銅過載介導(dǎo)骨骼肌萎縮的機(jī)制及治療新進(jìn)展*

楊 威，李 暢，鄧云鋒，胡 昊，王 娟，范晶晶△

（1武漢體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)院，湖北武漢430079；2長(zhǎng)沙衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院公共教學(xué)部，湖南長(zhǎng)沙410100；3湖北省中醫(yī)院脊柱外科，湖北武漢430074）

銅是一種必需的微量元素，同時(shí)也是一種過渡金屬，具有氧化還原屬性，通過接受和轉(zhuǎn)移電子并以離子形式參與所有的生物學(xué)事件，對(duì)哺乳動(dòng)物的能量代謝、活性氧去除、鐵吸收和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命過程至關(guān)重要［1］。銅的內(nèi)穩(wěn)態(tài)受肝臟代謝的嚴(yán)格調(diào)控，在糖尿病、肥胖、心力衰竭、神經(jīng)退行性疾病、腫瘤等病理狀態(tài)下表現(xiàn)為含量顯著升高即銅過載；銅過載是細(xì)胞內(nèi)銅代謝失衡而呈現(xiàn)出銅離子毒性的病理過程，是多種疾病干預(yù)的重要靶點(diǎn)［2-6］。作為人體內(nèi)最大的氨基酸儲(chǔ)存庫(kù)，骨骼肌在動(dòng)力輸出和姿勢(shì)維持上具有不可替代的決定作用，其關(guān)鍵組成部分肌蛋白和線粒體對(duì)外界刺激信號(hào)高度敏感，在多種病理狀態(tài)下銅過載和肌萎縮同步發(fā)生［7-12］，據(jù)此推測(cè)銅代謝異?？赡芘c骨骼肌萎縮存在著某種機(jī)制關(guān)聯(lián)。目前，銅過載介導(dǎo)的骨骼肌萎縮的潛在機(jī)制尚不完全清楚，而多種用于降低機(jī)體銅離子水平的銅螯合藥理學(xué)技術(shù)有顯著發(fā)展，我們?cè)诖耸崂聿⒗L制了銅過載介導(dǎo)肌萎縮的相關(guān)機(jī)制圖譜，為臨床上運(yùn)用銅螯合技術(shù)治療和緩解骨骼肌萎縮提供機(jī)制線索。

1 骨骼肌萎縮發(fā)生及機(jī)制

骨骼肌萎縮是多種慢性疾病如肥胖、糖尿病、心力衰竭、毒品成癮等的常見并發(fā)癥，病理學(xué)表現(xiàn)為肌肉的質(zhì)量丟失和力量衰退，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能與蛋白質(zhì)代謝失衡、神經(jīng)肌肉接頭失活、線粒體丟失等密切聯(lián)系［13］。肌萎縮不僅影響人類的正常步態(tài)和運(yùn)動(dòng)能力，嚴(yán)重威脅生活質(zhì)量，還關(guān)聯(lián)著多種疾病的發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后，決定著多種慢性疾病狀態(tài)下的死亡率［14］。目前的研究顯示，拮抗病理狀態(tài)下的骨骼肌萎縮是治療某些疾病本身的間接療法［15］。因此，探尋骨骼肌萎縮的新型干預(yù)靶點(diǎn)（如銅代謝）而有益于其治療顯得尤為重要。

骨骼肌是以氨基酸為基本組成單位、富含線粒體的運(yùn)動(dòng)器官，在正常成人中約占身體質(zhì)量的40%，其質(zhì)量維持是骨骼肌發(fā)揮代謝功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。骨骼肌可對(duì)外界病理刺激信號(hào)做出響應(yīng)并形成萎縮表型，肌蛋白質(zhì)和線粒體的穩(wěn)態(tài)失衡是其發(fā)生萎縮的根本誘因［16］。正常生理狀態(tài)下，骨骼肌蛋白質(zhì)處于不斷合成與降解的動(dòng)態(tài)平衡中，同時(shí)線粒體通過不斷融合與分裂實(shí)現(xiàn)其質(zhì)量控制，病理?xiàng)l件能夠打破相關(guān)的代謝平衡，誘導(dǎo)肌蛋白的降解多于合成、線粒體的分裂多于融合，即發(fā)生肌萎縮。這些代謝程序涉及到不同的調(diào)控機(jī)制，其中骨骼肌蛋白質(zhì)合成主要依靠生長(zhǎng)因子（如睪酮、生長(zhǎng)激素、胰島素樣生長(zhǎng)因子）介導(dǎo)的促合成信號(hào)，降解則主要依靠泛素-蛋白酶體、自噬、凋亡以及鈣蛋白酶的活動(dòng)等降解途徑；線粒體的融合與分裂則是通過各自的上游靶點(diǎn)蛋白即線粒體融合蛋白和分裂蛋白的動(dòng)態(tài)平衡來予以精確控制［17］。這些機(jī)制信號(hào)是骨骼肌萎縮治療藥物研發(fā)的關(guān)鍵理論基礎(chǔ)。

