常用于治療風(fēng)熱感冒、頭痛眩暈、目赤腫痛、眼目昏花和瘡癰腫毒[5].

菊花品種繁多，花的形態(tài)、顏色差異較大，菊花品種的分類鑒定成為重要的科學(xué)問題.國內(nèi)外有著各種各樣的菊花品種分類體系.早在宋代，人們便開始以顏色來區(qū)分菊花品種，其次是花形和花期.湯忠皓[6]根據(jù)花徑大小、花枝習(xí)性將菊花分成兩大區(qū)，然后依據(jù)舌狀花與管狀花數(shù)量之比分成舌狀花系與盤狀花系，最后再依據(jù)瓣形及瓣化程度分成類和型.美國、日本和英國等國家對菊花品種分類也有各自不同的分類體系.總體上，目前菊花品種的分類比較混亂，同名異物、同物異名現(xiàn)象嚴(yán)重.同時(shí)，菊花復(fù)雜的遺傳背景和混亂的親緣關(guān)系也給菊花育種工作帶來了非常大的阻礙.另外，由于長期的相互引種栽培，地區(qū)間菊花類型混雜.大量研究表明菊花種質(zhì)資源在形態(tài)特征、內(nèi)在質(zhì)量和產(chǎn)量等方面均有較大差異.因此，對菊花種質(zhì)資源開展分子評價(jià)及遺傳資源保護(hù)研究是十分急迫和必要的.

與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記和生化標(biāo)記技術(shù)相比，DNA分子標(biāo)記不受外界環(huán)境、發(fā)育階段以及組織器官差異的影響，可以對生物個(gè)體不同發(fā)育時(shí)期的各個(gè)器官、組織甚至細(xì)胞等進(jìn)行檢測.DNA分子標(biāo)記穩(wěn)定性強(qiáng)、數(shù)量多、遍布于整個(gè)植物基因組，可提供的遺傳信息量大.因此，DNA分子標(biāo)記已成為研究學(xué)者進(jìn)行植物遺傳多樣性評價(jià)、系統(tǒng)進(jìn)化重建、種質(zhì)資源鑒定及遺傳圖譜構(gòu)建等研究的重要技術(shù)手段[7].本文對近年來DNA分子標(biāo)記技術(shù)在菊花遺傳多樣性評價(jià)、系統(tǒng)發(fā)育分析、種質(zhì)鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建及QTL定位和表型性狀關(guān)聯(lián)分析等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為菊花種質(zhì)資源的精確鑒別和合理開發(fā)利用提供有效的分子技術(shù)依據(jù).

