基于細(xì)胞代謝組學(xué)的藥物研究方法及應(yīng)用*

王艷麗，劉春花，潘 潔，孫 佳，劉 亭，李勇軍2，，陸 苑△

（1貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550004；2貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽550004；3貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州貴陽550004）

生命科學(xué)研究促進(jìn)了組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，除了基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組可以從基因和蛋白功能等方面揭示生命科學(xué)活動外，生物體內(nèi)還存在著十分精細(xì)的調(diào)控體系，既有直接參與能量代謝的糖類、脂質(zhì)及其中間代謝物，也有對新陳代謝起重要調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)，它們在體內(nèi)形成相互關(guān)聯(lián)的代謝網(wǎng)絡(luò)，共同參與對生命活動的調(diào)控。對于這些物質(zhì)的研究，傳統(tǒng)方法以生理學(xué)和藥理學(xué)結(jié)合的針對性研究為主，缺乏高通量的整體研究技術(shù)，基于此代謝組學(xué)應(yīng)運(yùn)而生［1］。代謝組學(xué)通過動態(tài)監(jiān)測細(xì)胞、組織或其它生物體系受刺激或擾動后（某個(gè)特定的基因變異或環(huán)境變化），相對分子質(zhì)量小于1 000的內(nèi)源性小分子的變化，以此闡明生物體系的代謝途徑、揭示機(jī)體生命活動代謝本質(zhì)［2］。不同組學(xué)在解釋生命活動變化中具有不同的側(cè)重點(diǎn)，其中代謝組學(xué)處于生物流調(diào)控的末端，更接近疾病表型。與其它組學(xué)相比，代謝組學(xué)研究具有以下特點(diǎn)（表1），已成為系統(tǒng)生物學(xué)研究的重要手段［3］。

表1 代謝組學(xué)技術(shù)的特征優(yōu)勢Table 1.Features and advantages of metabolomics study

細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，其代謝物組成是遺傳特征、基因表達(dá)調(diào)控、蛋白質(zhì)表達(dá)和環(huán)境影響共同調(diào)控的結(jié)果［4］。細(xì)胞代謝組學(xué)可通過對不同生理狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)外小分子代謝物的定性、定量分析，找出與疾病發(fā)生和治療相關(guān)的關(guān)鍵代謝物，解釋作用機(jī)制。

目前代謝組學(xué)的研究大多基于動物樣本（血液、尿液及組織等）進(jìn)行，但其與人類的種屬差異性以及代謝物極易受多種因素影響（如年齡、外界環(huán)境等），都會使實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生偏差［5］。而細(xì)胞代謝組學(xué)則可借助于各種人源細(xì)胞模型，直接反映細(xì)胞生命活動的生物標(biāo)志物信息。此外，細(xì)胞受外界因素影響較小、實(shí)驗(yàn)變化易于控制、實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性高、成本較低、結(jié)果更易解釋，其代謝組學(xué)研究已被廣泛應(yīng)用于藥物機(jī)制探究、毒理學(xué)評價(jià)以及中藥活性成分篩選等領(lǐng)域［6-7］。本文將對其從研究流程和相關(guān)應(yīng)用等方面進(jìn)行相應(yīng)的論述，旨在更全面地理解細(xì)胞代謝組學(xué)的研究發(fā)展。

1 細(xì)胞代謝組學(xué)的研究流程

細(xì)胞代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)是對細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外代謝物的定性、定量分析過程，主要流程為細(xì)胞處理、數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)分析和代謝標(biāo)志物分析（圖1）。

Figure 1.Research process of cell metabolomics.圖1細(xì)胞代謝組學(xué)研究流程

1.1 細(xì)胞處理簡單、快速且重現(xiàn)性好的處理方案是細(xì)胞代謝組學(xué)研究的基本要求。為此，研究人員需從以下因素進(jìn)行考慮。

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞代謝組學(xué)研究通常選擇各種哺乳動物細(xì)胞，包括原代細(xì)胞和可連續(xù)傳代的細(xì)胞系。原代細(xì)胞保留了原有組織中大部分表型特征，可反映體內(nèi)環(huán)境，是探究特定組織代謝和生化途徑的首選體外模型［8］。然而由于原代細(xì)胞樣本來源珍貴，特別是人類來源的原代細(xì)胞，細(xì)胞增殖速度慢且培養(yǎng)條件較嚴(yán)格，一定程度上限制了其在代謝組學(xué)研究中的應(yīng)用。盡管其他來源細(xì)胞系（如肝、腎、肺、血、卵巢等）的代謝功能不同于原代細(xì)胞，但它們具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如易處理、幾乎無限的壽命、標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)條件以及不依賴于供體特征的穩(wěn)定表型等，這使得其在代謝組學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用［9］。

