MLK3基因敲除抑制骨骼肌損傷后再生*

高詩娟，張燕紅，方光明，杜 杰

（首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院，北京市心肺血管疾病研究所，北京 100029）

人體約80%的蛋白由骨骼肌儲存。骨骼肌萎縮不僅直接導致骨骼肌功能下降，還會導致全身營養(yǎng)不良，嚴重影響生活質量。骨骼肌在正常及病理狀況下處于損傷和再生的動態(tài)過程。損傷和再生失衡會導致骨骼肌萎縮。骨骼肌再生由一群位于肌纖維基底膜和肌膜之間的肌衛(wèi)星細胞來完成。這群長期處于相對靜息狀態(tài)的細胞在骨骼肌受到損傷刺激時被激活，繼而經(jīng)過增殖、分化、融合形成新的肌纖維，從而完成骨骼肌再生過程［1-2］。肌衛(wèi)星細胞的增殖和分化受多個信號通路調控。Notch信號通路的活化促進肌衛(wèi)星細胞自我更新，抑制分化［3］。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路的激活則促進肌衛(wèi)星細胞增殖和分化［4-5］。闡明肌衛(wèi)星細胞增殖和分化的調控機制，對于認識如何維持骨骼肌穩(wěn)態(tài)，阻止骨骼肌萎縮具有重要意義。

混合譜系激酶3（mixed lineage kinase 3，MLK3）是MAPK級聯(lián)反應中重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛表達于骨骼肌、肺、肝及心臟等組織。MLK3通過激活MAPK下游成員c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）及p38 MAPK等，調控細胞增殖、分化和凋亡［6］。MLK3基因敲除（MLK3gene knockout，MLK3KO）小鼠心臟功能下降，心臟纖維化加重［7-8］。但MLK3在骨骼肌損傷再生中的作用未見報道。本研究在MLK3KO小鼠及野生型（wild-type，WT）小鼠中建立骨骼肌損傷再生模型，探討MLK3在骨骼肌再生中的作用及其機制。

材料和方法

1 動物

10～12周齡SPF級雄性C57BL6/J小鼠購自北京唯尚立德公司，以C57BL6/J為背景的MLK3KO小鼠由上海邦耀公司協(xié)助構建，均飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院SPF級動物房，動物實驗均遵守本醫(yī)院實驗動物管理委員會的相關規(guī)定。

2 主要試劑

蛇毒心臟毒素（cardiotoxin，CTX）購自Merck；MLK3抗體（#4370S）、p-ERK1/2抗體（#4370）、ERK1/2抗體（#4695）、p-JNK抗體（#4668）、JNK抗體（#9252）、p-p38抗體（#4511）及p38抗體（#9212）均購自Cell Signaling Technology；配對盒蛋白7（paired box protein 7，PAX7）抗體（AB_528428）購自Developmental Studies Hybridoma Bank；麥胚凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）抗體購自Sigma；Alexa Fluor 555和Alexa Fluor 488熒光Ⅱ抗購自Jackson ImmunoResearch；總RNA提取試劑TRIzol購自Invitrogen；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（K1622）和T-PER組織蛋白提取液均購自Thermo Fisher Scientific；SYBR Green Real-Time PCR試劑購自TaKaRa；Masson染色液購自北京索萊寶科技有限公司。

3 主要方法

3.1 骨骼肌損傷模型構建10～12周齡的雄性WT及MLK3KO小鼠麻醉后，脛骨前肌注射CTX（10 μmol/L，30 μL）制備骨骼肌損傷模型［9］。

3.2 RNA提取及RT-qPCR使用TRIzol法提取成纖維細胞或小鼠脛骨前肌總RNA。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit將2 μg總RNA逆轉錄成cDNA，步驟如下：RNA與Oligo dT混合后，65℃孵育5 min，加入逆轉錄酶及緩沖液，42℃60 min進行逆轉錄反應，70℃5 min滅活逆轉錄酶。得到的cDNA在iQ5系統(tǒng)（Bio-Rad）中使用SYBR試劑進行實時熒光定量PCR。以GAPDH為內參照，目標基因表達水平以2-ΔΔCt法進行計算。MLK3的上游引物序列為5′-CCCTTTGCACAACTCATGGC-3′，下 游 引物 序列為5′-GAATGGAAGGAGTCCCGTGG-3′；Myog的上游引物序列為5′-CAGCCCAGCGAGGGAATTTA-3′，下游引物序列為5′-AGAAGCTCCTGAGTTTGCCC-3′；Myod的上游引物序列為5′-AGCATAGTGGAGCGCATCTC-3′，下游引物序列為5′-GGTCTGGGTTCCCTGTTCTG-3′；GAPDH的上游引物序列為5′-AATGCATCCTGCACCACC-3′，下游引物序列為5′-ATGCCAGTGAGCTTCCCG-3′。