2 銅過載與骨骼肌萎縮

2.1 骨骼肌中銅的來源及作用銅是機(jī)體內(nèi)多種必需酶的輔助因子，以離子形式參與細(xì)胞內(nèi)所有的生化反應(yīng)，對(duì)于維持器官的正常代謝至關(guān)重要，細(xì)胞內(nèi)銅離子代謝穩(wěn)態(tài)接受銅轉(zhuǎn)運(yùn)體和伴侶蛋白的共同調(diào)控，其中轉(zhuǎn)運(yùn)體基因7A型銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶（copper-transporting ATPase 7A，ATP7A）和7B型銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶（copper-transporting ATPase 7B，ATP7B）的突變會(huì)導(dǎo)致銅缺失和銅過載而誘發(fā)Menkes病和肝豆?fàn)詈俗冃裕╓ilson?。?8］。外源性銅是機(jī)體內(nèi)銅的主要來源，主要通過食物獲取，這種蛋白結(jié)合型的食源性有機(jī)銅可經(jīng)消化道細(xì)胞吸收至體內(nèi)。銅代謝主要包含兩個(gè)代謝階段：第一階段，食源性銅在人體小腸部位吸收并進(jìn)入血液與血清中的小分子如組氨酸、α2-巨球蛋白、白蛋白等相結(jié)合形成銅貯存池；第二階段，銅貯存池中的銅離子大部分經(jīng)門靜脈入肝經(jīng)過加工以銅藍(lán)蛋白的形式進(jìn)入血液循環(huán)并轉(zhuǎn)運(yùn)分配至全身的銅依賴器官［19］，包括大腦和骨骼肌，剩余部分的銅在血清中依然以與小分子相結(jié)合的形式存在。銅藍(lán)蛋白的降解通常也在肝臟中進(jìn)行，肝內(nèi)皮細(xì)胞可通過轉(zhuǎn)胞吞作用捕獲血清中的銅藍(lán)蛋白，導(dǎo)致其寡糖N端處的唾液酸殘基完整去除，脫唾液酸化的銅藍(lán)蛋白通過脫唾液酸糖蛋白受體的作用隨后被排入狄氏間隙并被肝細(xì)胞所內(nèi)吞，通過肝細(xì)胞溶酶體的降解作用并釋放出銅離子；為了維持銅離子代謝平衡，多余的銅離子可通過肝臟外排進(jìn)入膽汁并被膽汁酸鹽所固化并排出體外，這是銅外排的主要途徑［20］。

銅離子不僅對(duì)于成肌細(xì)胞的增殖和分化必不可少，對(duì)于分化后的肌細(xì)胞維持正常的代謝穩(wěn)態(tài)也至關(guān)重要［21］。作為一種重要的靜態(tài)輔助因子，銅離子可利用自身的氧化還原屬性參與多種銅酶（如氧化還原酶、加氧酶、羥化酶、轉(zhuǎn)移酶等）的構(gòu)建和形成，這些酶類可利用靈活的活化位點(diǎn)來最大化電子轉(zhuǎn)移和傳遞。最經(jīng)典的銅酶是細(xì)胞色素C氧化酶（cytochrome C oxidase，CCO），作為電子傳遞鏈的終端酶，可通過細(xì)胞色素C的氧化和氧的還原來耦合電子傳遞，加強(qiáng)質(zhì)子泵在線粒體膜上的穿梭促進(jìn)ATP的生成［22］。伴隨著電子傳遞過程是氧化壓力的產(chǎn)生，肌細(xì)胞中抵御氧化壓力的重要銅酶是位于胞質(zhì)中的Cu，Zn超氧化物歧化酶（Cu，Zn superoxide dismutase，SOD1），該酶可利用一個(gè)銅離子催化超氧化物的歧化反應(yīng)，從而抑制氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷。銅離子在細(xì)胞中的另一個(gè)存在部位是銅分泌通路的相關(guān)機(jī)制途徑，如高爾基體反面網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（trans-Golgi network，TGN）、內(nèi)吞溶酶體、分泌顆粒和銅儲(chǔ)存囊泡，銅分泌通路使不同類型的細(xì)胞激活銅依賴性激酶執(zhí)行不同的功能。此外，在某些銅依賴細(xì)胞中銅離子還可以調(diào)節(jié)激酶如Unc-51樣蛋白激酶1/2（Unc-51-like protein kinase 1/2，ULK1/2）、絲裂原活化蛋白激酶激酶1（mitogen-activated protein kinase kinase 1，MEK1）和 磷 酸 二 酯 酶3B（phosphodiesterase 3B，PDE3B）的活性，從而影響自噬相關(guān)基因（autophagyrelated genes，ATGs）的表達(dá)、自噬體的形成、增殖和代謝活動(dòng)［20］，其中某些激酶可能涉及到銅過載誘導(dǎo)的骨骼肌細(xì)胞萎縮相關(guān)信號(hào)通路［23］。

2.2 骨骼肌中銅離子代謝的調(diào)控骨骼肌是銅離子高度依賴且代謝旺盛的器官，同時(shí)也是銅的主要分布器官［24］。需銅性器官（包括骨骼?。?duì)銅離子的攝取遵循共同生理原則，由細(xì)胞內(nèi)銅轉(zhuǎn)運(yùn)體（copper transporter，CTR）和銅伴侶蛋白共同調(diào)控，其中銅轉(zhuǎn)運(yùn)體（CTR1、CTR2和CTR3）負(fù)責(zé)銅離子的攝取，將經(jīng)細(xì)胞膜上特定還原酶還原的銅離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)。另兩種銅轉(zhuǎn)運(yùn)體ATP7A和ATP7B的表達(dá)具有組織差異性，除了肝細(xì)胞，在大多數(shù)細(xì)胞中ATP7A的表達(dá)比ATP7B要豐富［24］，兩者主要負(fù)責(zé)胞內(nèi)銅離子的分布、儲(chǔ)存和排出。銅伴侶蛋白則可以與胞內(nèi)銅離子相結(jié)合而抵消中和其毒性并將其傳遞給特定的靶蛋白，最重要的三種銅伴侶蛋白包括細(xì)胞色素C氧化酶17（cytochrome C oxidase 17，COX17）、抗氧化1銅伴侶（antioxidant 1 copper chaperone，ATOX1）和超氧化物歧化酶型銅伴侶（copper chaperone for superoxide dismutase，CCS），不同的銅伴侶蛋白在胞內(nèi)介導(dǎo)不同的銅離子傳遞通路。