1 遺傳多樣性研究

遺傳多樣性一般是指植物種內(nèi)個(gè)體之間或群體內(nèi)不同個(gè)體的遺傳變異之和，是物種多樣性的重要來源.對遺傳多樣性的研究有助于人們更好地認(rèn)識植物多樣性的起源和進(jìn)化，為植物的分類進(jìn)化、遺傳育種、資源保護(hù)和遺傳改良奠定基礎(chǔ).近年來，開展了較多的基于DNA分子標(biāo)記的菊花植物遺傳多樣性的研究.徐文斌等[8]運(yùn)用RAPD 標(biāo)記對22個(gè)基因型藥用菊花的遺傳多樣性進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥用菊花種質(zhì)資源在分子水平上存在較大差異，藥用菊花栽培類型間的差異與環(huán)境因素有關(guān)，但更大程度上由其遺傳因素決定.Kumar等[9]利用RAPD標(biāo)記分析38個(gè)菊花品種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，發(fā)現(xiàn)菊花品種間存在豐富的多樣性.Lema-Ruminska等[10]利用RAPD標(biāo)記對2個(gè)菊花品種‘Lady Salmon’和‘Lady Vitroflora’及其15個(gè)體細(xì)胞胚衍生株系的遺傳多樣性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示所有品種及其品系分為兩個(gè)主聚類和兩個(gè)亞聚類.韓潔[11]利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，對45個(gè)菊花品種進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，研究表明供試品種資源DNA水平酶切位點(diǎn)的分布存在廣泛的變異，并將45份菊花資源分成6個(gè)類群.Roein等[12]利用AFLP分子標(biāo)記及形態(tài)性狀標(biāo)記對30個(gè)伊朗菊花品種進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)研究，結(jié)果顯示品種之間存在豐富的多態(tài)性，供試菊花品種被聚類為4組.Feng等分別基于SSR標(biāo)記[13]和SCoT標(biāo)記[14]對32個(gè)藥用菊花品種進(jìn)行了遺傳多樣性評價(jià)，研究表明SSR和SCoT標(biāo)記均具有較高的可重復(fù)性和信息性，可用于評價(jià)藥用菊花品種間的遺傳多樣性和親緣關(guān)系.Fan等[15]開發(fā)獲得了361對多態(tài)性SSR標(biāo)記引物，利用SSR標(biāo)記對59個(gè)菊花樣本進(jìn)行了基因分型和分類研究，聚類分析表明供試材料可分為6個(gè)系統(tǒng)發(fā)育類群.Hodaei等[16]利用形態(tài)性狀標(biāo)記和SRAP標(biāo)記對30個(gè)伊朗菊花品種進(jìn)行研究，研究表明SRAP標(biāo)記和形態(tài)特征標(biāo)記在分析菊花遺傳多樣性方面具有很大的潛力，并可以用于選擇雜交育種計(jì)劃中的理想親本，為觀賞用途開發(fā)優(yōu)良品種.吳洋洋等[17]基于SRAP分子標(biāo)記對6個(gè)切花菊品種及其38個(gè)F1代單株的遺傳關(guān)系進(jìn)行研究，研究表明SRAP分子標(biāo)記可有效用于鑒定菊花不同雜交組合后代.Samarina等[18]利用36個(gè)SCoT標(biāo)記、10個(gè)ISSR標(biāo)記和5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對主要來自俄羅斯的95份菊花核心種質(zhì)的遺傳多樣性進(jìn)行研究，為菊花重要性狀標(biāo)記的選擇、菊花性狀定向育種和種質(zhì)鑒定提供了新的依據(jù).

2 系統(tǒng)發(fā)育研究

DNA分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)了植物系統(tǒng)發(fā)育研究領(lǐng)域的不斷進(jìn)步.戴思蘭等[19]首次使用22個(gè)RAPD標(biāo)記引物對7種野生菊花、14種栽培菊花和5個(gè)種間雜交種進(jìn)行分析，提出栽培菊花主要起源于毛華菊、野菊和菊花腦.李辛雷等[20]基于RAPD標(biāo)記研究菊屬野生種、栽培藥用菊花及種間雜種的親緣關(guān)系，探究了栽培菊花的起源演化，為菊屬植物幼胚拯救及遺傳育種工作提供了一定的理論指導(dǎo).呂琳等[21]利用ISSR分子標(biāo)記對不同地區(qū)來源的19份藥用菊花種源、4份野菊種源、1份菊花腦種源和1份雜交菊花進(jìn)行遺傳關(guān)系分析，結(jié)果顯示25份種源可分成兩大組，野菊、菊花腦和雜交菊花聚為一類，19份藥用菊花種源聚為一類.Luo等[22]利用SSR標(biāo)記對88個(gè)菊花品種及其近緣屬物種進(jìn)行遺傳關(guān)系及分類研究，將野生品種和大花品種劃分為2個(gè)聚類，并將大花品種按花瓣類型劃分為5個(gè)組，表明菊花花瓣類型可以作為分類標(biāo)準(zhǔn).Shen等[23]利用7個(gè)低拷貝核位點(diǎn)和rDNA ITS序列，以菊花類群為重點(diǎn)，重建了青蒿亞族的系統(tǒng)發(fā)育過程，研究表明菊花類群首先起源于中亞，緊接著菊花向東部遷移，至阿加尼亞地區(qū)開始原地多樣化進(jìn)化，研究結(jié)果同時(shí)顯示菊花族3個(gè)譜系的地理結(jié)構(gòu)與亞洲內(nèi)部的生態(tài)位分化和環(huán)境異質(zhì)性有關(guān).