無論是原代細(xì)胞還是細(xì)胞系，合適的培養(yǎng)條件始終是細(xì)胞生長繁殖所必需的，因此培養(yǎng)基配方對細(xì)胞功能和新陳代謝的影響不容忽視。一項(xiàng)腫瘤細(xì)胞代謝組學(xué)研究中對比了199培養(yǎng)基、199培養(yǎng)基含2%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基含2%胎牛血清以及克-漢二氏重碳酸鹽緩沖液，5種不同培養(yǎng)基對代謝物的影響，結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外代謝物種類和含量均有不同程度的改變［10］。另外，一項(xiàng)基于核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術(shù)的人胰腺癌細(xì)胞系的代謝組學(xué)研究也揭示培養(yǎng)基會顯著影響細(xì)胞的代謝輪廓特征，因此在設(shè)計(jì)代謝分析研究時(shí)應(yīng)將培養(yǎng)基視為一個(gè)重要變量［11］。

在細(xì)胞培養(yǎng)研究中，一般認(rèn)為純化學(xué)合成培養(yǎng)基優(yōu)于天然培養(yǎng)基。合成的純化學(xué)培養(yǎng)基是已知量的高純度化學(xué)試劑與蒸餾水配制而成，所含的成分（包括碳水化合物、各種無機(jī)鹽、維生素和微量元素等）以及用量均確切可知。對于細(xì)胞代謝組學(xué)而言，往往需要考慮對培養(yǎng)基條件進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得最全面和精準(zhǔn)的代謝輪廓。然而，過度優(yōu)化的培養(yǎng)基條件卻可能造成細(xì)胞生長抑制，對細(xì)胞培養(yǎng)的效果不如天然培養(yǎng)基［12］。復(fù)雜的天然培養(yǎng)基，如牛血清或胎牛血清，含有豐富的細(xì)胞生長必須的營養(yǎng)成分，培養(yǎng)效果好，廣泛用于動物細(xì)胞的體外培養(yǎng)，缺點(diǎn)是成分復(fù)雜，批次間差異大。有研究表明血清類型和批次等的變化均可能導(dǎo)致外源性代謝物的污染和內(nèi)源性細(xì)胞代謝物的改變［12］。因此在進(jìn)行細(xì)胞代謝組學(xué)研究時(shí)，應(yīng)在充分考慮研究目的和細(xì)胞生長特性的前提下選擇合適的培養(yǎng)基，盡可能選擇同一供應(yīng)商來源的產(chǎn)品，同時(shí)盡量避免批次間的誤差，以減少代謝差異。

細(xì)胞密度是可能導(dǎo)致細(xì)胞代謝輪廓改變的另一個(gè)重要因素。培養(yǎng)的不同密度的細(xì)胞可能處于細(xì)胞增殖期或生長停滯期，其代謝物輪廓可能會因此會產(chǎn)生差異。Miccheli等［13］對處于不同細(xì)胞密度的HepG2細(xì)胞進(jìn)行了基于NMR的代謝組學(xué)分析，結(jié)果得到兩種完全不同的代謝譜圖，這證實(shí)了細(xì)胞密度對代謝輪廓的影響。目前，關(guān)于哺乳動物細(xì)胞代謝組學(xué)的多項(xiàng)研究都沒有對細(xì)胞接種密度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)定。一般建議懸浮細(xì)胞的接種密度至少為1×107mL-1，但（2～50）×105mL-1的接種密度也被應(yīng)用［14-15］。不同類型貼壁細(xì)胞的接種密度也表現(xiàn)出多樣化，如HepG2細(xì)胞為0.2×105cm-2、原代人類肝細(xì)胞為1.7×105cm-2以及人類胚胎干細(xì)胞為7×105cm-2等［16-17］，實(shí)際培養(yǎng)中仍需要根據(jù)所用細(xì)胞的生長特性進(jìn)行選擇。此外，研究還指出細(xì)胞傳代數(shù)和表型差異也可能改變細(xì)胞代謝譜，在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)考慮［18］?？傊?，細(xì)胞培養(yǎng)是影響代謝輪廓的重要變量，涉及多方面的因素，實(shí)際操作中應(yīng)盡可能減少差異條件，更好地控制細(xì)胞生長指數(shù)和表型穩(wěn)定性，以保證代謝輪廓結(jié)果的可靠性和真實(shí)性。

1.1.2 細(xì)胞淬滅細(xì)胞淬滅是抑制細(xì)胞內(nèi)酶活性，阻止代謝物變化的關(guān)鍵步驟。由于細(xì)胞代謝活動離不開酶的催化，部分代謝物能夠在毫秒間實(shí)現(xiàn)代謝轉(zhuǎn)化，如三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）為1.5 mmol/s、二 磷 酸 腺 苷（adenosine diphosphate，ADP）為2.0 mmol/s和D-葡萄糖為1.0 mmol/s［18-19］，而代謝組學(xué)僅能反映某一時(shí)刻下機(jī)體的代謝輪廓，因此提取前快速的細(xì)胞淬滅是保證代謝物水平微小變化以及避免偏差性結(jié)果的先決條件［15］。典型的淬滅技術(shù)多基于低溫或酶變性原理進(jìn)行，具體包括液氮淬滅、快速冷凍和添加冷有機(jī)溶劑等［20-21］。對于單獨(dú)分析細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的代謝物而言，淬滅技術(shù)還應(yīng)盡可能保證細(xì)胞膜的完整性，避免胞內(nèi)外代謝物的相互干擾［22］。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，基于冷甲醇的淬滅可能造成胞內(nèi)代謝物的流失，隨著甲醇濃度的降低，代謝物信息損失顯著降低［23-24］。Dietmair等［25］發(fā)現(xiàn)60%甲醇也會破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，而冰冷的0.9%生理鹽水的淬滅則能在保證細(xì)胞膜完整性的同時(shí)，有效阻止ATP等高能物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化。此外，Kapoore等［26］研究指出60%甲醇和4-羥乙基哌嗪乙磺酸等不同緩沖鹽添加劑的組合也是減少細(xì)胞內(nèi)代謝物泄漏的有效淬滅方法。