銅離子在骨骼肌中的代謝涉及銅轉(zhuǎn)運(yùn)體和銅伴侶蛋白的調(diào)控，其中CTR1、ATP7A和ATP7B已被證明在骨骼肌細(xì)胞廣泛表達(dá)［25］。CTR1是最重要的銅攝入轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，而CTR2的表達(dá)具有細(xì)胞特異性，可能更多地涉及到細(xì)胞內(nèi)的銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)，但在肌細(xì)胞中的表達(dá)情況及其調(diào)節(jié)銅離子攝入的相關(guān)機(jī)制尚不清楚。人類的CTR1由190個(gè)氨基酸和含有特定的金屬連接序列的片斷組成，其中的蛋氨酸43和45區(qū)域是介導(dǎo)銅離子攝取的關(guān)鍵［26］，可通過內(nèi)吞和離膜性位置遷移來調(diào)節(jié)膜上CTR1的表達(dá)和豐度調(diào)控細(xì)胞銅離子攝取，當(dāng)胞內(nèi)銅離子含量升高時(shí)，細(xì)胞會(huì)增強(qiáng)網(wǎng)格蛋白（clathrin）和發(fā)動(dòng)蛋白（dynamin）依賴的內(nèi)吞作用，降低細(xì)胞膜上CTR1的豐度，同時(shí)會(huì)向遠(yuǎn)離膜邊緣的方向進(jìn)行位置遷移，兩方面共同作用可抑制細(xì)胞對(duì)銅離子的捕獲和攝取［24］，避免銅過載對(duì)細(xì)胞的損傷，這種自動(dòng)化感應(yīng)機(jī)制可能是通過特異蛋白1（specificity protein 1，Sp1）作為中間物來介導(dǎo)完成的［27］。銅離子通過CTR1入胞后與其分離，隨后利用不同的銅伴侶蛋白介導(dǎo)多種銅離子傳遞途徑，其中COX17和非蛋白配體CuL對(duì)線粒體靶向的銅離子傳遞發(fā)揮紐帶作用。COX17通過還原其自身的半胱氨酸殘基與銅離子結(jié)合，將銅離子傳遞至線粒體膜間隙，并與兩種細(xì)胞色素C氧化酶合成蛋白（synthesis of cytochrome C oxidase proteins，SCO）——SCO1和SCO2相互作用參與CCO代謝途徑［28］；胞質(zhì)中的CuL與銅離子結(jié)合后可穿過線粒體外膜進(jìn)入膜間隙，用于CCO的裝配、SOD1的成熟及線粒體的進(jìn)一步攝取和儲(chǔ)存［22］，兩者可共同調(diào)控線粒體的銅離子代謝平衡。此外，ATOX1可將銅離子傳遞至分泌途徑膜結(jié)構(gòu)處的ATP7A和ATP7B的N端區(qū)域，增強(qiáng)銅離子分泌途徑的轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)，并調(diào)節(jié)銅離子在細(xì)胞內(nèi)的分布［29］。CCS通過形成一種高度特異性的復(fù)合物將銅離子傳遞至SOD1，并在特異性位點(diǎn)完成金屬取代和雙硫鍵的形成，拮抗超氧化物對(duì)細(xì)胞的損傷［30］。細(xì)胞內(nèi)銅離子的分布主要是通過ATP7A和ATP7B在胞內(nèi)TGN、內(nèi)吞體、黑色體等不同結(jié)構(gòu)間的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，這一步驟對(duì)于銅酶的激活、銅離子的儲(chǔ)存及過量銅離子的排出至關(guān)重要，是細(xì)胞內(nèi)銅穩(wěn)態(tài)調(diào)控的關(guān)鍵［31］。