3.3 Western blot實 驗分離CTX處 理 的WT及MLK3KO小鼠脛骨前肌，T-PER組織裂解液（補充0.5 mol/L EDTA、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）提取總蛋白后，用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白濃度測定。將總量為80 μg的蛋白經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后電轉至硝酸纖維素膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入MLK3、p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK、JNK、p-p38、p38及GAPDH等抗體，4℃孵育過夜。加入Ⅱ抗室溫孵育2 h，使用Odyssey紅外熒光掃描成像儀捕獲目的條帶。目的條帶定量分析采用ImageJ軟件。

3.4 免疫熒光染色收集CTX處理的WT及MLK3KO小鼠脛骨前肌制備冰凍切片，用預冷的冰丙酮固定20 min，室溫晾干20 min后PBS洗，0.3%Triton X-100透化10 min，2次。3% BSA室溫封閉1 h，加入PAX7抗體，4℃過夜，PBS洗3次，加入Alexa Fluor 555熒光二抗，室溫孵育40 min，PBS洗后，DAPI封片。使用Leica ST5激光掃描共聚焦顯微鏡觀察PAX7的熒光強度。

3.5 WGA染色收集CTX處理的WT及MLK3KO小鼠脛骨前肌制備石蠟切片（4 μm），經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟至水后，抗原熱修復，羊血清工作液室溫封閉30 min，滴加1∶100稀釋的WGA抗體，37℃避光孵育1 h，PBS洗后，DAPI封片液封片。倒置熒光電子顯微鏡（Nikon）采集圖像，NIS Br 3.0軟件計算肌纖維橫截面積，每張切片統(tǒng)計200個肌纖維。

3.6 Masson膠原纖維染色將WT及MLK3KO小鼠脛骨前肌石蠟切片脫蠟至水。使用Masson染色液染色，基本步驟如下：鐵蘇木素染色5～10 min，酸性乙醇分化5～15 s；Masson藍化液返藍3～5 min；麗春紅品紅染色5～10 min；磷鉬酸溶液洗1～2 min；苯胺藍染色1～2 min；乙醇脫水、中性樹膠封片。倒置電子顯微鏡（Nikon）采集圖像，膠原纖維呈藍色，骨骼肌細胞呈紅色。NIS Br 3.0軟件計算纖維化面積。

4 統(tǒng)計學分析

用GraphPad Prism 7.0軟件進行統(tǒng)計分析。結果以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。兩組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 骨骼肌損傷后早期MLK3表達水平顯著升高

為探討MLK3是否參與骨骼肌損傷后修復，收集CTX處理0、1、3和5 d的小鼠脛骨前肌，RT-qPCR檢測MLK3的表達變化，發(fā)現(xiàn)CTX處理后3 d骨骼肌中MLK3的mRNA表達顯著升高（P＜0.01），見圖1A；Western blot結果顯示，CTX處理后3 d的骨骼肌中MLK3蛋白表達升高，見圖1B。這提示MLK3可能在骨骼肌損傷后再生過程中發(fā)揮作用。

Figure 1.Mixed lineage kinase 3（MLK3）was up-regulated in regenerating tibial anterior（TA）muscles at early stage after cardiotoxin（CTX）-induced injury.A：MLK3 mRNA levels in TA muscles from wild-type mice at indicated time points after CTX injury（n=6）；B：MLK3 protein expression in regenerating TA muscles at 3 d after injury（n=3）.Mean±SD.**P＜0.01 vs 0 d.圖1 MLK3在骨骼肌損傷修復早期表達升高

2 MLK3缺失導致骨骼肌損傷后再生能力下降

為探討MLK3是否在骨骼肌再生過程發(fā)揮作用，我 們 構 建 了MLK3KO小鼠，Western blot驗證MLK3KO小鼠骨骼肌纖維中無MLK3蛋白表達（圖2A）。進而，WT及MLK3KO小鼠給予CTX處理誘導損傷。損傷后7 d，收集WT及MLK3KO小鼠骨骼肌，WGA染色觀察新生肌纖維大小及排列。未受損的WT及MLK3KO小鼠骨骼肌纖維排列緊密，肌纖維橫截面面積無差別；CTX誘導損傷7 d，MLK3KO小鼠骨骼肌纖維排列較對照組紊亂，新生的骨骼肌肌纖維橫截面面積顯著小于WT小鼠（P＜0.01），見圖2B。這表明MLK3KO小鼠骨骼肌再生能力下降。