3 種質(zhì)資源鑒定

有研究采用RAPD技術(shù)對15個(gè)菊花品種進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示RAPD標(biāo)記可以區(qū)分供試菊花品種，品種間的相似程度較低[24].Barakat等[25]利用RAPD標(biāo)記對菊花突變體及其親本進(jìn)行鑒定，研究表明14個(gè)菊花基因型的遺傳相似度為0.43～0.95，菊花品種及其13個(gè)體細(xì)胞無性系分為5個(gè)類群.Mekapogu等[26]利用23個(gè)SSR標(biāo)記對11個(gè)標(biāo)準(zhǔn)型菊花品種進(jìn)行鑒定區(qū)分，結(jié)果僅用ChSSR_16標(biāo)記就可以對11個(gè)標(biāo)準(zhǔn)型品種進(jìn)行鑒別.Shirao等[27]開發(fā)獲得了4個(gè)菊花新品種的特異性DNA標(biāo)記(RAPD和AP-PCR標(biāo)記)，為菊花新品種及其他園藝和農(nóng)業(yè)作物無性系品種的鑒定提供了重要的技術(shù)積累.裴莉昕等[28]基于葉綠體基因trnL-trnF序列對菊花和野菊花藥材開展DNA分子鑒別，研究表明菊花特異性標(biāo)記可以將菊花和野菊花區(qū)分，為菊花和野菊花藥材快速準(zhǔn)確鑒別奠定了基礎(chǔ).Asha等[29]利用ISSR和SSR標(biāo)記技術(shù)對30個(gè)菊花品種進(jìn)行基因型鑒定和遺傳親緣關(guān)系評價(jià)，研究顯示30個(gè)菊花基因型之間存在顯著差異，ISSR和SSR分子標(biāo)記均可用于菊花的性狀鑒別研究.Zhang等[30]利用20個(gè)SSR標(biāo)記建立了480個(gè)中國傳統(tǒng)菊花品種的DNA指紋圖譜和分子特征，初步鑒定了480個(gè)中國傳統(tǒng)菊花品種，并選擇5個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn)作為核心位點(diǎn)，建立了每個(gè)菊花品種的獨(dú)特指紋圖譜和分子身份.Nasri等[31]利用ISSR和IRAP標(biāo)記成功對菊花甲基磺酸乙酯(EMS)誘變突變體及其母株進(jìn)行了鑒別分類.Chatterjee等[32]基于RAPD標(biāo)記對10個(gè)菊花原種和11個(gè)突變體的分子系統(tǒng)學(xué)和遺傳差異進(jìn)行f分析，研究表明利用RAPD技術(shù)可以在分子水平上鑒定不同花色的菊花突變體.秦賀蘭等[33]開展小菊花色芽變品系的SRAP鑒定研究，共獲得8條可能與花色芽變基因有關(guān)的特異條帶，這些特異條帶可以在植物生長早期用于鑒別菊花芽變品種與對照.