不同細(xì)胞類型，淬滅方案亦有不同。Kostidis等［22］研究指出，懸浮細(xì)胞中以-40℃提前預(yù)冷的甲醇（含0.85%的碳酸氫銨）作為淬滅溶劑，隨后在-20℃下以1 000 r/min離心1 min，可在保證細(xì)胞膜完整性的前提下，使胞內(nèi)外代謝物充分分離并減少代謝失活。貼壁細(xì)胞則可以先通過低溫快速移取的方法進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)外代謝物的分離（必要時(shí)進(jìn)行離心），隨后用冰冷的磷酸鹽緩沖液或0.9%生理鹽水洗滌，這不僅能夠去除培養(yǎng)皿的殘留，還能有效減緩細(xì)胞的代謝活動，為代謝物的淬滅操作提供時(shí)間［21］。常用技術(shù)中，液氮淬滅被認(rèn)為是簡單、快速和高效的方法，而且液氮的快速處理可對細(xì)胞膜形成即時(shí)的損傷，有利于后續(xù)的代謝物提取［21，27］。除了上述方法外，部分基于熱甲醇、熱乙醇、甲醇-氯仿、酸、堿和熱水等進(jìn)行的細(xì)胞淬滅也取得了一定效果［16］，實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)進(jìn)行選擇及優(yōu)化。

1.1.3 細(xì)胞提取細(xì)胞提取是代謝物充分釋放的過程，有效的提取方法應(yīng)以獲得最全面的代謝輪廓為前提。提取溶劑是決定代謝物提取量的重要因素之一。普遍認(rèn)為以甲醇-水、乙腈-水以及氯仿等有機(jī)溶劑為代表的液-液萃取法是較好的選擇。為此，一些研究在充分考慮并評估代謝物回收率后，認(rèn)為50%乙腈、82%甲醇、90%甲醇-氯仿以及純甲醇等作為提取溶劑的方案可被普遍應(yīng)用［25，28］。此外，對不同目標(biāo)代謝物提取條件的方法優(yōu)化也被廣泛探討，Lorenz等基于超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-QTOF-MS）技術(shù)，分別以乙腈、乙醇、甲醇、70%甲醇和75%甲醇-氯仿混合溶液（9∶1）作為提取溶劑，通過對參與糖酵解和三羧酸循環(huán)的27種代謝物定量分析比較，發(fā)現(xiàn)75%甲醇-氯仿混合溶液的提取可以最大程度上保證代謝物的回收率和穩(wěn)定性［28］。而對于還原型輔酶Ⅱ（NADPH）、ATP等高能代謝物，常規(guī)的淬滅方式難以完全立即終止酶的活性，造成其進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（AMP）等其它代謝物。因此，對這些代謝物的提取，Jang等［20］建議采用有機(jī)溶劑加酸的方法進(jìn)行，其中以乙腈∶甲醇∶水（2∶2∶1）與0.1 mol/L甲酸的混合溶液作為提取溶劑，幾分鐘后加入碳酸氫鹽以中和樣品的方法能夠有效地提取這些代謝物。Dietmair等［25］則通過比較混合標(biāo)準(zhǔn)品中核苷酸（尿嘧啶和腺嘌呤等）、氨基酸（精氨酸和亮氨酸等）和有機(jī)酸（檸檬酸和富馬酸等）等物質(zhì)的代謝回收率，對乙腈、甲醇及甲醇-氯仿等12種常用提取方案進(jìn)行評價(jià)，結(jié)果表明50%乙腈的提取方法可獲得較好的代謝回收率，適用于此類物質(zhì)的提取。除了根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮痛x物的理化性質(zhì)（如極性大小）選用合適溶劑提取外，細(xì)胞的破碎程度也十分重要，如超聲處理、機(jī)械均質(zhì)化和凍融循環(huán)均能有效增強(qiáng)細(xì)胞通透性，實(shí)驗(yàn)中可根據(jù)具體條件進(jìn)行選擇。

溫度是影響代謝物提取產(chǎn)量的另一個(gè)因素，為了避免代謝物的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化降解，有研究建議提取過程應(yīng)盡量保持低于-20℃的低溫環(huán)境，實(shí)驗(yàn)中可通過調(diào)節(jié)提取溶劑的溫度進(jìn)行控制［23］。Kostidis等［21］研究表明，以-80℃的有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，可獲得較全面和重復(fù)性高的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。盡管還有報(bào)道指出，過低的溶劑溫度可能會降低代謝物的溶解度，不利于代謝組學(xué)分析［25］，但-40℃、-20℃及4℃等不同溫度的提取溶劑仍常用［29］。總之，目前尚無針對某一類型細(xì)胞或特定代謝物的標(biāo)準(zhǔn)化提取方法，實(shí)驗(yàn)中仍需要綜合考慮。