2.3 銅過載的可能機(jī)制細(xì)胞內(nèi)的銅離子攝取和外流在相關(guān)蛋白包括Ctr1、ATP7A及ATP7B的調(diào)控作用下維持著精確的動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)銅離子攝取作用優(yōu)于外流作用時(shí)，即可發(fā)生銅過載。銅過載是銅離子代謝發(fā)生機(jī)制障礙而呈現(xiàn)銅毒性的生物學(xué)事件，其涉及到多種人類疾病如神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、癌癥等［32］。目前銅過載的準(zhǔn)確調(diào)控機(jī)制尚不清晰，可能涉及到多種不同的信號(hào)通路及分子機(jī)制，是銅代謝生理學(xué)亟待解決的關(guān)鍵問題之一。衰老是銅過載發(fā)生的相關(guān)病理模型，為病理狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)銅過載提供了機(jī)制線索［33］。正常生理狀態(tài)下，胞外銅過載會(huì)引起胞內(nèi)銅穩(wěn)態(tài)調(diào)控相關(guān)的應(yīng)答機(jī)制反應(yīng)：一方面網(wǎng)格蛋白和發(fā)動(dòng)蛋白依賴的內(nèi)吞作用增強(qiáng)，降低細(xì)胞膜上銅轉(zhuǎn)動(dòng)體CTR1的豐度并使其向遠(yuǎn)離膜邊緣的方向進(jìn)行位置遷移，從而抑制細(xì)胞對(duì)銅離子的捕獲和攝取，減少銅離子的入胞效應(yīng)，另一方面，銅轉(zhuǎn)運(yùn)體ATP7A及ATP7B會(huì)加強(qiáng)對(duì)銅離子的排出代謝活動(dòng)，兩者共同作用維持細(xì)胞內(nèi)的銅穩(wěn)態(tài)，避免銅過載的發(fā)生［24］。多種慢病狀態(tài)下可見循環(huán)性銅藍(lán)蛋白的顯著增加，從而對(duì)骨骼肌細(xì)胞形成胞外銅過載，病理狀態(tài)可能通過破壞上述銅穩(wěn)態(tài)維持機(jī)制導(dǎo)致銅離子攝取和排出代謝障礙，進(jìn)而誘發(fā)胞內(nèi)銅過載，氧化還原失衡和自噬功能障礙可能涉及到這一途徑［33］。由此可見，銅過載不是單一因素的調(diào)控結(jié)果，而是多種信號(hào)級(jí)聯(lián)事件的共同作用產(chǎn)生的，深入探究并闡明相關(guān)分子機(jī)制是銅代謝生理下一步的研究方向。

2.4 銅過載在肌肉萎縮中的作用及相關(guān)信號(hào)機(jī)制銅離子不僅參與銅蛋白的構(gòu)建，還可參與機(jī)體內(nèi)糖、脂代謝的調(diào)控。銅缺乏時(shí)胰島素分泌抑制和糖耐量受損揭示了銅在糖穩(wěn)態(tài)維持中的關(guān)鍵性角色［34］，作為一種內(nèi)源性的脂肪分解調(diào)節(jié)器，銅離子可直接結(jié)合PDE3B的半胱氨酸位點(diǎn)并導(dǎo)致其活性抑制，進(jìn)而通過環(huán)腺苷酸依賴的途徑促進(jìn)脂解效應(yīng)［35］。

此外，銅離子參與介導(dǎo)糖與脂肪代謝，高糖環(huán)境可顯著增強(qiáng)銅藍(lán)蛋白對(duì)低密度脂蛋白的氧化作用［36］。骨骼肌是糖類和脂肪代謝的關(guān)鍵器官，骨骼肌萎縮的發(fā)生往往伴隨著能量代謝障礙［37］，銅離子在其中的調(diào)控作用值得關(guān)注。

2.4.1 銅過載通過磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激 酶B（protein kinase B，PKB/Akt）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路抑制骨骼肌蛋白合成PI3K/Akt/mTOR是主導(dǎo)肌蛋白合成的關(guān)鍵信號(hào)通路，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程如下：在生長(zhǎng)因子的作用下，PI3K可磷酸化肌細(xì)胞膜上的二磷酸脂酰肌醇，從而形成三磷酸磷脂酰肌醇，進(jìn)一步引起下游靶點(diǎn)Akt的磷酸化激活。Akt的激活可通過兩條不同的信號(hào)通路誘導(dǎo)肌蛋白合成：一方面可以通過mTOR非依賴性方式直接抑制糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）并活化真核起始因子2B（eukaryotic initiation factor 2B，eIF2B），從而促進(jìn)肌蛋白質(zhì)合成；另一方面，Akt還可磷酸化激活主要由mTOR復(fù)合物1（mTOR complex 1，mTORC1）和mTORC2構(gòu)成的下游靶點(diǎn)mTOR，其中mTORC1具有雷帕霉素敏感性，可磷酸化并活化p70 S6激酶，從而促進(jìn)核糖體S6蛋白的高能磷酸化并最終誘導(dǎo)mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯，促進(jìn)肌蛋白質(zhì)合成；此外，活化的mTORC1還可磷酸化eIF4E結(jié)合蛋白1并抑制其活性，同樣可促進(jìn)mRNA翻譯并增加肌蛋白質(zhì)合成［38］。銅過載可顯著抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路進(jìn)而削弱骨骼肌的蛋白合成，這種效應(yīng)可能是通過氧化應(yīng)激標(biāo)志物活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）來介導(dǎo)的。銅過載是ROS的強(qiáng)力誘導(dǎo)因子，ROS可直接激活NF-κB來促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)抑制素myostatin的高表達(dá)，myostatin可通過某種未知機(jī)制抑制miR-486的表達(dá)，從而激活磷酸酶及張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）的活性，進(jìn)一步抑制Akt的募集與磷酸化［39］。因此，ROS可通過myostatin的介導(dǎo)作用形成miR-486/PTEN/PI3K/Akt信號(hào)級(jí)聯(lián)而抑制肌蛋白合成，這是銅過載誘導(dǎo)骨骼肌萎縮的可能機(jī)制之一。