4 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及QTL定位

遺傳圖譜是已知性狀的基因或特定DNA分子標(biāo)記在染色體上的排列順序和間距的線性排列圖.遺傳連鎖圖譜構(gòu)建是進(jìn)行分子輔助育種、目的基因定位和數(shù)量性狀研究的基礎(chǔ)，也是植物基因組學(xué)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為植物資源的保存、利用及種質(zhì)遺傳改良提供了可靠的科學(xué)依據(jù).Zhang等[34]采用RAPD、ISSR和AFLP標(biāo)記，采用雙擬測交作圖策略，對菊花品種‘雨花落英’ב奧運(yùn)含笑’雜交的142個(gè)F1子代進(jìn)行基因分型，構(gòu)建了菊花的遺傳連鎖圖譜，為菊花的進(jìn)一步數(shù)量性狀QTL定位和標(biāo)記輔助育種奠定了基礎(chǔ).van Geest等[35]基于SNP標(biāo)記，構(gòu)建了菊花第一張完整的六倍體遺傳連鎖圖譜，研究了親本單倍型在后代中的遺傳和多等位基因QTL的檢測.Song等[36]采用SLAF-seq技術(shù)構(gòu)建了菊花花型性狀高密度基因連鎖圖譜，平均圖譜距離為0.76 cM，共檢測到3個(gè)控制花冠筒融合度(CTMD)的主要QTL和4個(gè)支持舌狀小花相對數(shù)(RNRF)的主要QTL.Fu等[37]利用SSR標(biāo)記技術(shù)對80個(gè)菊花品種開展了對蚜蟲抗性的遺傳變異及關(guān)聯(lián)定位研究，分析了夏秋兩季菊花抗蚜性的遺傳變異特征，利用關(guān)聯(lián)作圖法共鑒定出11個(gè)與蚜蟲抗性相關(guān)的標(biāo)記，單個(gè)解釋的表型變異范圍為11%～57%，其中SSR184-1和E1M5-1被鑒定為抗蚜的有利等位基因，7個(gè)具有這兩個(gè)有利等位基因的品種被鑒定為潛在的供體親本，可用于今后的抗蚜育種.Su等[38]以162個(gè)菊花F1系群體為材料，利用SRAP和SSR標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖譜，對菊花的4個(gè)耐澇性性狀的QTL進(jìn)行了動(dòng)態(tài)和上位性分析，研究發(fā)現(xiàn)控制菊花耐澇性性狀的QTL是環(huán)境依賴的，在不同的時(shí)間有選擇性表達(dá)，表明在菊花耐澇性性狀的遺傳上存在加性和上位性效應(yīng).在此基礎(chǔ)上，Su等[39 ]又基于SNP分子標(biāo)記對88個(gè)菊花品種進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)(GWAS)分析，進(jìn)一步解析了菊花耐澇性的遺傳基礎(chǔ).