1.2 數(shù)據(jù)采集代謝組學(xué)的分析方法要求具有高靈敏度、高通量以及無偏向性等特點(diǎn)，然而生物代謝物的復(fù)雜性，使得這一目標(biāo)往往需要多種分析手段的結(jié)合才能實(shí)現(xiàn)，基于NMR或質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）系統(tǒng)的分析是目前代謝組學(xué)研究中的主要手段。

1.2.1 基于NMR的檢測技術(shù)NMR可用于結(jié)構(gòu)解析和定量，具有快速測定和高度重現(xiàn)性等優(yōu)勢，已被大量用于代謝組學(xué)研究中。NMR檢測對樣品的處理和分析要求較為簡單，基本可實(shí)現(xiàn)樣品的無創(chuàng)性和無偏向性檢測要求，有效地保證了原始代謝信息的完整性和客觀性，尤其以1H-NMR為主的代謝組學(xué)分析被廣泛應(yīng)用，如唐孟秋等利用1H-NMR技術(shù)檢測得到人參煎治療2型糖尿病的代謝標(biāo)志物，包括甘氨酸、α-葡萄糖和β-葡萄糖等血清代謝物以及?；撬岷图∷岬饶蛞捍x物［30］；Zhang等［31］通過1H-NMR測定臨床高尿酸患者的代謝譜，揭示了疾病可能的作用機(jī)制。然而，NMR的主要缺點(diǎn)在于檢測靈敏度和分辨率較低，無法滿足低豐度代謝物的準(zhǔn)確檢測。為此研究人員通過配備超低溫探頭，以提高NMR技術(shù)的靈敏度［32］。同時(shí)，高分辨率魔角旋轉(zhuǎn)（high-resolution magic angle spinning，HR-MAS）及液相色譜-NMR聯(lián)用（liquid chromatography-NMR，LC-NMR）等技術(shù)被用于提高測定分辨率［33］，目前這些技術(shù)也逐漸被用于代謝組學(xué)研究中，例如，Akira等［34］在遺傳性高血壓大鼠中，利用LC-NMR技術(shù)測定到與?；撬峤Y(jié)構(gòu)相似的低豐度琥珀酰?；撬?，這為遺傳性高血壓疾病的探究提供了新的切入點(diǎn)。Gogiashvili等［35］采用HR-MAS技術(shù)為乳腺癌患者的40種代謝物提供了準(zhǔn)確的定性、定量信息。這些技術(shù)的使用有效地?cái)U(kuò)展了以NMR為分析手段的代謝組學(xué)在藥物毒性、基因功能以及臨床疾病診斷等方面的應(yīng)用。

1.2.2 基于MS的檢測技術(shù)MS技術(shù)因具有較高的靈敏度和專屬性被廣泛應(yīng)用，特別是基于分離的MS技術(shù)可通過對樣品進(jìn)行預(yù)先分離，從而提高代謝物的覆蓋率，其中以液質(zhì)聯(lián)用（liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）和氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）最為常用。GCMS因具有高分辨率、高靈敏度、標(biāo)準(zhǔn)的代謝數(shù)據(jù)庫（如NIST、Willey等多種數(shù)據(jù)庫）以及易于定性等優(yōu)點(diǎn)，多用于代謝組學(xué)研究中。如常晉霞等［36］基于GCMS代謝組學(xué)方法，鑒定出多個(gè)與刺五加總苷提取物治療糖尿病密切相關(guān)的代謝物，包括氨基酸、脂肪酸和有機(jī)酸等物質(zhì)。但GC-MS多適用于揮發(fā)性化合物（如甾醇類、醋酸鹽類等）或極性較小化合物的檢測（如短鏈脂肪酸），且檢測樣本多需進(jìn)行衍生化操作，預(yù)處理繁瑣。而LC-MS除具有較高分辨率和靈敏度外，還擁有較寬的動態(tài)檢測范圍，可覆蓋多數(shù)中高極性化合物的分析（如脂質(zhì)、核苷酸、糖類等）。此外，LC-MS分析還能夠有效避免GC-MS中繁雜的樣品前處理，且代謝物數(shù)據(jù)庫信息更為全面而被廣泛應(yīng)用。LC-MS分析中，合適的分離系統(tǒng)是影響代謝物檢測偏向性的重要因素，其中基于反相色譜的預(yù)分離僅適用于極性相對較小的脂質(zhì)、有機(jī)酸等代謝物，而糖類、氨基酸等多數(shù)親水性代謝物則表現(xiàn)出弱保留行為［20］。因此為了獲得更全面的代謝物信息，建議將不同分離性質(zhì)色譜柱的分析結(jié)果相互補(bǔ)充。如Palmer等［35］利用互補(bǔ)的親水色譜柱（hydrophilic interaction chromatography，HILIC）和反相C18色譜柱得到了更為全面代謝物信息。D′Elia等［37］基于HILIC和C18色譜柱的UHPLC-MS技術(shù)，全面評估了與蓖麻毒素中毒密切相關(guān)的代謝標(biāo)志物。此外，二維液相系統(tǒng)的發(fā)展為樣品在反相和親水作用色譜柱的同時(shí)檢測提供了可能。其它的分析技術(shù)，如毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜、傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜以及毛細(xì)管高效液相色譜-質(zhì)譜等多種檢測手段也在不斷探索中。