2.4.2 銅過載擾亂骨骼肌線粒體穩(wěn)態(tài)線粒體是一種銅依賴性細(xì)胞器，每個(gè)線粒體大約含有45 000～50 000個(gè)銅離子，線粒體需要銅離子維持CCO和膜間隙中SOD1的正常代謝功能。銅離子主要分布于線粒體的膜間隙和基質(zhì)中，前者中的銅離子主要依靠銅伴侶蛋白COX17、CCS和替代性配體谷胱甘肽（glutathione，GSH）、非蛋白配體CuL對(duì)胞質(zhì)中銅離子的捕獲及轉(zhuǎn)運(yùn)，后者中的銅離子則僅來源于CuL，其在胞質(zhì)中結(jié)合的銅離子可穿越膜間隙通過位于線粒體內(nèi)膜上的特定銅轉(zhuǎn)運(yùn)受體SLC25A3的介導(dǎo)進(jìn)入基質(zhì)而儲(chǔ)存，在銅離子缺乏時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)釋放至膜間隙和胞質(zhì)中進(jìn)行循環(huán)代謝［22］，但線粒體內(nèi)膜上介導(dǎo)銅離子從基質(zhì)轉(zhuǎn)出至膜間隙的銅轉(zhuǎn)運(yùn)受體目前尚不明確。銅穩(wěn)態(tài)對(duì)于骨骼肌線粒體維持正常的融合與分裂代謝至關(guān)重要，銅離子參與CCO的電子傳遞活動(dòng)及線粒體的氧化磷酸化生成ATP的程序［40］，病理狀態(tài)可引起線粒體總量、數(shù)目和功能的重塑與改變，間接影響肌肉的力量輸出和質(zhì)量維持，銅過載在其中的調(diào)控作用值得關(guān)注。

線粒體依賴自身不斷進(jìn)行的融合與分裂以應(yīng)對(duì)生理環(huán)境的改變和病理環(huán)境的刺激，融合與分裂的動(dòng)態(tài)平衡可形成利于ATP生成的最佳線粒體功能網(wǎng)絡(luò)［41］。融合是指不同線粒體在融合蛋白的作用下產(chǎn)生連接從而引起其內(nèi)容物包括代謝物、蛋白、mtDNA的混合和重新分配，其主要接受線粒體融合蛋白1/2（mitofusin 1/2，MFN1/2）及視神經(jīng)萎縮蛋白1/2（optical atrophy 1/2，OPA1/2）的調(diào)控，融合時(shí)兩側(cè)反應(yīng)的線粒體膜是相同的，屬于同源融合，其中MFN1/2主導(dǎo)外膜融合而OPA1/2主導(dǎo)內(nèi)膜融合［42］，MFN1/2的抑制足以誘導(dǎo)線粒體缺失性mtDNA堆集和肌肉萎縮［43］，由此可見，線粒體融合對(duì)于骨骼肌質(zhì)量維持至關(guān)重要，融合缺陷是骨骼肌萎縮的重要誘因；分裂是指線粒體在分裂蛋白的作用下將不可逆損傷或不必要部分進(jìn)行網(wǎng)格化隔離，以便于通過自噬-溶酶體途徑進(jìn)行降解和清除［44］，其主要通過細(xì)胞質(zhì)中的發(fā)動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白1（dynamin-related protein 1，DRP1）與位于線粒體外膜上的對(duì)應(yīng)受體包括線粒體裂變因子1（mitochondrial fission factor 1，MFF1）、裂變蛋白1（fission protein 1，F(xiàn)IS1）、49/51 kD線粒體動(dòng)力蛋白（mitochondrial dynamics proteins of 49/51 kD，MiD49/51）的結(jié)合并觸發(fā)相關(guān)信號(hào)級(jí)聯(lián)來完成。線粒體分裂狀態(tài)與骨骼肌質(zhì)量密切聯(lián)系，裂變的過度激活也會(huì)產(chǎn)生蛋白過度分解、線粒體功能缺陷和肌萎縮表型［45］。

融合與分裂失衡是異常線粒體產(chǎn)生的主要來源，同時(shí)也是骨骼肌萎縮的前體誘因。銅過載擾亂線粒體質(zhì)量控制是通過兩方面的途徑實(shí)現(xiàn)的：一方面，銅過載可通過ROS的介導(dǎo)顯著上調(diào)骨骼肌中DRP1 mRNA和蛋白表達(dá)水平并抑制MFN1/2及OPA1的表達(dá)，同時(shí)引起線粒體形態(tài)異常［46］；另外，銅離子是MEK1/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號(hào)的激動(dòng)劑，活化的ERK可通過調(diào)節(jié)MFN1的寡聚化而抑制線粒體融合并促進(jìn)分裂［38］。這些證據(jù)提示銅過載可削弱線粒體融合并加劇分裂，同時(shí)可引起線粒體結(jié)構(gòu)異常和功能缺陷，是肌肉萎縮的可能機(jī)理。