5 表型性狀關(guān)聯(lián)分析

研究植物表型性狀與DNA分子標(biāo)記之間的關(guān)聯(lián)性，可以從分子水平揭示植物表型性狀的遺傳變異機(jī)制，為植物分子育種和性狀遺傳改良奠定重要基礎(chǔ).張飛等[40]以菊花‘雨花落英’和‘奧運(yùn)含笑’及其142株F1群體為材料，利用RAPD和ISSR標(biāo)記技術(shù)開展了與F1群體營養(yǎng)生長期6個(gè)觀賞性狀的關(guān)聯(lián)研究，研究表明，與株高、株幅、株高/株幅、節(jié)間長度、葉長和葉寬相關(guān)聯(lián)的遺傳標(biāo)記有59個(gè)，這些標(biāo)記的累積貢獻(xiàn)率均在30%以上.另外，張飛等[41]還利用SRAP標(biāo)記開展了菊花F1代花器性狀關(guān)聯(lián)分析研究，為進(jìn)一步研究菊花花器性狀奠定了遺傳基礎(chǔ).Zhang等[42]基于SRAP基因分型的標(biāo)記-性狀關(guān)聯(lián)分析研究菊花初花期和開花持續(xù)時(shí)間這兩個(gè)開花性狀的遺傳，研究表明，與表型顯著相關(guān)的標(biāo)記有10個(gè)(初始開花時(shí)間)和12個(gè)(開花期)，分別解釋了46%和54%的變異.李仁偉等[43]運(yùn)用19對SRAP標(biāo)記引物對58個(gè)大菊品種進(jìn)行研究，利用獲得的分子標(biāo)記與18個(gè)重要表型性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，研究發(fā)現(xiàn)，與花部性狀(花梗粗度、花瓣寬度、筒狀小花數(shù)量)關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)有5個(gè)，與莖部(莖粗度)關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)有1個(gè)，與葉部性狀(葉厚度)關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)1個(gè)，每個(gè)位點(diǎn)對表型變異的解釋率在0.073 8～0.479 1.楊旭旭[44]測量59個(gè)大菊品種的表型性狀，并結(jié)合SCoT分子標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)有18個(gè)位點(diǎn)與花部性狀(舌狀花的長度、寬度、長/寬)相關(guān)聯(lián)，9個(gè)位點(diǎn)與葉部性狀(葉柄長度、葉片長度、葉片長/寬、托葉大小)相關(guān)聯(lián).袁王俊等[45]利用16對SSR標(biāo)記引物和10條SCoT標(biāo)記引物對99個(gè)菊花品種進(jìn)行基因組變異分析，并對10個(gè)表型性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)有8個(gè)SSR位點(diǎn)與7個(gè)表型性狀(花序直徑、花序高度、舌花寬度、葉柄長度、葉片長度、托葉大小及葉一級刻度)相關(guān)聯(lián)，3個(gè)SCoT位點(diǎn)與花序直徑相關(guān)聯(lián).李沛曈等[46]利用SSR標(biāo)記開展了異色菊×菊花腦種間雜交F1代遺傳多態(tài)性分析、耐旱性鑒定及關(guān)聯(lián)分析，為菊花耐旱性遺傳改良研究奠定了基礎(chǔ).葉松[47]對99個(gè)不同菊花品種進(jìn)行表型性狀檢測，并利用SSR和SCoT標(biāo)記進(jìn)行了相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)分析，研究發(fā)現(xiàn)有3個(gè)SSR位點(diǎn)分別與4個(gè)表型性狀(花序高度、舌狀花寬度、葉柄長度和葉片長度)相關(guān)聯(lián)，另外有21個(gè)SCoT位點(diǎn)與菊花的7個(gè)表型性狀相關(guān)聯(lián).Chong等[48]基于SNP標(biāo)記對199菊花品種的遺傳多樣性、系統(tǒng)進(jìn)化和性狀相關(guān)候選基因進(jìn)行了研究，為一些關(guān)鍵觀賞性狀的進(jìn)化關(guān)系、群體結(jié)構(gòu)和遺傳基礎(chǔ)提供了新的見解.除此之外，Chong 等[49]還基于SNP標(biāo)記及表型數(shù)據(jù)，對107種菊花開展了全基因組關(guān)聯(lián)研究，分析了3個(gè)花序相關(guān)性狀的遺傳控制情況，共鑒定出81個(gè)與花序性狀相關(guān)的SNPs，確定了3個(gè)目標(biāo)性狀的15個(gè)高度有效的SNP位點(diǎn).

6 展望

DNA分子標(biāo)記技術(shù)已成為菊花遺傳育種研究中的重要技術(shù)手段，存在如RAPD、ISSR等一些早期傳統(tǒng)分子標(biāo)記的穩(wěn)定性和可重復(fù)性不夠理想、標(biāo)記的數(shù)量和可提供的遺傳信息較有限等問題.但和傳統(tǒng)的形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記和生化標(biāo)記比較，分子標(biāo)記技術(shù)依然有著獨(dú)特的優(yōu)勢.伴隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)的檢測準(zhǔn)確性、經(jīng)濟(jì)成本、時(shí)間周期都在不斷地更新和完善，相信在不久的將來，DNA分子標(biāo)記技術(shù)在菊花種質(zhì)資源遺傳多樣性、分子遺傳育種、遺傳圖譜及QTL定位等方面可得到更加深入的應(yīng)用.