目前，尚無一種分析技術(shù)能夠達(dá)到代謝組學(xué)分析全面性的要求，為此多種分析平臺的結(jié)合在代謝組學(xué)研究中備受關(guān)注，其可通過信息互補(bǔ)來提高代謝物的覆蓋率。研究已經(jīng)總結(jié)出多種針對哺乳動物細(xì)胞代謝組學(xué)的分析平臺［9］，并對基于NMR和MS技術(shù)的代謝分析特征進(jìn)行了具體的比較［38］，實(shí)驗(yàn)者可根據(jù)研究重點(diǎn)或?qū)嶒?yàn)條件進(jìn)行選擇。

1.3 數(shù)據(jù)分析代謝組學(xué)得到的是大量、多維的數(shù)據(jù)信息，而樣品制備和儀器分析中引入的微小誤差，很可能造成代謝物信息的偏差或缺失［5］。因此，為了準(zhǔn)確挖掘所獲得數(shù)據(jù)中的潛在信息，對原始數(shù)據(jù)矩陣的分析處理十分重要。細(xì)胞代謝組學(xué)研究的數(shù)據(jù)處理包括數(shù)據(jù)歸一化以及基于統(tǒng)計(jì)分析的數(shù)據(jù)挖掘。

1.3.1 數(shù)據(jù)歸一化代謝物的準(zhǔn)確定量關(guān)乎后續(xù)數(shù)據(jù)建模和代謝標(biāo)志物挖掘的可靠性，然而細(xì)胞代謝組學(xué)研究中，細(xì)胞密度和處理?xiàng)l件的微小變化往往造成細(xì)胞的增殖差異，使其難以在同一水平上進(jìn)行代謝物濃度的比較，最終導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏差，因此需要對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理［7，28］。目前，常用的歸一化方法包括細(xì)胞數(shù)量歸一化、蛋白質(zhì)濃度歸一化以及DNA濃度歸一化［9］。不同研究者也對它們的合理性進(jìn)行了比較或考察，如Muschet等［39］開發(fā)了一種基于熒光的DNA定量方法，用于測定代謝組學(xué)樣品中的細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)代謝物（占比約82%～97%）的濃度與細(xì)胞數(shù)量呈線性正相關(guān)，這為細(xì)胞數(shù)量歸一化的合理應(yīng)用提供了依據(jù)。Cao等［28］利用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法對兩種不同細(xì)胞系中存在的11種代謝標(biāo)志物進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些代謝物的信號強(qiáng)度與蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，證明了蛋白濃度歸一化的可行性。Silva等［40］則對細(xì)胞數(shù)量歸一化、蛋白質(zhì)濃度歸一化和DNA濃度歸一化方法進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNA濃度與細(xì)胞接種數(shù)量的相關(guān)性最強(qiáng)，且這種歸一化方法能有效避免成團(tuán)生長的細(xì)胞系難以準(zhǔn)確計(jì)數(shù)和由提取溶劑可能引起的蛋白質(zhì)回收率差等問題，更適用于貼壁細(xì)胞數(shù)據(jù)的歸一化處理。Abdel等［41］對糖酵解生物途徑的相關(guān)代謝物進(jìn)行靶向分析，并將三種細(xì)胞系所獲得的數(shù)據(jù)分別進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量和DNA濃度歸一化處理，結(jié)果顯示這兩種歸一化方式的分析結(jié)果無明顯差異。此外，還有研究者在基于GC-MS探究乳腺癌細(xì)胞的代謝輪廓時(shí)，發(fā)現(xiàn)總離子流圖和細(xì)胞數(shù)量歸一化的結(jié)果相似，因此后續(xù)分析可選擇省略細(xì)胞數(shù)量歸一化的步驟［42］。盡管有研究認(rèn)為，在多種歸一化方式中，細(xì)胞數(shù)量歸一化是最常用的方式［6］，但實(shí)驗(yàn)時(shí)仍需根據(jù)不同細(xì)胞系間的差異和操作可行性等問題選擇合適的歸一化方法。