2.4.3 銅過載通過ULK1/2介導(dǎo)骨骼肌自噬程序的過度激活自噬是指細(xì)胞將自己細(xì)胞質(zhì)的一部分（如線粒體和毒性蛋白）包裹起來形成自體吞噬泡，進(jìn)而被轉(zhuǎn)移至溶酶體依靠水解酶將其分解成氨基酸等代謝產(chǎn)物。適度的細(xì)胞自噬有助于骨骼肌蛋白和線粒體的更新和穩(wěn)態(tài)維持，自噬過度激活則會(huì)誘導(dǎo)肌肉丟失萎縮［47］。ULK1/2是高度保守的絲/蘇氨酸激酶活性的蛋白，ULK1/2蛋白激酶、200 kD的黏著斑激酶家族相互作用蛋白（focal adhesion kinase family interacting protein of 200 kD，F(xiàn)IP200）、ATG13和ATG101構(gòu)成的Atg1復(fù)合物是哺乳動(dòng)物細(xì)胞自噬的啟動(dòng)子，可通過激活自噬相關(guān)蛋白泛素樣結(jié)合系統(tǒng)來促進(jìn)自噬體雙膜結(jié)構(gòu)的形成和延展，ULK1/2的第180位蘇氨酸磷酸化及去磷酸化是這一細(xì)胞程序發(fā)生的關(guān)鍵［20］，銅過載在誘導(dǎo)自噬程序中扮演著重要角色，這一途徑可能涉及到直接和間接兩種機(jī)制：一方面，銅離子是ULK1/2激酶的重要調(diào)控因子，ULK1/2上含有銅共價(jià)結(jié)合的氨基酸殘基序列并可直接與銅離子連接，ULK1/2銅連接位點(diǎn)的突變會(huì)使其失活并喪失對(duì)下游底物ATG13的激活能力，同時(shí)銅螯合處理或廢除銅離子和ULK1/2的相互作用會(huì)導(dǎo)致自噬抑制，這些結(jié)果表明銅過載可直接激活ULK1而加劇自噬活動(dòng)；另一方面，氨基酸和能量狀態(tài)是ULK1/2的重要上游調(diào)控因子，可分別通過mTORC1和AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）來調(diào)控ULK1/2介導(dǎo)的自噬活動(dòng)，銅過載可顯著抑制骨骼肌細(xì)胞的Akt/mTORC1并伴有自噬相關(guān)基因下游底物beclin-1的磷酸化及自噬激活［48］。上述證據(jù)確認(rèn)了ULK1/2在銅過載激活細(xì)胞自噬而誘導(dǎo)骨骼肌丟失中的關(guān)鍵性角色，可此研究基礎(chǔ)上以肌細(xì)胞為模型的進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2.4.4 銅過載促進(jìn)細(xì)胞凋亡參與肌肉萎縮細(xì)胞凋亡是一種程序性的細(xì)胞死亡過程，受調(diào)節(jié)蛋白、內(nèi)切酶、蛋白酶抑制劑和半胱天冬酶caspase的共同調(diào)控并引起下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，形成凋亡小體，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生非炎癥性自我毀滅［49］。細(xì)胞死亡刺激時(shí)，啟動(dòng)型caspase（即caspase-8、-9和-12）被動(dòng)員和活化，激活執(zhí)行型caspase（即caspase-3、-6和-7）并誘發(fā)細(xì)胞降解和DNA碎片化。根據(jù)刺激信號(hào)的來源可區(qū)分為外源性凋亡和內(nèi)源性凋亡，外源性凋亡是由細(xì)胞表面死亡受體（如腫瘤壞死因子受體）與其配體（如腫瘤壞死因子α）的相互作用觸發(fā)的，內(nèi)源性凋亡涉及線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的參與，其主要誘導(dǎo)因子包括DNA損傷、缺氧和代謝應(yīng)激。值得注意的是，線粒體可以通過不依賴caspase的激活，即釋放凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-inducing factor，AIF）和內(nèi)切酶G對(duì)DNA進(jìn)行切割和碎片化誘導(dǎo)凋亡發(fā)生［50］。在骨骼肌中，由于肌細(xì)胞的多核特性，凋亡級(jí)聯(lián)信號(hào)的激活會(huì)導(dǎo)致單個(gè)肌核和部分肌漿的清除，這一過程被稱為肌核凋亡，肌核凋亡不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡但會(huì)誘導(dǎo)肌纖維萎縮。此外，研究顯示凋亡信號(hào)還可能通過激活泛素-蛋白酶體系統(tǒng)觸發(fā)肌蛋白降解程序，誘導(dǎo)肌纖維萎縮［51］。事實(shí)上，肌肉萎縮時(shí)通常伴隨著凋亡和蛋白質(zhì)降解的同步發(fā)生。骨骼肌肌纖維的另一個(gè)特點(diǎn)在于存在兩個(gè)在生物能量和結(jié)構(gòu)上截然不同的線粒體亞群：位于肌膜下的線粒體和肌纖維中的線粒體。這兩個(gè)亞群對(duì)凋亡刺激呈現(xiàn)出不同的易感性，因此可能分別參與了骨骼肌萎縮的不同發(fā)病機(jī)制［52］。