3 MLK3基因缺失加重骨骼肌損傷后纖維化

WT及MLK3KO小鼠脛骨前肌給予CTX處理后7 d，受損部位骨骼肌Masson染色評價膠原沉積情況。未損傷時MLK3KO和WT小鼠膠原纖維陽性面積無顯著差異。損傷后7 d，MLK3KO和WT小鼠藍色膠原纖維陽性面積均增加，但MLK3KO小鼠膠原纖維陽性面積顯著高于WT小鼠（P＜0.01），見圖3。這提示MLK3基因缺失加重骨骼肌損傷部位的纖維化。

4 MLK3基因缺失抑制肌衛(wèi)星細胞的增殖和分化

免疫熒光檢測WT及MLK3KO小鼠損傷后3 d骨骼肌中PAX7陽性細胞數(shù)，結果顯示MLK3KO小鼠骨骼肌中PAX7陽性細胞比例顯著低于WT小鼠（P＜0.01），見圖4A。RT-qPCR檢測肌衛(wèi)星細胞分化關鍵基因Myod和Myog的mRNA水平，結果顯示損傷后3 d的WT小鼠骨骼肌中Myod和Myog的表達較未損傷組顯著升高，但MLK3KO小鼠損傷后3 d的骨骼肌中Myod和Myog表達與WT小鼠相比均顯著降低（P＜0.01），見圖4B。上述結果表明MLK3基因缺失抑制肌衛(wèi)星細胞的增殖和分化。

5 MLK3基因缺失抑制ERK1/2活化

Western blot檢 測CTX損 傷 后3 d的WT及MLK3KO小鼠骨骼肌中ERK1/2、JNK及p38磷酸化水平，結果顯示MLK3KO小鼠骨骼肌中磷酸化ERK1/2的水平與WT小鼠相比顯著下降（P＜0.01），但磷酸化JNK及磷酸化p38的水平?jīng)]有顯著差異，見圖5。上述結果表明再生的骨骼肌中MLK3基因缺失抑制ERK1/2信號通路的激活。

Figure 2.MLK3 deficiency resulted in impaired regeneration in injured muscle.A：Western blot analysis of MLK3 protein levels in muscles isolated from WT and MLK3KO mice；B：the WT and MLK3KO muscles were immunostained with WGA（green）at 0 and 7 d after CTX-induced injury（scale bar=20 μm），and the myofiber mean cross-sectional area（CSA）was analyzed（n=6）.Mean±SD.**P＜0.01 vs WT.圖2 MLK3基因缺失鼠骨骼肌損傷后再生能力下降

Figure 3.MLK3 deficiency resulted in increased muscle fibrosis in injured muscle.Masson staining was performed to detect collagen deposition（blue）in TA muscles isolated from WT and MLK3KO mice（scale bar=20 μm），and the ratio of fibrosis area per filed was calculated.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs WT.圖3 MLK3基因缺失加重骨骼肌損傷后纖維化

討 論

骨骼肌損傷后，肌衛(wèi)星細胞的活化、增殖和分化對于骨骼肌再生、促進損傷后修復，維持骨骼肌功能，阻止骨骼肌萎縮至關重要。本研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶MLK3基因缺失抑制肌衛(wèi)星細胞的增殖和分化，導致骨骼肌損傷后再生能力下降，間質纖維化加重，表明MLK3在骨骼肌再生過程中發(fā)揮重要作用。

骨骼肌損傷后修復過程大致分為三個階段：炎癥期（數(shù)小時～7 d）；再生期（2～7 d），肌衛(wèi)星細胞激活、增殖、分化、融合形成新的肌纖維；重塑期（5～30 d），細胞外基質產(chǎn)生、新生肌纖維變大重塑等。其中，骨骼肌損傷后早期肌衛(wèi)星細胞增殖、分化對整個修復至關重要［10］。本研究發(fā)現(xiàn)CTX誘導損傷后早期（3 d）MLK3表達顯著升高，提示MLK3可能參與骨骼肌損傷后再生的早期細胞事件。