1.3.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析基于NMR和MS的代謝組學(xué)研究都會生成大量數(shù)據(jù)，因此識別其中的重要信息，并將其與生物體的生物特征進(jìn)行關(guān)聯(lián)，進(jìn)而用于了解和發(fā)現(xiàn)生物學(xué)規(guī)律，是代謝組學(xué)研究的重要步驟。代謝組學(xué)常用的多元統(tǒng)計(jì)分析包括無監(jiān)督和有監(jiān)督分析。主成分分析（principal component analysis，PCA）屬于無監(jiān)督模式，可在樣本來源未知的情況下，通過提取擬合能力最大的幾個(gè)主成分，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理。PCA通常在組學(xué)數(shù)據(jù)處理的早期階段進(jìn)行，用于識別樣本大致分類情況并發(fā)現(xiàn)異常值［43］。偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）是有監(jiān)督模式的一種，其在已知樣本分組的前提下，通過建立數(shù)學(xué)模型，達(dá)到提高樣本分類的目的，但是這種模式通常需要使用其它的驗(yàn)證方法來檢驗(yàn)?zāi)Ｐ褪欠癯霈F(xiàn)過擬合情況［44］。在模型檢驗(yàn)符合要求后，可進(jìn)一步結(jié)合變量重要性投影（VIP）、S-plot等各種形式的載荷圖，用于繼續(xù)篩選在樣本分類中有重要貢獻(xiàn)的

差異代謝物。除上述方法外，支持向量機(jī)（SVM）和人工神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)（ANN）等其它統(tǒng)計(jì)方法可進(jìn)一步優(yōu)化樣本分類并提高模型可信度，正逐漸被用于代謝組學(xué)分析中［45-46］。此外，單變量統(tǒng)計(jì)分析P值以及差異變化倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）也被進(jìn)一步結(jié)合，用于尋找各實(shí)驗(yàn)組間具有顯著性變化的代謝標(biāo)志物。盡管大量統(tǒng)計(jì)軟件的出現(xiàn)為代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)分析提供了便利，但這些軟件執(zhí)行背后的算法知識仍需充分考慮，以確保篩選信息的完整性和準(zhǔn)確性。

1.4 代謝標(biāo)志物分析代謝標(biāo)志物的分析是識別關(guān)鍵代謝物，準(zhǔn)確解釋機(jī)體變化的關(guān)鍵步驟。主要包括代謝物的識別和生物解析。

1.4.1 代謝物鑒定代謝標(biāo)志物的準(zhǔn)確鑒定直接影響其潛在生物途徑的準(zhǔn)確性。一些代謝數(shù)據(jù)庫的開發(fā)對于代謝物的識別和生物學(xué)機(jī)理的揭示具有十分重要的作用，具體包括HMDB、METLIN、MetaCyc、Golm Metabolome Database、Lipid Maps、LipidBank、MetaboLights和Metabolomics Workbench等含 豐富代謝物信息的生化數(shù)據(jù)庫以及PubChem、ChemSpider、NIST和MoNA等僅供物質(zhì)鑒定的綜合數(shù)據(jù)庫［29］，具體網(wǎng)址見表2。這些數(shù)據(jù)庫大多含有大量代謝產(chǎn)物的MS/MS圖譜，部分?jǐn)?shù)據(jù)庫還提供了不同儀器和碰撞能量下產(chǎn)生的碎片離子，研究人員可根據(jù)自身情況進(jìn)行匹配。

表2 代謝組學(xué)研究中常用的代謝物鑒定數(shù)據(jù)庫Table 2.Databases for metabolite identification in metabolomics study

1.4.2 生物解析當(dāng)代謝組學(xué)用于醫(yī)學(xué)研究時(shí)，代謝標(biāo)志物一般用作疾病的早期診斷或闡明作用機(jī)制，為了初步判斷代謝物標(biāo)志物診斷相關(guān)疾病的能力，通常需要繪制受試者工作特征曲線（ROC）進(jìn)行評判，并以曲線下面積大于0.7作為具有準(zhǔn)確診斷能力的標(biāo)準(zhǔn)［47］。同時(shí)代謝標(biāo)志物的聚類熱圖可以將其在不同狀態(tài)下的濃度變化進(jìn)行可視化，以進(jìn)一步明確數(shù)據(jù)差異［20］。生物學(xué)意義的闡釋是代謝組學(xué)醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)，為此需要將相關(guān)代謝標(biāo)志物和代謝通路整合分析，HMDB、KEGG（https://www.kegg.jp/）以及MetaboAnalyst（https://www.metaboanalyst.ca/）等在線數(shù)據(jù)庫的開發(fā)為建立它們的生物關(guān)聯(lián)和功能解釋提供了便利，被大量應(yīng)用于代謝組學(xué)研究中［20］。除借助上述生化數(shù)據(jù)庫外，研究者還應(yīng)不斷更新對代謝物生化功能的認(rèn)識，以確保代謝組學(xué)結(jié)果的真實(shí)性。

2 細(xì)胞代謝組學(xué)的藥物研究進(jìn)展

細(xì)胞代謝組學(xué)是通過細(xì)胞層面直觀認(rèn)識生物事件的有力工具，尤其是檢測技術(shù)的不斷進(jìn)步，為識別、量化和了解更多的細(xì)胞代謝物提供了可能。目前細(xì)胞代謝組學(xué)在藥物研究方面的應(yīng)用涉及藥物研發(fā)、活性成分研究以及機(jī)制探究等多個(gè)方面。