銅過載與凋亡發(fā)生的相關(guān)研究尚不多見，人類細(xì)胞模型顯示，高劑量的銅離子處理會(huì)誘發(fā)核仁磷酸蛋白和纖維原蛋白在核質(zhì)中的異常分布，損害核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）的加工處理，觀察到來自A2位點(diǎn)切割的異常34S rRNA增加，下游的pre-rRNA減少，60S亞基的積累不足，進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組分析顯示銅過載還可擾亂核糖體生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，最終通過誘導(dǎo)核仁壓力和p53非依賴性途徑來促使細(xì)胞凋亡［53］。在骨骼肌樣本中，銅過載不僅可直接促使肌溶解，還可通過同時(shí)激活啟動(dòng)型caspase-12、執(zhí)行型caspase-3及多種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力相關(guān)蛋白的表達(dá)等途徑來增加內(nèi)網(wǎng)質(zhì)壓力而誘發(fā)細(xì)胞凋亡［54］，據(jù)此推測(cè)銅過載引起的肌纖維降解丟失可能主要是通過內(nèi)源性凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的，外源性凋亡、肌核凋亡、線粒體亞群的差異性紊亂是否參與這一病理程序尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2.4.5 銅死亡（cuproptosis）在肌肉萎縮中的可能作用銅死亡是一種不同于凋亡、焦亡、壞死及鐵死亡的新型細(xì)胞死亡形式［55］，是繼鐵死亡（ferroptosis）之后又一金屬離子相關(guān)的死亡途徑。缺氧可抑制銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，這一效應(yīng)可被低氧誘導(dǎo)因子脯氨酰羥化酶抑制劑所阻斷，同時(shí)糖酵解條件下細(xì)胞呈現(xiàn)對(duì)銅離子殺傷作用的抵抗，這些證據(jù)表明細(xì)胞呼吸是介導(dǎo)銅死亡發(fā)生的關(guān)鍵，對(duì)銅離子暴露的ABC1細(xì)胞代謝物進(jìn)行分析后觀察到多種與三羧酸循環(huán)相關(guān)的代謝途徑紊亂，而對(duì)銅離子呈現(xiàn)抗性的A549細(xì)胞則無變化，暗示銅死亡與線粒體代謝之間的密切關(guān)聯(lián)。采用全基因組成簇的規(guī)律性間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspersed short palindromic repeats，CRISPR）技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)鐵氧化還原蛋白1（ferredoxin 1，F(xiàn)DX1）和蛋白質(zhì)脂?；倾~過載誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵調(diào)控因子，F(xiàn)DX1負(fù)責(zé)編碼的一種還原酶可將二價(jià)銅離子還原為更具毒性的一價(jià)銅離子，蛋白質(zhì)脂?；饕l(fā)生在調(diào)節(jié)三羧酸循環(huán)的四種酶上，是一種高度保守的賴氨酸翻譯后修飾。同時(shí)，鑒于FDX1基因敲除可通過抑制丙酮酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶的三羧酸循環(huán)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)脂?；耆珕适В砻鱂DX1是蛋白質(zhì)脂?；纳嫌握{(diào)控因子。進(jìn)一步的研究顯示，銅離子可直接結(jié)合并誘導(dǎo)脂?；亩淞蛐了徂D(zhuǎn)乙?；傅墓丫刍?，同時(shí)導(dǎo)致鐵硫簇蛋白的失衡觸發(fā)蛋白毒性應(yīng)激?？傊~死亡主要是通過銅離子與三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）的脂?；煞种苯咏Y(jié)合而發(fā)生，這可促使脂?；鞍拙奂丸F硫簇蛋白丟失，從而誘發(fā)蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激并導(dǎo)致細(xì)胞死亡［56］。目前對(duì)于銅過載狀態(tài)下骨骼肌細(xì)胞的銅死亡機(jī)制尚不清晰，根據(jù)現(xiàn)有的研究證據(jù)，銅過載介導(dǎo)肌萎縮的可能機(jī)制如圖1所示。

Figure 1.The mechanism pathways of copper overload-mediated skeletal muscle atrophy.ROS：reactive oxygen species；PTEN：phosphatase and tensin homolog；PI3K：phosphatidylinositol 3-kinase；Akt：protein kinase B；mTORC1：mammalian target of rapamycin complex 1；GSK3β：glycogen synthase kinase 3β；eIF2B：eukaryotic initiation factor 2B；eIF4EBP1：eukaryotic initiation factor 4E-binding protein 1；p70S6K：70 kD ribosomal protein S6 kinase；Drp1：dynamin-related protein 1；MFN1/2：mitofusin 1/2；OPA1：optical atrophy 1；FDX1：ferredoxin 1；TCA：tricarboxylic acid cycle；ULK1/2：Unc-51-like protein kinase 1/2.圖1銅過載介導(dǎo)肌萎縮的機(jī)制通路

3 降銅治療方案

上述研究表明，銅過載與肌萎縮具有內(nèi)在機(jī)制上關(guān)聯(lián)性，推測(cè)利用銅螯合降銅離子水平可能是延緩肌萎縮的有效手段。Wilson病是銅過載的經(jīng)典病理模型，銅螯合及其替代性方案對(duì)于其臨床治療具有顯著意義［57］。銅螯合劑通常是一類具有特殊結(jié)構(gòu)的化合物，其能夠特異地結(jié)合銅離子并形成穩(wěn)定的復(fù)雜環(huán)狀結(jié)構(gòu)。銅螯合劑調(diào)控機(jī)體內(nèi)過高的銅水平涉及不同的機(jī)制，其中青霉胺、曲恩汀和二巰基琥珀酸可通過與銅離子形成復(fù)合物并隨尿液排出，而四硫鉬酸鹽則是促進(jìn)膽道銅離子的排泄實(shí)現(xiàn)降銅效應(yīng)。此外，鋅作為人體所必需的另一種微量元素，可通過誘導(dǎo)金屬硫蛋白的高表達(dá)進(jìn)而緊密連結(jié)銅離子并被腸上皮細(xì)胞捕獲，最終通過芽脫落的形式促進(jìn)銅離子的清除［58］，作為銅離子的有效螯合劑，補(bǔ)充鋅劑是實(shí)現(xiàn)降銅效果的一種輔助替代方案。