Figure 4.MLK3 deficiency impaired the proliferation and differentiation of muscle satellite cells.A：At 3 days after injury，PAX7 positive cells in WT and MLK3KO muscles were detected by immunofluorescence staining for PAX7（scale bar=20 μm），and percentages of PAX7 positive cells per field were analyzed（n=4）；B：the mRNA levels of Myod and Myog in WT and MLK3KO muscles at 0 and 3 d after injury were assessed by RT-qPCR（n=6）.Mean±SD.**P＜0.01 vs WT.圖4 MLK3基因缺失抑制肌衛(wèi)星細胞增殖和分化

Figure 5.MLK3 deficiency inhibited phosphorylation of ERK1/2.Western blot analysis of the phosphorylation levels of ERK1/2，JNK and p38 in WT and MLK3KO muscles at 3 d after injury.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs WT.圖5 MLK3基因缺失抑制ERK1/2磷酸化

骨骼肌再生期肌衛(wèi)星細胞的激活、增殖、分化、融合受到生肌調節(jié)因子（myogenic regulatory factors，MRFs；包括PAX7、MyoD、MyoG等）的序貫表達所嚴格調控。骨骼肌損傷后，靜息的PAX7陽性肌衛(wèi)星細胞活化，轉化為PAX7陽性、MyoD陽性的肌母細胞，繼而分化成MyoG陽性的肌細胞。單個核的肌細胞融合成多個核肌細胞，并與殘留受損的肌纖維融合，形成新的肌纖維，從而完成骨骼肌再生過程［11］。該過程受到細胞內多種信號通路的調控。比如Notch信號激活通過抑制MyoD的表達而抑制分化［3］。MAPK信號通路在骨骼肌再生過程中發(fā)揮重要作用：血管緊張素1結合Tie-2受體，激活下游ERK1/2，促進肌衛(wèi)星細胞的增殖分化［4］。胰島素樣生長因子激活p38，活化的p38介導再生關鍵因子MyoD的表達，促進骨骼肌再生［5］。MLK3作為MAPK級聯(lián)通路中ERK1/2及p38上游的關鍵激酶，其對ERK1/2及p38的激活是否在骨骼肌再生過程中發(fā)揮作用既往未見研究報道。

骨骼肌損傷后，位于肌纖維基底膜和肌膜之間的肌衛(wèi)星細胞增殖、分化，形成新的肌纖維，從而完成骨骼肌再生。PAX7是肌衛(wèi)星細胞的標志物，并且在肌衛(wèi)星細胞的增殖中發(fā)揮重要作用［12］。本研究在損傷后3 d的WT及MLK3KO小鼠骨骼肌中通過免疫熒光觀察肌衛(wèi)星細胞PAX7陽性細胞比例，發(fā)現(xiàn)MLK3KO小鼠PAX7陽性細胞比例下降。PAX7表達于靜息的肌衛(wèi)星細胞及由肌衛(wèi)星細胞分化而來的肌母細胞，PAX7陽性細胞比例下降，提示肌衛(wèi)星細胞增殖及分化能力下降。損傷后3 d，MLK3KO小鼠骨骼肌中分化關鍵基因Myod和Myog的表達下降，進一步證實了MLK3基因缺失導致肌衛(wèi)星細胞增殖及分化能力減弱?；诩韧芯縀RK1/2及p38活化促進肌衛(wèi)星細胞增殖和分化及MLK3對ERK1/2和p38的激活作用，我們推測MLK3可能通過活化ERK1/2或p38促進肌衛(wèi)星細胞的增殖、分化。Western blot檢測CTX損傷后3 d的WT及MLK3KO小鼠骨骼肌中磷酸化ERK1/2和p38水平，顯示MLK3KO小鼠中磷酸化ERK1/2水平下降，而p38磷酸水平?jīng)]有變化，提示MLK3通過激活ERK1/2促進肌衛(wèi)星細胞的增殖和分化。MLK3可以激酶依賴和激酶非依賴的方式激活ERK1/2［6，13］。在肌衛(wèi)星細胞的增殖和分化過程中，MLK3通過何種方式激活ERK1/2還有待探討。另外，骨骼肌損傷再生過程中，何種機制介導了MLK3的表達升高也不清楚，后續(xù)需要深入探討。

綜上所述，本研究結果顯示蛋白激酶MLK3基因缺失通過抑制ERK1/2活化降低骨骼肌損傷后肌衛(wèi)星細胞的增殖和分化，并導致骨骼肌損傷后再生能力受損，表明MLK3通過ERK1/2信號通路在骨骼肌再生中發(fā)揮重要作用，調控該信號通路可能有望成為骨骼肌萎縮的治療新方向。