2.1 藥物研發(fā)多數(shù)情況下，疾病會導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生代謝變化，而代謝組學(xué)因可以更精確地分析表型差異并提供關(guān)于代謝物生化功能信息的特征，在識別疾病靶標(biāo)，尋找針對性治療藥物方面具有重要作用。例如，Vastag等基于LC-MS技術(shù)對甲型流感（influenza A virus，IAV），1型單純皰疹病毒（herpes simplex virus type-1，HSV-1）人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）感染的細(xì)胞進(jìn)行代謝組學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同病毒的代謝變化具有特異性，其中乙酰神經(jīng)氨酸和脫氧嘧啶可分別作為IAV和HSV-1的治療標(biāo)志物，而HCMV感染的細(xì)胞代謝結(jié)果則表明檸檬酸和N-乙酰天冬氨酸等代謝物可作為病毒治療的潛在靶標(biāo)，這為后續(xù)相關(guān)靶標(biāo)藥物的開發(fā)利用提供了依據(jù)［48］。在腫瘤靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)上，細(xì)胞代謝組學(xué)的研究也在進(jìn)行，如Liu等研究了小檗堿對胰腺癌（pancreatic cancer，PC）的治療能力，初步揭示了小檗堿可通過擾亂PC細(xì)胞的能量代謝，使得腫瘤細(xì)胞的生存和轉(zhuǎn)移能力顯著下降，進(jìn)一步的靶向分析結(jié)果表明檸檬酸在整個(gè)能量代謝途徑中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，可能成為藥物開發(fā)和針對PC治療的新靶點(diǎn)，值得深入研究［49］。陸苑等基于UHPLC QE Orbitrap-MS/MS細(xì)胞代謝組學(xué)技術(shù)，初步探究了銀杏黃酮苷元聯(lián)合阿霉素協(xié)同抗肝癌的作用及機(jī)制，結(jié)果表明兩者合用的協(xié)同抗腫瘤作用，可能與調(diào)控亮氨酸、酪氨酸和精氨酸等多種代謝靶點(diǎn)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的能量供應(yīng)有關(guān)，這為銀杏黃酮苷元在聯(lián)合抗腫瘤方面的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供了可能［6］。而在對不同侵襲性腫瘤細(xì)胞系的研究中，Nomura等發(fā)現(xiàn)多類腫瘤細(xì)胞系中，單?；视秃枯^低而游離脂肪酸的含量較高，這是由于此類細(xì)胞中單酰基甘油脂肪酶的活性較高造成，因此，單?；视椭久缚赡艹蔀榭鼓[瘤靶標(biāo)的新選擇［50-51］，后續(xù)可進(jìn)行相關(guān)藥物的實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 藥物活性成分研究藥物活性成分研究對于明確藥物的作用機(jī)理，制定出合理的用量標(biāo)準(zhǔn)具有指導(dǎo)意義。尤其是中藥成分復(fù)雜，明確其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，是提高中藥療效、穩(wěn)定中藥質(zhì)量、推動中藥現(xiàn)代化進(jìn)程的重要手段。呂經(jīng)緯等基于NMR細(xì)胞代謝組學(xué)結(jié)合分子對接技術(shù)篩選補(bǔ)腎壯骨湯促睪酮合成的活性成分，明確了櫻桃苷、原兒茶酸等14個(gè)化學(xué)成分可作為補(bǔ)腎壯骨湯促睪酮合成潛在活性成分，為此復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了參考［52］。Feng等提出了一種基于靶向細(xì)胞代謝組學(xué)評價(jià)二至丸抗衰老效果并篩選有效提取物的新策略，指出石油醚提取物可能是二至丸抗衰老作用的潛在活性提取物，其作用途徑與三羧酸循環(huán)和糖酵解代謝相關(guān)，這與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［53］。Hao等結(jié)合細(xì)胞代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，表明人參的免疫調(diào)節(jié)作用，可能與人參皂苷Re、人參皂苷Rg1以及山奈酚等活性成分對巨噬細(xì)胞的影響有關(guān)［54］。

2.3 藥物機(jī)制探究作用機(jī)制研究是理解藥物作用效應(yīng)，從而更好地指導(dǎo)臨床合理用藥的重要環(huán)節(jié)，細(xì)胞代謝組學(xué)是在細(xì)胞水平上闡明藥物作用生化途徑的重要技術(shù)之一。梔子豉湯具有神經(jīng)保護(hù)作用，Zhang等以GC-MS細(xì)胞代謝組學(xué)技術(shù)分析出谷氨酸、亮氨酸以及十八烷酸等多種代謝物，證明了梔子豉湯可通過恢復(fù)能量代謝，氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝等生物途徑，發(fā)揮抗氧化和抗凋亡的作用［55］。艾迪注射液和阿霉素聯(lián)合用藥是臨床腫瘤治療的方案之一，Wang等基于UHPLC-MS/MS平臺分析了兩者聯(lián)合抗肝癌的作用效果和機(jī)制，結(jié)果得出包括苯丙氨酸代謝、精氨酸生物合成、三羧酸循環(huán)和嘌呤代謝等7條生物途徑被顯著改變，證明了兩者聯(lián)合可通過平衡氨基酸和能量相關(guān)物質(zhì)的代謝來發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用［56］。Liao等建立了基于UPLC-QTOFMS的細(xì)胞代謝組學(xué)方法，揭示了紅景天苷治療缺氧損傷的機(jī)制可能與維持能量和脂質(zhì)代謝的穩(wěn)態(tài)有關(guān)［57］。Zhang等利用細(xì)胞代謝組學(xué)，研究了丹參對阿爾茨海默病的治療機(jī)制，結(jié)果表明丹參可能通過調(diào)控精氨酸和脯氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、丙氨酸天冬氨酸和谷氨酸代謝、組氨酸代謝、泛酸和輔酶A生物合成、苯丙氨酸酪氨酸和色氨酸生物合成、檸檬酸鹽循環(huán)以及甘油磷脂代謝等生物途徑發(fā)揮治療作用，這為丹參在阿爾茨海默病疾病中的應(yīng)用和進(jìn)一步研究提供了理論依據(jù)［58］。