低銅飲食是降銅治療的重要方法，銅在不同類型食物中的豐度具有廣譜差異性，通常在動(dòng)物肝臟、貝類水產(chǎn)、豆類、堅(jiān)果及奶酪中含量較高［59］。鑒于銅超載在肌萎縮中的可能角色，制定健康科學(xué)食譜，避免攝入高銅食物對(duì)于防止肌肉萎縮是必要的。銅螯合劑由于其特殊的生物化學(xué)性質(zhì)導(dǎo)致其具有一定的細(xì)胞毒性而呈現(xiàn)出不同的副作用［60-61］。目前尚未檢測(cè)到天然的銅螯合劑，但多種可食用性天然化合物顯示出拮抗銅過載的巨大潛力：在黑腹果蠅模型中，姜黃素對(duì)銅離子過載誘導(dǎo)的氧化壓力和線粒體凋亡具有抑制效應(yīng)［62］；火龍果提取物能夠改善秀麗桿線蟲和斑馬魚模型中的抗氧化系統(tǒng)，削弱銅過載狀態(tài)下的細(xì)胞死亡和脂質(zhì)過氧化［63-64］。這些證據(jù)揭示某些天然化合物作為食物補(bǔ)充物在預(yù)防銅氧化損傷，修復(fù)臨床銅中毒中具有潛在的應(yīng)用前景和常用價(jià)值，尋找綠色天然的降銅物質(zhì)改善肌萎縮是食品科學(xué)研究領(lǐng)域未來的努力方向。

4 總結(jié)與展望

越來越多研究觀察到體內(nèi)銅離子代謝異常會(huì)導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生發(fā)展，包括肥胖癥、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、腫瘤等［65］，銅過載參與肌萎縮的相關(guān)機(jī)制逐漸引起關(guān)注。肝臟是外源性銅攝取及內(nèi)源性銅離子穩(wěn)態(tài)調(diào)控的關(guān)鍵器官，糖尿病、心力衰竭、癌癥狀態(tài)時(shí)的能量代謝障礙通常伴隨著肝臟應(yīng)激代償并主要以銅藍(lán)蛋白的形式形成胞外銅超載，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)銅離子穩(wěn)態(tài)調(diào)控的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白CTR1、ATP7A、ATP7B不足以代謝過多的銅離子時(shí)會(huì)形成胞內(nèi)銅過載并觸發(fā)相關(guān)的病理程序。本文首次結(jié)合相關(guān)研究證據(jù)，對(duì)銅過載誘導(dǎo)肌萎縮的信號(hào)通路及可能機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)歸納闡述（圖1）。鑒于骨骼肌是哺乳類動(dòng)物最大的氨基酸儲(chǔ)存庫(kù)，顯示銅離子作為中間介導(dǎo)物調(diào)節(jié)機(jī)體能量障礙時(shí)的氨基酸代謝、通過其自身穩(wěn)態(tài)調(diào)控充當(dāng)能量傳感器的新穎角色，此外，骨骼肌作為一種內(nèi)分泌和解毒器官，可通過分泌多種肌細(xì)胞因子如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21（fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF-21）、鳶尾素（irisin）、肌肉素（musclin）及Apelin肽，同時(shí)在運(yùn)動(dòng)時(shí)通過促進(jìn)有毒的犬尿氨酸轉(zhuǎn)化為抗氧化的犬尿酸參與肝臟的能量代謝和相關(guān)病理調(diào)控［66-69］，由此可見，深化銅生理研究對(duì)于建立和推動(dòng)“肝-肌軸”理論學(xué)說具有重要學(xué)術(shù)價(jià)值（圖2）。

Figure 2.The metabolism mechanism of copper overload-mediated liver-brain axis.FGF21：fibroblast growth factor 21；CTR1：copper transporter 1；ATP7A/7B：copper-transporting ATPase 7A/7B；KYN：kynurenine；KYNA：kynurenic acid；KAT：kynurenine aminotransferases.圖2銅過載介導(dǎo)的肝-腦軸代謝機(jī)制圖

事實(shí)上，銅過載作為氧化應(yīng)激ROS的強(qiáng)力誘導(dǎo)因子，與骨骼肌蛋白質(zhì)代謝紊亂和線粒體功能失調(diào)的相關(guān)機(jī)制緊密相連：一方面，ROS可激活肌肉萎縮盒F基因（muscle atrophy F-box，MAFbx）和肌肉環(huán)狀指基因1（muscle ring finger 1，MuRF l）參與的泛素蛋白酶體和Ca2+依賴的蛋白酶體的活性，加劇骨骼肌蛋白質(zhì)丟失；另一方面，ROS可通過抑制沉默信息調(diào)節(jié)子（silent information regulator 1，SIRT1）/過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）信號(hào)通路而降低線粒體的生物合成，并通過觸發(fā)線粒體DNA損傷、電子轉(zhuǎn)移鏈和膜電位的異常等途徑加劇線粒體的降解、丟失［70］，其與銅過載誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮的機(jī)制關(guān)聯(lián)性有待進(jìn)一步研究。

本文首次關(guān)注銅過載在肌萎縮中的作用，為銅螯合改善肌萎縮提供了機(jī)制基礎(chǔ)?；谝陨侠碚摚捎勉~螯合劑可能是治療和改善多種病理狀態(tài)下肌萎縮的一種潛力療法，具體療效尚需進(jìn)一步的臨床驗(yàn)證。