2.4 藥物安全性評價(jià)毒性研究對于保證藥物安全性至關(guān)重要，細(xì)胞代謝組學(xué)將細(xì)胞模型與系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，通過比較不同狀態(tài)下代謝標(biāo)志物的變化，為藥物毒性研究提供了有利的支撐。Chaudhari等基于1H-NMR技術(shù)，對阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒副作用進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)阿霉素可使正常細(xì)胞對丙酮酸和乙酸鹽的利用率降低并造成甲酸鹽的積累，進(jìn)而導(dǎo)致能量產(chǎn)生不足和線粒體功能障礙，因此這些物質(zhì)的變化可以用來評估阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性［59］。Wu等通過細(xì)胞代謝組學(xué)方法研究了伏立康唑治療真菌干擾時(shí)誘導(dǎo)的肝毒性機(jī)制，結(jié)果表明伏立康唑誘導(dǎo)的肝毒性與氧化應(yīng)激有關(guān)，且在毒性檢測方面，由α-酮戊二酸、乙醇膽酸鹽和β-N-乙酰氨基葡萄糖組成的代謝物組合優(yōu)于常規(guī)肝功能檢查［60］。Luo等使用HepG2細(xì)胞評估了梔子果的肝臟毒性，最終得出了與體內(nèi)模型分析一致的結(jié)果，其中L-精氨酸、L-蛋氨酸、乙醇膽酸鹽、5，6-二氫尿嘧啶、黃嘌呤和胸苷因其在體內(nèi)和體外肝損傷模型中均有顯著變化，可作為梔子果誘導(dǎo)肝損傷的首選生物標(biāo)志物［61］。

綜上所述，細(xì)胞代謝組學(xué)等高通量測序技術(shù)的發(fā)展，為全面了解與生物系統(tǒng)相關(guān)的生物學(xué)信息提供了可能。除了上述應(yīng)用外，細(xì)胞代謝組學(xué)的研究還涉及細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化、營養(yǎng)學(xué)研究、干細(xì)胞重編程研究以及環(huán)境科學(xué)研究等更多領(lǐng)域［23］。

3 展望

總體而言，細(xì)胞代謝組學(xué)在研究細(xì)胞中低分子量代謝物，進(jìn)而理解代謝物如何影響細(xì)胞行為和功能方面有著重要意義。但作為一門新興發(fā)展的科學(xué)，當(dāng)前細(xì)胞代謝組學(xué)的應(yīng)用仍面臨挑戰(zhàn)。首先，機(jī)體代謝物容易受到各種因素的影響，因此合理的實(shí)驗(yàn)方案對于保證代謝譜的真實(shí)性至關(guān)重要，對于不同類別的細(xì)胞代謝組學(xué)而言，合適細(xì)胞系的選擇和標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞處理方案仍有待探索。其次，由于代謝物化學(xué)成分的異質(zhì)性和現(xiàn)有分析儀器的特定局限性，全面代謝譜的獲得仍需以多種分析平臺的結(jié)合使用為前提。由于標(biāo)準(zhǔn)化合物不易獲得且缺乏標(biāo)準(zhǔn)的可通用代謝數(shù)據(jù)庫，生物標(biāo)志物的識別鑒定也是代謝組學(xué)研究的難點(diǎn)之一，功能完善的代謝物數(shù)據(jù)庫仍有待開發(fā)。再者，低豐度代謝物的檢測和大量組學(xué)數(shù)據(jù)的正確分析是保證全面代謝譜，挖掘特異性生物標(biāo)志物的前提，這對儀器的性能（如靈敏度和分辨率）和數(shù)據(jù)處理方法提出了更高的要求，值得關(guān)注。此外，細(xì)胞代謝組學(xué)和其它技術(shù)方法的有效整合（如與其它組學(xué)的整合以及體內(nèi)動物模型的整合等）有助于理解復(fù)雜生物問題，也是需要研究的方向。總之，細(xì)胞代謝組學(xué)為生物學(xué)研究提供了非常有價(jià)值的信息，隨著技術(shù)的不斷完善和應(yīng)用領(lǐng)域的不斷擴(kuò)展，其前景必將十分廣闊。